Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l'ensemble du montage ovules dans Arabidopsis

Summary

Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.

Abstract

Chez les plantes à fleurs, la transition du destin cellulaire somatique à la reproduction est marquée par la spécification des cellules mères de spores (SMC) dans les organes floraux de la plante adulte. Le SMC femelle (cellule mère de mégaspore, MMC) distingue dans l'ébauche ovule et subit la méiose. Le mégaspore haploïde sélectionné est ensuite soumis à la mitose pour former le gamétophyte femelle multicellulaire, qui donnera naissance aux gamètes, l'ovule et la cellule centrale, avec des cellules accessoires. L'accessibilité limitée de la console MMC, meiocyte et gamétophyte femelle à l'intérieur de l'ovule est techniquement difficile pour cytologique et cytogénétique des analyses au niveau d'une seule cellule. En particulier, immunodétection directe ou indirecte d'épitopes cellulaires ou nucléaires est affaiblie par la faible pénétration des réactifs à l'intérieur de l'imagerie cellulaire végétale et une seule cellule est affermé par le manque de clarté optique dans l'ensemble du montage tissus.

Ainsi, nous avons développé une méthode efficace pour analyser les nucll'organisation de l'oreille et la modification de la chromatine à haute résolution de la cellule unique dans l'ensemble du montage ovules d'Arabidopsis embarqués. Il est basé sur la dissection et l'incorporation d'ovules fixes dans une fine couche de gel d'acrylamide sur une lame de microscope. Les ovules embarqués sont soumis à des traitements chimiques et enzymatiques visant à améliorer la clarté des tissus et de la perméabilité des réactifs d'immunomarquage. Ces traitements préserver organisation, ADN et de protéines épitopes cellulaires et la chromatine. Les échantillons peuvent être utilisés pour différentes analyses cytologiques aval, y compris la chromatine immunocoloration, l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), et la coloration de l'ADN pour l'analyse de l'hétérochromatine. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), l'imagerie à haute résolution, suivie d'une reconstruction 3D permet des mesures quantitatives à seule cellule de résolution.

Introduction

Chez les plantes à fleurs, l'établissement de lignées de reproduction commence par la différenciation des CML, MMC féminine et masculine cellule microspores mère. La MMC se développe à partir d'une cellule nucellaire sous-épidermique à l'extrémité distale de l'ébauche ovule, et la cellule mère des microspores se développe à partir du tissu sporogène dans la loge des anthères, qui sont situés profondément à l'intérieur des organes floraux ^1. SMC subissent une méiose pour produire des spores haploïdes, qui donnent alors lieu à des gamétophytes sur la mitose. Le gamétophyte femelle, ou sac embryonnaire, se compose d'un ovule, une cellu....

Protocol

La procédure est décrite dans le flux de travail dans la figure 1, et la configuration de la dissection et l'incorporation de tissus sont présentés dans la figure 2.

1. Fixation tissulaire

1. Recueillir 20-30 carpelles dans un tube de centrifugeuse contenant fraîchement tampon fixateur BVO sur la glace.
2. Fixer le tissu 30 min en agitant doucement à température ambiante.
3. Faites tourner les tubes contenant les carpelles en fixateur dans une paillasse centrifuger 1 min à 400 x g.
4. Retirez soigneusement le tampon fixateur et ajouter 1 ml de PBT, placer les tubes sur la ....

Results

Nous fournissons un protocole robuste pour la préparation à grande échelle et le traitement des ovules Arabidopsis appropriés pour la coloration cytologique dans l'ensemble du montage. Merci à l'encastrement, les ovules conservent une structure en 3 dimensions (Figure 3). En outre, le traitement des tissus, y compris la clarification optique permet des structures sous-cellulaires d'imagerie à haute résolution. Figure 4 montre coloration de l'ADN dans l'ovule primordia tout mont.......

Discussion

Chez les plantes à fleurs, la lignée reproducteur féminin est entouré de plusieurs couches de cellules, y compris le nucelle et les téguments de l'ovule, ce qui rend la coloration cytologique en tout montage techniquement difficile. Nous présentons ici un protocole efficace permettant à l'élaboration et au traitement d'un grand nombre d'ovules appropriés pour la coloration cytologique comme immunologique, la coloration de l'ADN et l'hybridation fluorescente in situ l'ensemble du mont.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
BVO Tampon de fixation (basé sur32)			2 mM EGTA, pH 7,5, 1 % (v/v) formaldéhyde, 10 % DMSO, 1x PBS, 0,1 % Tween-20
PBT			1x PBS, 0,1 % Tween-20
PBT-F			1x PBT, 2,5 % (v/v) formaldéhyde
30 % acrylamide :bisacrylamide			3 g d’acrylamide, 0,33 g de bisacrylamide, 1x PBS (préparer 10 ml, conserver à 4 ° ; C)
200 ml 5 % d’acrylamide mélange dans du PBS			34 ml 30 % acrylamide :bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (à faire frais à partir de 30 % de stock)
20 % de persulfte			d’ammonium 0,2 g de persulfte d’ammonium, 1 ml d’eau stérile (préparer les aliquotes avec 1 ml et conserver à -20 ° ; C)
		de sodium à 20 %	0,2 g de sulfite de sodium, 1 ml d’eau stérile (préparer des aliquotes avec 1 ml et conserver à -20 ° ; C)
		d’enzymes de paroi cellulaire	0,5 % (p/v) de cellulase, 1 % (p/v) de driselase, 0,5 % (p/v) de pectolyase
Réactifs et matériaux
Formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F1635
DMSO	Sigma	D5879
Tris	Amaresco	0497
Éthanol	Schaurlau	ET00102500
Méthanol	Schaurlau	ME03062500
Xylène	ROTH	4436.1
Cellulase	Sigma	1794
Driselase	Sigma	D8037
pectolyase	Sigma	P5936
Tween-20	Merck	8.22184.0500
EGTA	Sigma	E-4378
acrylamide	Sigma	A-3553
bisacrylamide	Sigma	M2022
persulfate d’ammonium	Sigma	A9164
Sulfite de sodium	Fluka	71988
Anti-triméthyl-histone H3 (Lys4)	Upstate	07-473
Anti-monométhyl-histone H3 (Lys27)	Upstate	07-448
Alexa Fluor 488~chèvre ~anti ~lapin (H+L)	Sonde moléculaire	A11008
ProlongGold	Invitrogen	P36934
Iodure de propidium	Sigma	P4170	toxique
DAPI	Sigma	D9542
ARNASE toxique A	Roche	10109169001
Coplin pot	Huber & CO	10.055
Pince	DUMONT BIOLOGIE
Shaker	Heidolph	543-12310-00-0
Chambre			Une boîte en plastique avec une serviette en papier humide à l’intérieur, un support en plastique est placé dans la boîte pour soutenir les toboggans et garder les toboggans hors de l’eau.
Toboggan Superfrost Plus	Thermo Fisher	J1800AMNZ	Menzel-Glä ; ser
FISH Tag DNA KIt	Invitrogen	F32947
GFP booster	Chromotek