Évaluation des contributions spécifiques aux espèces Vers développement cranio-facial Utilisation chimères caille-canard

Résumé

Cet article décrit une méthode pour générer des embryons chimériques qui sont conçus pour tester les contributions spécifiques à l'espèce de crête neurale et / ou d'autres tissus de développement cranio-facial.

Résumé

La génération d'embryons chimères est une approche généralisée et puissant pour étudier le destin des cellules, des tissus, des interactions et des espèces spécifiques contributions au histologique et le développement morphologique des embryons de vertébrés. En particulier, l'utilisation d'embryons chimériques a établi l'importance de la crête neurale dans la direction de la morphologie spécifique de l'espèce du complexe cranio-facial. La méthode décrite ici utilise deux espèces aviaires, le canard et la caille, remarquablement différente morphologie craniofaciale. Cette méthode facilite grandement l'enquête de la régulation moléculaire et cellulaire de modèle spécifique de l'espèce dans le complexe cranio-facial. Expériences dans caille et canard embryons chimériques ont déjà révélé les interactions de tissus de la crête neurale médiation et les comportements de cellules autonomes qui régulent modèle spécifique de l'espèce dans le squelette cranio-faciale, la musculature, et tégument. La grande diversité des produits dérivés de la crête neurale suggère un potentiel importantpour les applications futures du système chimère caille-canard pour comprendre le développement des vertébrés, la maladie, et de l'évolution.

Introduction

Le squelette facial développe à partir de la croissance et de la fusion de plusieurs processus du visage qui sont composés de la crête neurale et mésodermique mésenchyme entouré par ectodermique et endodermique couches épithéliales ^1-11. Événements morphogénétiques au sein de chaque processus sont régis par des interactions de signalisation distinctes entre le mésenchyme et l'épithélium entourant ^12-16. Les modifications de ces interactions de signalisation et / ou de leurs effecteurs en aval contribuent à phénotypes de la maladie et peuvent aussi être utiles à l'évolution du squelette cranio-facial ^{17, 18.} Par conséquent, élucider le calendrier et la nature des interactions entre les tissus a un grand potentiel pour améliorer notre compréhension de la biologie du développement et de l'évolution du squelette facial.

L'utilisation d'embryons chimères pour étudier les interactions du tissu a une longue histoire dans la biologie du développement. Cette approche a été lancée par Hans Spemann et son laboratoirequi a découvert embryonnaires «organisateurs» par la transplantation de tissus entre les embryons de différentes espèces d'amphibiens. Spemann était un maître des techniques micro-chirurgicales dont la main-compétences ont été complétées par son point d'outils spécialisés, notamment la pipette Spemann. Viktor Hamburger était un étudiant de troisième cycle dans le laboratoire de Hans Spemann à Fribourg durant les années 1920, ce qui est quand les expériences de transplantation originaux qui ont conduit à un prix Nobel de Spemann ont été réalisées. Lorsque Hamburger passé à l'Université de Washington à St. Louis en 1935, il a détaillé le processus de fabrication d'une micropipette Spemann dans son Manuel de l'embryologie expérimentale ^19. Drew Noden était un étudiant de troisième cycle dans le laboratoire de Hamburger à l'Université de Washington jusqu'en 1972. Après avoir déménagé à l'Université du Massachusetts, Amherst, puis à l'Université de Cornell, Noden continué la fabrication et l'utilisation de micropipettes Spemann pour ses greffes chirurgicales impliquant des chimères caille-poulet. &# 160;. Même si un étudiant de troisième cycle, l'un des auteurs (Rich Schneider) formés avec Drew Noden à l'Université Cornell de 1995 à 1998 le protocole suivant pour prendre une micropipette Spemann est basé sur des descriptions écrites par Hamburger et Noden, et comprend les modifications ultérieures apportées par Schneider.

L'utilisation des chimères caille-poulet pour l'étude du développement cranio-facial et surtout pour comprendre les contributions des cellules de la crête neurale a été lancée par Noden et par Le Douarin au début des années 1970, a examiné dans Le Douarin et al ^20. Cette approche a été largement adopté dans de nombreuses études et de nombreux autres chercheurs ^{1, 4, 5, 21-38.} Les taux équivalents de la croissance et de la morphologie de la caille et le poussin font des greffes en leur sein idéal pour l'étude du destin cellulaire et de la lignée de traçage. Toutefois, en raison des similitudes entre les cailles et poussin, changements morphologiques induced par les cellules du donneur sont difficiles à déchiffrer. En revanche, d'autres systèmes chimères aviaires ont inclus canard domestique comme un moyen d'étudier les mécanismes qui font embryons anatomiquement distincts ^39-50. Plus précisément, le système chimère caille-canard offre de multiples avantages pour discerner les effets du donneur sur l'hôte, et vice versa. Tout d'abord, caille et canard embryons sont distinctes en taille et la forme du corps, qui fournit un moyen direct pour explorer-ou donateurs mécanismes de formation de motifs spécifiques de l'hôte par le dosage pour les domaines de différentiels de l'expression des gènes (figures 1 A et B). Deuxièmement, caille et canard embryons ont considérablement différents taux de maturation, avec des cailles d'incubation en 17 jours et le canard à couver en 28 jours. Crête neurale transplanté maintient sa vitesse de maturation intrinsèque à l'intérieur de l'environnement de l'hôte et, par conséquent, l'identification de changements temporels dans l'expression des gènes, des interactions tissulaires, histogénèse et morphogenèse est possible51-57. Enfin, l'anticorps anti-nucléaire caille (Q ¢ PN) permet contributions cellulaires donneur et receveur soient distingués de façon permanente les uns des autres par la reconnaissance d'une protéine qui est exprimée de manière ubiquitaire dans les cellules de caille mais absente des cellules de canard.

Protocole

1. Préparer tungstène Aiguilles

1. Couper une tige de tungstène en deux à l'aide des coupe-fils de telle sorte que la tige ne se déforme pas.
2. Enfiler la tige à travers l'extrémité effilée de 5 3/4 en verre borosilicate pipette Pasteur.
3. Laissant environ 3/4 dans du collage de la tige hors de la vitre, d'adhérer à la tige de l'embout de pipette avec un petit cordon de "adhésif thermofusible" (HMA), qui est le bâton de colle utilisée pour un pistolet à colle. Le HMA devrait être rapidement fondu dans une flamme d'alcool, en prenant soin de ne pas brûler la colle et générer de la fumée noire.
4. En utilisant une paire de forceps, plier l'extrémité de la tige de tungstène (environ 1/4 à partir de l'extrémité du haut) jusqu'à un angle de 45 ° est atteinte.
5. En tenant la pipette Pasteur, déposer environ 1/8 dans la pointe de la tige de tungstène dans la flamme d'un chalumeau au propane. Maintenez la pointe stable et exactement perpendiculaire à la flamme.
6. Retirez l'aiguille de la flamme du moment où un minuscule point orange de tungsdix mouches hors de l'aiguille.

2. