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Article de méthode

Expression transitoire de protéines par hydrodynamique Gene livraison chez la souris

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DOI :

10.3791/51481

⸱

5 mai 2014

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

Dans cet article

Résumé

Dans la transfection in vivo d'ADN nu par la délivrance de gènes hydrodynamique introduit les gènes dans le tissu d'un animal avec une réponse inflammatoire minime. Des quantités suffisantes de produit du gène sont générées de telle sorte que la fonction des gènes et de la réglementation ainsi que la structure et la fonction des protéines peuvent être analysées.

Résumé

L'expression efficace de transgènes in vivo est d'une importance critique pour l'étude de la fonction génique et le développement de traitements pour des maladies. Au cours des dernières années, la livraison de gène hydrodynamique (DHG) a émergé comme une méthode simple, rapide, sûr et efficace pour fournir des transgènes dans les rongeurs. Cette technique repose sur la force générée par l'injection rapide d'un grand volume de solution physiologique pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires des organes perfusés et ainsi délivrer de l'ADN dans les cellules. L'un des principaux avantages de HGD est la possibilité d'introduire des transgènes dans des cellules de mammifère en utilisant l'ADN plasmidique nu (ADNp). L'introduction d'un gène exogène en utilisant un plasmide est peu laborieux, très efficace et, contrairement aux transporteurs virales, remarquablement sûr. HGD a été initialement utilisé pour délivrer des gènes dans des souris, il est maintenant utilisé pour délivrer une large gamme de substances, y compris des oligonucleotides, des chromosomes artificiels, des ARN, des protéines et de petites molécules dans des souris, des ratset, à un degré limité, d'autres animaux. Ce protocole décrit HGD chez la souris et se concentre sur trois aspects clés de la méthode qui sont essentiels à l'exécution de la procédure avec succès: une bonne insertion de l'aiguille dans la veine, le volume d'injection et la rapidité de livraison. Des exemples sont donnés pour montrer l'application de cette méthode pour l'expression transitoire de deux gènes qui codent pour des protéines sécrétées, des primates-spécifique, l'apolipoprotéine LI (apoL-I) et la protéine apparentée à l'haptoglobine (HPR).

Introduction

Depuis sa première description par Liu et al. Et Zhang et al., La livraison de gène hydrodynamique (DHG) est devenu un outil précieux pour étudier la fonction des gènes dans des systèmes modèles de rongeurs 1, 2. La technique implique l'injection rapide (7.5 sec) d'un volume important (12.8% de poids corporel) de la solution dans la veine caudale de souris afin de faciliter l'absorption de l'ADN plasmidique par des cellules d'organes cibles 1, 2. Ces conditions conduisent à l'expression des gènes dans le foie robuste et moins l'expression du gène dans le rein, la rate, les poumons et le cœur.

Injection de 10 pg pCMV-LacZ plasmide peut transfecter autant que 40% des hépatocytes, ce qui HGD non-virale, la méthode la plus efficace, in vivo livraison de gène à la date 1. Contrairement transporteurs virales, pDNA est facile à préparer, ne provoque pas une réponse immunitaire chez l'hôte rongeur 3 et ne pose pas de risque pour la santé par se recombiner avec finvirus exogène. En outre, puisque les molécules d'ADN fournis par HGD n'ont pas besoin de l'emballage, cette méthode est adaptée pour la livraison de chromosomes artificiels de bactéries (BAC) aussi grandes que 150 ko 4. D'autres types de molécules qui ont été délivrés par un procédé hydrodynamique comprennent l'ARN de 5 à 10, 11 morpholinos, des protéines de 12, 13 et d'autres petites molécules 12, 14. Les avantages et les inconvénients de HGD sur les autres méthodes de livraison ont été abordés dans d'excellentes critiques dans la littérature 15-20 et un certain nombre d'auteurs ont fourni une description détaillée de la procédure 21-23.

L'introduction de transgènes dans des souris par le MH est sûr et efficace 1-3, 24 et le procédé a été utilisé avec succès chez des rats comparable 25. Avec certaines modifications, des expériences de validation de concept ont été réalisées chez les poulets, 26 rables bits 27 et 28 porcs, bien que, l'application in vivo de cette technique dans les plus grands animaux reste un défi. Lorsqu'on utilise ce procédé, une autre limitation commune est que la plupart des vecteurs d'expression mammaliens disponibles ne disposent pas des composants pour atteindre une persistante, le niveau élevé de l'expression génique. L'utilisation d'un plasmide, l'expression du gène pCMV-Luc dans les organes cibles est évident dès dix minutes après HGD, toutefois, le niveau d'expression initial, haute diminue fortement dans la première semaine après l'injection 1. L'expression du transgène à long terme est possible selon le promoteur et l'intron utilisés dans la conception de plasmide 3, 24 injections Toutefois, le maintien de l'expression du gène de haut niveau nécessite souvent répété. Pour cette raison, HGD peut-être moins approprié pour étudier les maladies chroniques qui sont le résultat de l'exposition à long terme à des protéines nuisibles ou des produits protéiques. Avec ces limitations, HGD est un outil extrêmement puissant pour étudier la potiel rôle d'un gène et l'effet de celle des mutants in vivo, ainsi que les effets thérapeutiques et la régulation des protéines et pour établir des modèles animaux de la maladie (pour revue, voir 15). Par exemple, HGD peut être utilisée pour affecter la fonction des domaines et des acides aminés des protéines en introduisant individuellement différentes constructions de gènes dans les souris qui ont les gènes respectifs assommé. En outre, cette technique peut être utilisée dans n'importe quelle souche de souris.

Ce protocole décrit HGD chez la souris avec un accent sur les aspects techniques nécessaires à la réalisation transfection réussie: insertion correcte de l'aiguille dans la veine, le volume d'injection et la rapidité de livraison. L'application de cette méthode est démontrée dans un modèle de souris de la trypanosomiase africaine, une maladie mortelle de l'homme et de l'élevage 29, 30. Bien que plusieurs espèces de trypanosomes causent la maladie chez le bétail, la plupart ne peuvent pas provoquer la maladie chez l'homme due à des complexes immuns innés en blood appelées facteurs lytiques des trypanosomes (TLF) 29, 31, 32. Ces, lipoprotéines de haute densité formation de pores (HDL) contiennent deux protéines, les primates spécifique uniques:. HPR, le ligand de, ce qui facilite l'absorption de TLF dans les trypanosomes, et PALO-I, le composant lytique 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense est capable d'infecter les êtres humains en raison de l'expression d'une protéine associée à la résistance de sérum (SRA) qui se lie à et neutralise apoL-I humain 34, 39. Baboon TLF n'est pas neutralisé par SRA en raison de sa divergent protéine PALO-I 40. Comme indiqué précédemment, en utilisant un vecteur d'expression de mammifère (pRG977), l'expression transgénique de babouin composants TLF chez la souris confère une protection contre les trypanosomes humains-infectieux 40. Les données représentatives présentées ici montrent comment la délivrance de gènes hydrodynamique peut être appliquée pour étudier les effets thérapeutiques d'une protéine.

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Protocole

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de Hunter College, City University de New York.

