Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

Dorothy P. Schafer; Emily K. Lehrman; Christopher T. Heller; Beth Stevens

doi:10.3791/51482

Article de méthode

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

DOI :

10.3791/51482

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8 juin 2014

Dorothy P. Schafer¹ , Emily K. Lehrman¹ , Christopher T. Heller¹ , Beth Stevens¹

¹Department of Neurology, F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

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Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) avec une grande capacité à phagocyter ou engloutir matériau dans leur environnement extracellulaire. Ici, un test largement applicable, fiable et hautement quantitative pour la visualisation et la mesure de l'engloutissement de la microglie médiation de composants synaptiques est décrite.

Résumé

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La phagocytose est un procédé dans lequel une cellule engloutit matériau (cellule entière, des parties d'une cellule, des débris, etc) dans son environnement extracellulaire environnant et digère ce matériau, généralement par suite, la dégradation lysosomale. Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) dont la fonction phagocytaire a été décrit dans une large gamme de conditions de maladie neuro-dégénérative (par exemple, la clairance de la bêta-amyloïde dans la maladie d'Alzheimer) pour le développement du cerveau en bonne santé (par exemple, synaptique élagage) ^1-6. Le protocole suivant est un test de l'engloutissement développé de visualiser et de quantifier l'engloutissement de la microglie médiation d'entrées synaptiques dans le développement du système de retinogeniculate de la souris ^7. Bien que cet essai a été utilisé pour évaluer la fonction de la microglie dans ce contexte particulier, une approche similaire peut être utilisée pour évaluer d'autres phagocytes dans l'ensemble du cerveau (par exemple, les astrocytes) et le reste du corps(par exemple, les macrophages périphériques) ainsi que d'autres contextes dans lesquels remodelage synaptique se produit (par exemple, une lésion cérébrale / maladies).

Introduction

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Circuits synaptiques remodeler tout au long de la vie d'un animal. Dans le développement du cerveau, les synapses se forment dans l'excès et doivent subir l'élagage synaptique qui implique l'élimination sélective d'un sous-ensemble de synapses et le maintien et le renforcement de ces synapses qui restent ^8-10. Ce procédé est nécessaire pour réaliser la connectivité caractéristique précise du système nerveux adulte. Chez l'adulte, les synapses peuvent également être en plastique, en particulier dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire. Les corrélats structurels de cette plasticité sont pensés pour inclure l'....

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Protocole

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1. Antérograde étiquetage des RGC présynaptiques Entrées

Remarque: Toutes les expériences impliquant l'utilisation d'animaux ont été examinés et supervisés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel (IACUC) en conformité avec toutes les directives du NIH.

Stériliser champ et instruments.
Anesthésier la souris avec 4 vol% d'isoflurane dans une chambre d'induction plexiglas (ce vol% d'isoflurane fonctionne pour les souris néonatales adulte). Respecter les souris de près pour éviter de trop-anesthésiant. ATTENTION: Éviter l'inhalation d'une évacuation des gaz d'écha....

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Résultats

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Récemment, nous avons utilisé ce test de l'engloutissement de visualiser et de quantifier l'engloutissement de la microglie médiation d'entrées synaptiques dans le système retinogeniculate développement (Figure 1) ^7. CGR de souris hétérozygotes CX3CR1-EGFP ont été tracées avec antérograde CTB-594 et CTB-647 dans les yeux droit et gauche, respectivement. Après ce traçage, la microglie EGFP-positives dans le dLGN ont été imagées. Ces images ont ensuite été surface-rendus pour les mesures de vol.......

