Contrôle de la fonctionnalité et de morphologie de la vascularisation Recruté par facteurs sécrétés par les cellules tumorales génératrices à croissance rapide

Résumé

Nous décrivons un test de matrigel pour illustrer le potentiel angiogénique d’un ensemble de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses à l’aide de deux modalités d’imagerie complémentaires, l’échographie et l’endomicroscopie. Le matrigel, un gel imitant la matrice extracellulaire (ECM), est utilisé pour introduire chez l’hôte (la souris) des facteurs angiogéniques sécrétés dans le milieu conditionné (C.M.).

Résumé

Le sous-cutanée de matrigel bouchon dosage chez la souris est une méthode de choix pour l'évaluation in vivo de facteurs pro et anti-angiogéniques. Dans ce procédé, les facteurs désirés sont introduits dans le gel de ECM-mimétique à froid liquide qui, après l'injection sous-cutanée, se solidifie pour former un milieu simulant le milieu du cancer. Cette matrice permet la pénétration des cellules hôtes telles que des cellules endotheliales, et donc, la formation de vaisseaux sanguins.

Ici, nous proposons une nouvelle analyse de bouchon de Matrigel modifié, qui peut être exploitée pour illustrer le potentiel angiogénique d'une piscine de facteurs sécrétés par les cellules cancéreuses, par opposition à un élément spécifique (par exemple, le bFGF et le VEGF) ou un agent. La fiche contenant du gel de ECM-synoptique est utilisée pour introduire l'hôte (ce est à dire, souris) avec un pool de facteurs sécrétés au CM de cellules de glioblastome tumorales génératrices à croissance rapide. Nous avons déjà décrit une comparaison approfondie du potentiel angiogénique deU-87 MG glioblastome humain clone et de son dérivé dormant, dans ce modèle de système, montrant l'angiogenèse induite dans les cellules parentales MG U-87. Le CM est préparé en filtrant les médias recueillies à partir de plaques de culture de tissus de confluence des deux lignée cellulaire suivants 48 heures d'incubation. Par conséquent, il ne contient que des facteurs sécrétés par les cellules, sans que les cellules elles-mêmes. On décrit ici est la combinaison de deux techniques d'imagerie, micro-bulles imagerie ultrasonore à contraste amélioré et intravitale endomicroscopie de fibrée-confocale, pour une précision, la caractérisation en temps réel de la mesure, de la morphologie et de la fonctionnalité de nouvellement formés vaisseaux sanguins dans les bouchons.

Introduction

L'essai d'angiogenèse de bouchon de Matrigel a été décrit en premier par Kibbey et al. En 1992, où elle a été utilisée pour évaluer la stimulation de l'angiogenèse par la SIKVAV peptide (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) ^une. Contrairement à d'autres essais in vivo de l'angiogenèse, comme l'angiogenèse de la cornée de souris ou de poulet dosages de membrane chorio, ce dosage est relativement facile à réaliser ^deux. Le gel d'ECM-mimétique injecté peut contenir des cellules pro-angiogénique, ou un des composés anti-angiogènes et / ou facteurs. Lors de l'évaluation de l'activité d'un composé anti-angiogénique, le bouchon contient normalement un mélange de facteur de croissance endothelial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance des fibroblastes (FGF), et la substance anti-angiogénique peut être administré directement dans le bouchon ou systémique ^{3, 4.}

Le gel de ECM-synoptique est injection sous-cutanée où il se solidifie en quelques minutes. Évaluation de recrutement des vaisseaux sanguins dans le bouchon résultant est typically effectuée en mesurant le taux d'hémoglobine à l'intérieur de la prise, par mesure du signal de fluorescence suite à l'injection de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au dextran, par immunocoloration de coupes histologiques de marqueurs spécifiques endothéliales ou de cellules activé par fluorescence (FACS) ^{2,5, 6.} Cependant, cette évaluation ne permet qu'une analyse de point final et n'a pas d'informations sur la fonctionnalité et la morphologie des vaisseaux sanguins. En outre, les mesures de volume de plasma, soit par le taux d'hémoglobine ou de dextran-FITC en utilisant comme indicateur, peut être trompeuse, car la teneur en sang est affectée par la taille des vaisseaux sanguins et l'étendue de mares de sang. Cela est particulièrement important lorsque le système vasculaire recruté est caractérisée par la perméabilité accrue et la rétention (EPR) effet ^7.

Nous vous proposons ici un nouveau plus précise, un procédé pour la visualisation des vaisseaux sanguins recrutés, en combinant les deux techniques d'imagerie complémentaires. Higmicrobulles h résolution ultrasons contraste amélioré (US) combinés avec intravitale fibré-confocale endomicroscopie peut fournir des informations non seulement sur la densité des vaisseaux sanguins, mais aussi sur leur morphologie et leur fonctionnalité. En outre, cette analyse peut être effectuée à plusieurs points dans le temps permettant ainsi le suivi de la cinétique de l'angiogenèse. États-Unis sont une modalité d'imagerie largement utilisé qui possède une haute résolution spatiale pour les vaisseaux sanguins imagerie suivante par voie intraveineuse (iv) injection de microbulles qui restent exclusivement dans le compartiment vasculaire ^8-11. Les microbulles sont microbulles remplies de gaz qui produisent un signal échogène forte lorsqu'il est excité avec une impulsion des États-Unis et servir ainsi comme un bon agent de contraste. Des images 3D de la fiche sont acquises à l'aide du logiciel de système d'imagerie Etats-Unis après la destruction des microbulles. Les images obtenues sont composées de trames d'image avant et après la destruction de microbulles et reflètent la différence d'intensité de la vidéo en couleur. Ces superposéeles images sont affichées automatiquement par le logiciel. Par conséquent, le pour cent de vaisseaux fonctionnels dans le bouchon peut être quantifiée. Haute résolution fibrée endomicroscopie confocale sert de modalité d'imagerie complémentaire en signalant sur les vaisseaux sanguins morphologie. Dans cette méthode minimalement invasive, les images sont acquises suite à l'administration intraveineuse de dextran conjugué au FITC ^12. Le polymère fluorescent teint dans la circulation sanguine et sert comme un «agent de contraste» pour les vaisseaux sanguins morphologie et la circulation sanguine ainsi. En outre, étant donné que le polymère est injecté à une taille de 70 kDa, il ne peut traverser les vaisseaux qui fuient que l'on trouve dans le système vasculaire tumoral. Cela se traduira par du bruit de fond élevé de dextrane marqué au FITC à l'extérieur des vaisseaux sanguins. Par conséquent, endomicroscopie confocale fibrée peut être utilisé pour visualiser les caractéristiques typiques de l'effet EPR dans la tumeur qui fuient agrandies navires, neovasculature-, hautement enchevêtrées, avec des extrémités franches.

Ce modèle de système a été décrilit dans la comparaison du potentiel angiogénique de U-87 MG glioblastome humain clone et son dormant ^13. La vascularisation dans les bouchons a été évalué trois semaines après l'inoculation de gel ECM-synoptique. Il a été montré que la vascularisation à l'intérieur des bouchons contenant CM U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices a été augmenté de façon significative en termes de nombre, la densité et la fonctionnalité, par rapport à la vascularisation à l'intérieur des bouchons contenant CM de cellules tumorales génératrices de dormance. Par conséquent, les auteurs ont pu conclure que CM isolé du U-87 MG croissance rapide des cellules tumorales génératrices contient des niveaux plus élevés de facteurs pro-angiogéniques, par rapport à la CM de cellules tumorales génératrices dormants. Ces facteurs stimulent la formation de vaisseaux sanguins fonctionnels par un effet positif sur toutes les étapes de la cascade angiogénique (par exemple, la prolifération, la germination, la migration et finalement, la formation de structures tubulaires de cellules endothéliales).

Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés et réalisés en conformité avec les normes de l'Université de Tel Aviv Sackler School of Medicine institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC).

1. Préparation conditionné médias

1. Graine 2 x 10 ⁶ cellules U-87 MG dans une plaque de culture de 10 cm dans un volume de 8 ml du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et une solution de pénicilline / streptomycine / nystatine à 1%.
2. Incuber les cellules à 37 ° C; 5% de CO ₂ jusqu'à la réalisation complète de confluence à 48 h.
3. Utiliser une seringue de 10 ml, retirer tout support de la plaque et filtrer à travers un filtre de 0,45 um dans un tube de 15 ml.
4. Sans lavage de la plaque de cellules, ajouter 1 ml de solution de trypsine (0,25%) et incuber.
5. Lorsque toutes les cellules sont décollées, inactiver la trypsine en utilisant au moins 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de FBS et préformer un nombre de cellules.
> Compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un autre dispositif de comptage de cellule et calculer le nombre de cellules selon le procédé de comptage utilisé.
NOTE: Il sera utilisé plus tard afin de normaliser la concentration CM.
6. Transférer le CM à un verre ballon à fond rond et on concentre sous vide poussé évaporateur rotatif. Afin d'accélérer le processus, augmenter la température du bain à 37 ° C, si on le souhaite. Continuez jusqu'à ce que le CM réalise une texture pâteuse.
7. Reprendre le CM de chaque plaque de culture dans 400 ul de solution saline. Lorsque vous utilisez plus d'une plaque, utiliser un volume équivalent. Par exemple, pour deux plaques de culture, utiliser 800 pi. Utilisez chaque plaque pour 4 souris.
8. Afin de comparer différentes lignées cellulaires ou des traitements, ajuster le volume en fonction du rapport de cellule reçue à l'étape 1.6. Par exemple, si une plaque 1.5x contient plus de cellules, ajouter 200 ul de solution saline pour les 400 ul de pré-existants. Ce sera le CM ajusté

title "> 2. ECM-mimétique Gel Plug-inoculation à des souris

1. Avant l'inoculation du gel de ECM-mimétique à des souris, préparer les matériaux suivants:
   1. Les facteurs de croissance réduits gel de ECM-mimétique sans phénol (décongeler une nuit, un jour avant l'expérience, à 4 ° C sur de la glace).
   2. Rasoir électrique.
   3. Kétamine et de xylazine pour anesthésier les souris.
   4. Glacée 1000 conseils ul stériles.
   5. Glacée seringue de 1 ml et 27 g d'aiguilles.
2. Préparer pour chaque souris un tube Eppendorf de 1,5 ml contenant 80 ul ajustés CM et garder sur la glace.
3. Pour chaque tube, ajouter 600 les facteurs de croissance glacées ul gel de ECM-mimétique sans phénol réduite qui a été décongelé nuit à 4 ° C, sur de la glace. Le gel d'ECM-mimétique est liquide à 4 ° C et se solidifie à la température du corps; afin d'éviter le gel de l'ECM-mimétique de se solidifier, utiliser 1000 conseils ul glacées. Mélanger soigneusement tubes sans formation de bulles et de garder sur la glace.
4. Anesthésier vieille six semaines BALB / c souris en utilisant de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée selon le soins institutionnels animale et du comité de l'utilisation, ce est à dire avant le début de l'expérience. Les animaux ont atteint leur bon plan de l'anesthésie quand ils ne répondent plus à un pincement de l'orteil entreprise.
5. Rasez la région abdominale des souris et désinfecter l'aide d'un gommage chirurgicale / alcool.
6. Utiliser une seringue froid 1 ml et une aiguille de 27 G pour injecter le contenu du tube Eppendorf voie sous-cutanée. Effectuer l'injection très lentement pour éviter la formation de bulles. Une fois tout le volume est administré, ne pas éjecter l'aiguille pendant plusieurs minutes, jusqu'à ce que la solidification se produit.

3. Évaluation des ECM-mimétique Gel Branchez vascularisation par ultrasons

NOTE: Cette partie du protocole nécessite la connaissance préalable de fonctionnement d'un système d'imagerie par ultrasons, ou l'assistance d'un technicien agréé.

1. Avant de commencer, avoir la fmatériaux et instruments prêts uite:
   1. Rasoir électrique.
   2. Crème dépilatoire.
   3. Kétamine et de xylazine pour anesthésier les souris.
   4. Microbulles non ciblée.
   5. dispositif d'activation.
   6. Système d'imagerie US, y compris un 55 MHz 708 sonde et une acquisition micromanipulateur 3D.
2. Mesurer la vascularisation dans les bouchons trois semaines après l'inoculation:
   NOTE: Dans le modèle animal U-87 MG-base, trois semaines a été trouvé pour représenter le point de moment idéal pour l'imagerie. Sous différents paramètres, calibrer la cinétique de vascularisation à partir de quelques jours après l'inoculation de bouchons.
   1. Anesthésier les souris à l'aide de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée selon le soins institutionnels animale et du comité de l'utilisation, ce est à dire avant le début de l'expérience. Les animaux ont atteint leur bon plan de l'anesthésie quand ils ne répondent plus à un pincement de l'orteil entreprise.
   2. Raser lesrégion abdominale des souris et traiter avec de la crème dépilatoire.
   3. Fixer les souris passivement sur la scène de la micro-manipulateur.
   4. En utilisant une solution saline contenant 1 ml de seringue et une aiguille 30 G, placer l'aiguille à l'intérieur de la veine caudale, fixer fermement l'aiguille et desserrer la seringue.
   5. Mettre en place pour la session 3D en mode acquisition de l'image de contraste:
      1. Appuyez sur "3D" pour initialiser l'étape du moteur 3D et placer le transducteur dans le milieu de la zone de numérisation souhaitée.
      2. Appuyez sur "3D" et entrez la distance et l'étape format de numérisation, puis appuyez sur "Scan".
      3. Assurez-vous que l'ensemble du bouchon a été balayé dans les données d'image 3D affichées. Si non, ajustez la sonde afin que l'ensemble du bouchon est visible dans l'analyse et répétez l'étape 3.5.2.
      4. Appuyez sur "Contraste" et pousser la compensation de gain de temps (TGC) contrôle vers la gauche pour assombrir l'image.
   6. Activer les microbulles en utilisant un mélangeur flacon qui est designated pour l'activation de microbulles pendant 45 sec.
   7. Mélanger dans un seringue de 1 ml 50 pi de microbulles avec 50 ul de solution saline.
   8. Remplacer la seringue contenant une solution saline-desserré avec une seringue contenant des microbulles activés. Injecter les microbulles dilué dans la veine de la queue des souris, attendre quelques secondes pour que les bulles d'atteindre un état d'équilibre, puis acquérir 3D contraste amélioré ciné boucle de la prise, en utilisant le moteur d'acquisition 3D:
      1. Appuyez sur "3D" et sélectionnez "Scan" pour acquérir des images à contraste renforcé 3D puis appuyez sur "Cine Store" pour enregistrer les données d'image.
      2. Appuyez sur "3D" et cliquez sur "Destroy 3D" pour détruire les microbulles.
      3. Appuyez sur "3D" et sélectionnez "Scan" pour acquérir une boucle ciné post-destruction, puis appuyez sur "Cine Store".
   9. Générer la superposition des trames d'image avant et après l'destruction de microbulles:
      1. Dans la &# 8220; Paramètres de référence "sur le côté gauche de l'écran cliquez sur" Créer de référence ".
      2. Appuyez sur "Study Management" pour ouvrir la boucle ciné pré-acquis de destruction.
      3. Cliquez sur "Processus de Cine" pour générer la superposition de contraste vert, puis cliquez sur "Load Into 3D".
   10. Utilisez le logiciel d'imagerie américain afin de quantifier l'image 3D obtenue pour le volume de sang dans les bouchons:
       1. Appuyez sur "Scan / Freeze» et appuyez sur "Paramètres de mode".
       2. Cliquez sur "Volume" et sélectionnez "parallèle".
       3. Insérer un volume 3D du tissu cible par segmentation d'une série de contours.
       4. Cliquez sur "Terminer" pour terminer la segmentation.
          REMARQUE: Le volume de l'agent de contraste sera affiché sur le côté inférieur gauche de l'écran.
   11. À la fin de la procédure, placez la souris dans un environnement propre et sec et chaud, calme, loin ded'autres animaux. Fournir de la chaleur en utilisant un tampon disponible dans le commerce chirurgicale chauffage ou une lampe à incandescence (50-75 watts), placé 12-14 centimètres de rongeurs. Surveiller souris continuellement jusqu'à ce que le maintien de la posture debout et de marcher normalement.

4. Évaluation des ECM-mimétique Gel Branchez Vasculature Morphologie Utilisation fibrée confocale Endomicroscopie

NOTE: cette partie du protocole est effectuée imagerie US immédiatement après et il nécessite la connaissance préalable de l'exploitation du système d'imagerie confocale fibrée de l'endomicroscopie, ou l'assistance d'un technicien agréé.

1. Avant de commencer, avoir les matériaux et instruments prêts suivants:
   1. outils de chirurgie comme une pince, ciseaux et fils à coudre résorbables.
   2. Dextran-FITC conjugué (70 kDa).
   3. des solutions d'étalonnage (trois tubes contenant chacun peroxyde d'hydrogène, eau ou de solution fluorescente).
   4. Système d'imagerie et d'unsonde appropriée pour l'imagerie des vaisseaux sanguins selon fabricant.
2. Anesthésier les souris à l'aide de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (12 mg / kg).
3. Iv administrer, via la veine caudale, 200 ul de 10 mg / ml de dextrane marqué au FITC.
4. Désinfectez la région abdominale chirurgicale en utilisant un gommage / alcool et appliquer une petite incision d'environ 1 cm de la fiche.
5. Placer la sonde de l'endomicroscopie sur le dessus de la bougie doucement tout en gardant la fiche intacte.
6. Acquisition:
   1. Une fois la sonde est réglée sur la fiche, appuyez sur "Démarrer laser" en utilisant la pédale. La fluorescence devrait être affiché sur l'écran.
   2. Acquérir des films courts (jusqu'à 30 secondes) en appuyant sur «Record» sur l'écran ou 'Select' en utilisant la pédale.
   3. Entre les films, laver la sonde en plaçant la pointe dans un tube contenant de l'eau.
   4. Lorsque vous avez terminé, retirez la sonde et nettoyer l'embout avec un coton-tige.
7. Pour analyser moyenne cinqdiamètre ssel:
   1. Cliquez sur l'icône "Détecter microvaisseaux" dans le panneau supérieur pour ouvrir la fenêtre du module de détection des navires.
   2. Cliquez sur "Préférences" et marquer "le diamètre du vaisseau moyenne" dans la "statistique d'intérêt» et «Afficher les barres de l'histogramme" dans le "Mode d'affichage".
   3. Cliquez sur "Détecter" pour afficher les mesures sélectionnées.
8. Pour analyser l'intensité du signal fluorescent dans les zones adjacentes aux vaisseaux sanguins:
   1. Cliquez sur "Créer un cercle ROI" dans le panneau de gauche et de créer un cercle dans la zone d'intérêt.
   2. Cliquez sur "Calculer histogramme sein ROI" pour calculer les valeurs liées à cette région.