Une. Préparation d'ADN plasmidique sans endotoxine

  1. Choisir une colonie unique de bactéries contenant le gène d'intérêt dans un vecteur d'expression de mammifère à partir d'une plaque sélective fraîchement striée.
  2. Suivez les recommandations contenues dans le manuel d'un kit de purification de plasmide disponible dans le commerce sans endotoxine des bactéries croissance et la récolte.
  3. Purifier le plasmide ADN libre à l'endotoxine à partir de cellules bactériennes en suivant le protocole du kit de purification de plasmide exempt d'endotoxine disponibles dans le commerce.
  4. Utilisez les articles en plastique sans endotoxine et manipuler l'ADN avec soin pour s'assurer que l'endotoxine n'est pas réintroduite dans l'échantillon d'ADN après l'étape d'élimination.
  5. Mesurer la concentration de l'ADN plasmidique exempt d'endotoxine par la détermination de son absorbance à 260 nm en utilisant un micro volume spectrophotomètre UV telle que décrite ci-dessous ou à une norme, spectrophotomètre base cuvette.
    1. Nettoyer les surfaces optiques inférieures et supérieures du système de retenue d'échantillon du spectrophotomètre micro comme suit. 1 ul d'eau désionisée propre sur le système optique inférieur. Fermez le bras de levier et appuyez dessus à quelques reprises pour baigner le système optique supérieure, alors levier d'ouverture et essuyer avec un tissu.
    2. Ouvrez le logiciel de micro spectrophotomètre et sélectionner le module d'acides nucléiques.
    3. Placez 1 pi d'eau déminéralisée propre sur le système optique inférieur, le bras de levier et sélectionnez "initialiser" à partir du logiciel de programme. Une fois l'initialisation surfaces complètes, propres à la fois optiques avec un tissu ..
    4. Effectuer mesure à blanc en chargeant 1 pl de tampon TE exempt d'endotoxine (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA) et en sélectionnant "vide" à partir du logiciel de programme. Une fois la mesure vide est fait, nettoyer les surfaces optiques à la fois avec untissu.
    5. Effectuer une mesure de l'échantillon en chargeant 1 ul de l'échantillon et en sélectionnant l'ADN exempt d'endotoxine "mesure" à partir du logiciel de programme. On enregistre la concentration de l'ADN. Évaluer la pureté de l'ADN par l'enregistrement du rapport d'absorbance 260/280 nm qui apparaît sur l'écran. Etant donné que l'utilisation d'ADN pur (260/280 du rapport de 1,8) pour le MH est hautement souhaitable, éviter d'utiliser un échantillon d'ADN avec un rapport de 260/280 en dessous de 1,7. Une fois la mesure terminée, nettoyer les deux surfaces optiques avec un tissu.

2. Pesée de souris

  1. Mark souris dans un approprié de manière à la souche. Remarque: le marquage de la queue n'est pas recommandé pour cette procédure.
    1. Espèces de souris Marquer ayant fourrure blanche (par exemple Swiss Webster) sur le dos avec un marqueur noir. Réappliquer marques au fil du temps si nécessaire.
    2. Espèces Mark souris qui ont une fourrure noire (par exemple C57BL / 6) à l'oreille poinçonnage plusieurs jours à l'avance.
  2. Peser souris individually en les plaçant dans un plateau de pesée des animaux ou seau doucement placé sur une balance de laboratoire numérique. Noter le poids de chaque souris utilisée dans l'expérience, le jour de l'expérience.

3. Préparation des seringues

  1. Préparation du mélange d'injection
    1. Calcul de la quantité d'ADN nécessaire en supposant 5-50 ug d'ADN plasmidique exempt d'endotoxine pour l'injection de chaque souris.
      1. Déterminer la quantité optimale d'ADN de plasmide expérimentalement.
      2. Lors de la détermination de la quantité d'ADN nécessaire, assumer injection d'une souris supplémentaire par groupe, comme le chargement correct des seringues, il faudra un certain mélange d'injection supplémentaire. Pour aider les calculs, prenons l'exemple suivant: injecter 4 souris expérimentales et 4 contrôle, chaque 25 g pesage, avec 50 ug d'ADN plasmidique par la souris. Pour déterminer la quantité d'ADN nécessaire dans ce cas, calculer avec 5 souris par groupe: 5 x 50 pg = 250 pg d'ADN nécessaires pour chaque groupe.
    2. Déterminer la quantité de solution saline (chlorure de sodium à 0,9%) nécessaire en supposant 10% de poids de corps pour l'injection de chaque souris.
      1. Selon l'exemple ci-dessus, chaque injection de 25 g de souris avec 50 ug d'ADN plasmidique dans 2,5 ml de solution saline (2,5 g de liquide).
      2. Pour déterminer la quantité de solution saline nécessaire pour tout un groupe de souris, supposons injection d'une souris supplémentaire par groupe pour permettre le chargement correct des seringues. Compte tenu de l'expérience donnée, calculer la quantité de solution saline nécessaire pour 5 souris dans chaque groupe: 5 x 2,5 ml = 12,5 ml de solution saline pour chaque groupe (ou 25 ml au total). Remarque: si des souris d'un même groupe ne sont pas le même poids (différence de plus de 10% du poids corporel), à préparer l'injection se mélange séparément.
    3. Utiliser, une solution saline stérile sans conservateur et sans endotoxine qui a été approuvé pour l'usage humain, en 10 ml, des flacons à usage multiple.
    4. En utilisant une aiguille de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm) fixé à un embout de type luer-lock d'une seringue de 20 ml,retirer le liquide à partir de flacons de sérum physiologique et de vider la seringue dans un tube conique de 50 ml. Pour aider pipetage précise de solution saline au cours de la préparation des mélanges d'injection ADN-solution saline, une solution saline recueillir plus que nécessaire pour l'injection de toutes les souris dans l'expérience. Pour l'expérience ci-dessus, retirer saline de 3, flacons de 10 ml (soit un total d'environ 30 ml), même si le montant calculé de solution saline nécessaire pour l'expérience est à seulement 25 ml.
    5. Introduire à la pipette la quantité calculée d'ADN dans un tube conique de 50 ml différente. Prenez soin de ne pas toucher le côté du tube avec le corps de la pipette pour éviter l'introduction de l'endotoxine. Selon l'exemple, pipeter 250 ug de contrôle et 250 pg d'ADN de plasmide expérimentale dans des tubes coniques distinctes.
    6. Ajouter la quantité nécessaire de solution saline à l'ADN en utilisant une pipette sérologique. Compte tenu de l'expérience de l'échantillon, la pipette 12,5 ml de sérum physiologique à chacun des mélanges maîtres (expérimental et de contrôle).
    7. Autoriser toutes les solutions pour atteindrela température ambiante avant l'injection.
  2. Préparation des seringues
    1. Pour chaque souris, remplir un, 3 ml, de Luer-Lok seringue stérile avec la composition de l'ADN en utilisant une solution saline, une aiguille stérile de calibre 20 (0,9 mm x 25 mm). Prenez soin d'éviter les bulles d'air. Évitez d'utiliser des seringues de volume plus élevé que le taux d'injection de flux ne peut pas être contrôlée très bien, et il est difficile de manipuler les grandes seringues dans une main. Éjecter tout ADN-saline mélange en excès dans le tube conique, comme cela peut être réutilisé.
    2. Mettez l'aiguille, une aiguille stérile de calibre 27. Remplissez l'aiguille avec le liquide complètement sans introduire de bulles d'air. Ajuster le volume du mélange d'ADN-une solution saline telle que calculée sur la base du poids de la souris.
    3. Ne pas laisser l'aiguille non plafonné de toucher n'importe quelle surface non stérile. Si nécessaire, les aiguilles peuvent être re-plafonnés en utilisant la technique d'une seule main: placer le bouchon sur une surface plane, insérer l'aiguille sans avoir à tenir le cap avec l'autre main et appuyez sur l'aiguille plafonnéecontre un objet dur pour fixer le capuchon sur l'aiguille. Les seringues sont maintenant prêts pour les injections de queue veineuse.