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Discussion

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Afin de mesurer avec précision la phagocytose, matériel englouti doit être étiqueté de manière à ce que le chercheur peut visualiser une fois la dégradation lysosomale s'est produite. En outre, l'imagerie haute résolution est nécessaire, suivie par l'utilisation d'un logiciel qui va permettre au chercheur de visualiser le volume de la cellule entière et quantifier son contenu. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode très fiable et quantitative pour mesurer l'engloutissement de phagocyte médiati.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Travail a été soutenu par des subventions de la Fondation de la famille Smith (BS), Dana Foundation (BS), John Scholars Program Merck (BS), NINDS (RO1-NS-07100801, BS), NRSA (F32-NS-066 698; DPS), Nancy Fondation Lurie Marks (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC Imaging Core).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coussin chauffant	Vet Equip, Inc.	965500 ;
Source d’eau chaude pour coussin chauffant	Kent Scientific	TP-700
Stéréomicroscope	DSC Microscope		chirurgical optique Zeiss Opmi -6
Microtome coulissant avec platine de congélation	Leica	SM2010 R
Lame de microtome	Leica	14021607100
Microscope de dissection fluorescent	Nikon	SMZ800 avec Épi-fluorescence Microscope
confocal à disque rotatif	Perkin Elmer	UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µ ; l Seringues étanches au gaz	Hamilton Hamilton	80030	Utilisez une seringue différente pour chaque colorant/traceur de couleur
Aiguilles Hamilton	Hamilton	7803-05, spécifications : émoussée, 1,5
"Toxine cholérique conjuguée à Alexa &bêta ; sous-unité (CTB)	Invitrogen	488 : C22841	Reconstituer dans une solution saline stérile, 80 µ ; l (488), 100 et micro ; l (594), 20 et micro ; l (647)
594 : C22842
647 : C34778
Saline tamponnée au phosphate ;( PBS)	Sigma	P4417-50TAB
Sulfates de néomycine et de polymyxine B et bacitracine Zinc Pommade ophtalmique USP (pommade antibiotique)	Bausch & Lomb	24208-780-55
Aiguille 30,5 G	Becton Dickinson	305106
Ciseaux à ressort	Roboz	RS-5630
Applicateur à embout en coton	Fisher	23-400-125
Paraformaldeyde (PFA)	Microscopie électronique Sciences	15710	Diluer 16 % à 4 % dans PBS. Le paraformaldéhye est toxique, à utiliser dans une hotte et à porter un équipement de protection individuelle.
Outils de dissection &ndash ; ciseaux, pinces, spatule	Petits ciseaux : Fine Science Tools	Petits ciseaux : 14370-22
Grands ciseaux : Roboz	Grands ciseaux : RS-6820
#55 Pinces : Fine Science Tools	#55 pinces : 11255-20
Spatule : Ted Pella, Inc.	Spatule : 13504
Saccharose	Sigma	S8501-5KG	Produire 30 % de saccharose en PBS (poids/vol)
OCT Compound	VWR	25608-930
Weigh boat	USA Scientific	2347-1426
Plaques à 24 puits	BD Biosciences	353047
Phosphate de sodium monobasique	Sigma	S6566-500G	Produire 0,2 M de phosphate de sodium monobasique (PB-A) dans le ddH₂O et 0,2 M de phosphate de sodium dibasique (PB-B) dans le ddH₂O. Pour obtenir 0,1 M PB, mélanger 19 ml de PB-A et 81 ml de PB-B, remplir à 200 ml de ddH₂O
Phosphate de sodium dibasique.	Sigma	S5136-500G
Lamelles, 22 X 50 mm, n° 1.5	VWR	48393 194
Lame de microscope chargée	VWR	48311-703
Vectasheild	Vector Laboratories	H-1200

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
Aguzzi, A., et al. Microglia: scapegoat, saboteur, or something else. Science. 339 (6116), 156-161 (2013).
Tremblay, M. ....

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Mots-clés

Phagocytose microgliale Microscopie confocale Tra age ant rograde Toxine chol rique b ta Cellule ganglionnaire de la r tine lagage synaptique Sectionnement du cerveau Marquage fluorescent

Un enlisement test: Un protocole pour évaluer les interactions entre les neurones du système nerveux central et les phagocytes

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