5. Traitement post-procédurale de souris

1. À la fin de chaque procédure d'imagerie, placez la souris dans un environnement propre et sec et chaud, calme, loin des autres animaux. Fournir de la chaleur en utilisant un commerce-uncoussin chauffant chirurgicale vailable ou une lampe à incandescence (50-75 W), placés dans 12-14 loin de rongeurs. Surveiller souris continuellement jusqu'à ce que le maintien de la posture debout et de marcher normalement.
2. Pour une analyse plus approfondie de la vascularisation de bouchons à des points de temps supplémentaires, appliquer les conditions de récupération suivantes:
   1. Suturer la petite incision avec des sutures absorbables.
   2. Donnez une analgésie souris comme la buprénorphine (1 mg / kg par voie sous cutanée), et revenir à des cages individuelles.
   3. Observez tous les animaux pour déterminer si un traitement antalgique est nécessaire et de réévaluer tous les jours pour surveiller et évaluer la détresse.
3. À la fin-point de l'expérience, euthanasier les souris par l'isoflurane appliquant d'abord, suivie par dislocation cervicale.
4. Si l'imagerie supplémentaire sera effectué dans les semaines suivant les étapes initiales d'imagerie, toutes les procédures doivent être aussi stérile que possible. Un gommage de la peau chirurgicale doit être réalisée, wa stérileter et coton stérile conseils devraient être utilisés pour nettoyer la sonde de l'endomicroscopie, et la sonde doivent être désinfectés entre chaque animal en utilisant de l'eau stérile.

Résultats

L'implantation des fiches de gel ECM-mimétique avec CM à partir de la lignée cellulaire de tumeur génératrices angiogénique à croissance rapide U-87 MG, des résultats très étendue dans l'angiogenèse. Ce système vasculaire peut être largement exploré en utilisant deux méthodes d'imagerie complémentaires.

Les microbulles contraste amélioré imagerie US révèle très étendue recrutement des vaisseaux sanguins fonctionnels dans le bouchon en illustrant étendue du flux sanguin à l'intérieur de U-87 ...

Discussion

Combinant les méthodes d'imagerie complémentaires permet l'acquisition d'informations sur la densité des microvaisseaux, la fonctionnalité et la morphologie de différentes composantes de l'angiogenèse. Chargement CM sur les bouchons de gel ECM-synoptique génère un microenvironnement tumoral, qui est séparée des autres populations de cellules, comme les cellules endotheliales, qui sont recrutés et se extravaser dans le bouchon.

En effectuant, en parallèle, des microbulles cont...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Évaporateur rotatif sous vide		--	-
Facteurs de croissance réduits sans phénol Matrigel	BD Bioscience	FAL356231	décongeler pendant la nuit, à 4 ° ; C sur glace
Crème dépilatoire	-	-	--
Vevo2100 Système d’imagerie américain	VisualSonics Inc.	-	Nécessite des connaissances préalables en fonctionnement ou l’assistance d’un technicien agréé
sonde 55 MHz 708	VisualSonics Inc.	-	-
Logiciel d’imagerie Vevo2100	VisualSonics Inc.	-	-
VialMix	DEFINITY Imaging	VMIX-DEFINITY
microbulles	DEFINITY Imaging	DE4	S’activer pendant 45 secondes à l’aide de VialMix avant utilisation
CellVizio (Endomicroscope confocal fibré)	Mauna Kea	Technologies-Nécessite	connaissances préalables en fonctionnement ou l’assistance d’un technicien agréé
Sonde ProFlex MiniO/30	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC labellisé dextran	Sigma-Aldrich	46945-ImageCell
software	Mauna Kea Technologies	-	-
Kit d’étalonnage	Mauna Kea Technologies	-	-
Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)	Gibco Life Tecchnologies	41965-039
Sérum fœtal bovin (FBS)	Biological Industries	04-007-1A
Solution de pénicilline/streptomycine/nystatine	Biological Industries	03-032-1B