4. Livraison d'ADN hydrodynamique

  1. A noter que les souris anesthésiants peuvent réduire la viabilité. Évitez d'effectuer des DHG dans une salle qui est trop froid, car cela permettra également de réduire la viabilité. Si la pièce a une température ambiante de 20 ° C ou si vous utilisez l'anesthésie, placez la souris sur un coussin chauffant à 37 ° C procédure de poste pour éviter la perte de tous les animaux. Si vous utilisez l'anesthésie, veiller à ce que la bouche et le nez de la souris sont alors dégagée sur la garniture de la chaleur et d'observer la souris jusqu'à ce qu'il récupère entièrement. Ne pas retenir la nourriture ou de l'eau de la souris avant HGD.
  2. Réchauffer les souris à dilater les vaisseaux sanguins.
    1. Placer la cage de la souris (avec literie incluse) sur un tapis de chaleur pendant 5 minutes pour que la température de la litière est d'environ 38 à 39 ° C. La température doit être suffisamment bas pour maintenir les souris sur le tapis de la chaleur pour unpériode prolongée.
    2. Sinon, placez la souris dans un dispositif de retenue d'accès dorsal avec retenue minimale. Réchauffez la queue de la souris pendant 1 min en maintenant doucement avec un morceau de gaze humidifiée à l'eau tiède. Laisser la souris pour repositionner, si nécessaire. Essuyez la queue avec un mouchoir pour sécher.
    3. En variante, souris chaude en plaçant la cage sous une lampe chauffante pendant pas plus de 2 min. Si vous utilisez une lampe de chaleur, faire preuve de prudence pour éviter la surchauffe de la souris.
  3. Injection veine de la queue de grand volume
    1. Immobiliser un accès de contention dorsale sur une surface plane par un ruban de laboratoire.
    2. Tenant par la queue, placez la souris doucement dans le dispositif de retenue et insérer la fiche. Utilisez le moins de retenue que nécessaire pour que la queue immobilisée. Assurez-vous que la souris respire librement.
    3. Si la souris est en détresse à tout moment de la procédure, retirez la souris du dispositif de retenue immédiatement et laisser reposer.
    4. Placez la souris pourl'une des veines caudales latérale est visible. Repérez les veines caudales latérales par la recherche vers le bas à l'arrière de la souris: la ligne rouge qui dans le milieu de la queue est une artère, tandis que les lignes bleues de chaque côté de la queue sont les veines caudales latérales.
    5. Essuyez la queue de la souris à fond avec un tampon imbibé d'alcool.
    6. Avec la main non injectables, tenir la queue bien entre l'index et le majeur ainsi que la queue passe sous l'index, sur le milieu et troisième doigts et sous le petit doigt. Laisser le pouce reste libre de se déplacer. (Figure 1A)
    7. De l'autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d'alcool. Laisser la surface de sécher.
    8. Prenez la seringue chargé de l'injection à la main et en le tenant par le canon entre le pouce et les quatre autres chiffres. Ne tenez pas sur le piston.
    9. Placer la seringue parallèlement à la queue avec le pointage de l'aiguille en direction du corps de la souris etle biseau (arête oblique) de l'aiguille vers le haut.
    10. Insérez l'aiguille dans la veine de la queue. Procéder à l'injection que si la veine est correctement placé, ce qui est évident à partir de l'aiguille coulissant dans aucune résistance. Notez que la profondeur d'insertion de l'aiguille est une question de préférence personnelle cependant, l'insertion complète n'est pas recommandée en raison du risque accru de cisaillement de la veine. Évitez de déplacer l'aiguille.
    11. Avec le pouce de la main de la queue-tenant, fermer sur le moyeu de l'aiguille et appuyez sur moyeu contre la queue pour maintenir l'aiguille en position. Ne pas appliquer de pression extrême et ne tient pas sur l'arbre de l'aiguille, car ceux-ci entraver l'écoulement du liquide dans la veine. Tenez la queue avec l'index de façon lâche à ce point afin de ne pas entraver l'injection (figure 1A).
    12. Re-positionner la main une seringue de telle façon que l'index et le majeur tiennent sur ​​la bride et le pouce est à l'extrémité du piston (Figure 1A).
    13. Appuyez sur le piston en un, un mouvement continu et injecter la totalité du volume de liquide dans 6-8 sec.
    14. Retirez l'aiguille de la veine et arrêter le saignement en appliquant une légère pression sur la queue avec un mouchoir.
    15. Retirez la souris de la contention et le lieu souris dans une cage de récupération placé sur le dessus d'un coussin chauffant (literie devrait être 37-38 ° C). Si la chambre d'injection est froid, cette étape est essentielle pour la survie de la souris. Tenez la queue de la souris jusqu'à ce que le saignement s'arrête complètement.
    16. Observez la souris pendant 1 heure après la livraison de l'ADN hydrodynamique. Une période initiale de halètement et l'immobilité est normal en raison de l'arythmie temporaire causée par HGD mais assurez-vous que la souris montre des signes de reprise dans environ 5 min. Si la respiration de la souris devient extrêmement faible, masser doucement l'abdomen de la souris pour faciliter la respiration. A noter que le taux de recouvrement peut être légèrement influencée par la souche de souris utilisée.
    17. la souris de retourau logement cage et veiller à ce que la souris a une offre abondante de nourriture et d'eau.
  4. Injection veine de la queue de grand volume en utilisant une position de la main de remplacement
    1. Placer la souris dans le dispositif de retenue et se préparer pour injection en suivant les étapes 4.3.1 4.3.5 à travers, comme décrit précédemment.
    2. Reste la main non-injection sur une surface plane avec quatre doigts pliés à un angle de quatre-vingt-degré. Les doigts (tous sauf le pouce) devraient reposer sur le dessus de l'autre, la création d'une plate-forme. Tenez la queue de la souris entre le pouce et le doigt de pointage (figure 1B).
    3. De l'autre main, essuyer la zone à injecter à nouveau avec un tampon imbibé d'alcool. Laisser la surface de sécher.
    4. Prenez la seringue avec l'injection à la main et la tenir par la bride et l'extrémité du piston, prête pour l'injection.
    5. Terminez la procédure en suivant ce protocole de l'étape 4.3.9 à l'étape 4.3.17, comme décrit précédemment.

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Résultats

Le positionnement correct de l'aiguille dans la veine de la queue de la souris (comme illustré à la figure 1) est une condition préalable pour avoir réussi un transgène par transfection à base d'hydrodynamique. Souvent, la partie la plus difficile de la technique, cependant, est le maintien de l'aiguille dans la veine de la queue sans mouvement de sorte que la totalité du volume de l'injection peut être rendu dans un délai de 6-8 s. Les erreurs mineures au cours du processus d'inject...

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Discussion

Quand elle est réalisée correctement, HGD est un moyen remarquablement efficace et sans danger de la livraison du transgène. Les étapes essentielles à la réussite de HGD sont: 1) fournir la bonne quantité d'ADN dans un grand volume d'eau salée véhicule 2) dans la veine de la queue de la souris 3) en moins de 8 secondes.

Bien que le processus d'injection elle-même exige indéniablement une certaine dextérité manuelle, le succès de cette deuxième procédure de six réside souvent dans...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Nous remercions Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) pour d'abord nous enseigner la technique HGD et le Dr Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine) pour son orientation permanente dans divers aspects de la technologie. Ce travail a été financé par Hunter College, CUNY fonds de démarrage et d'attribution NSF pain IOS-1249166. Nous remercions la subvention d'appui NYULMC histopathologie base NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 pour l'histologie sur des foies de souris.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lingette de préparation à l’alcoolWebcol6818
AST kit, Amplite ColorimetricAAT Bioquest13801
Tube conique, 50 mlBD Falcon352070
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
KimWipesKIMTECH34120
Illuminateur de queue de sourisBraintree ScientificMTI RSTOu aiguille équivalente
, 20 Gx 1 (0,9 mm x 25 mm)Aiguille305175
, 27 Gx 1/2 (0,9 mm x 25 mm)BD
pRG977 (vecteur d’expression de mammifère)Accord de transfert de matériel Regeneron Pharmaceuticalsrequis
Chlorure de sodium, 0,9 % INJ USP 10 ml, Hospira  ;Fisher NC9054335
, 3 ml, Luer-Lok TipBD309657Luer Lock nécessaire pour résister à la pression de HGD
BD 305109 Seringue

Références

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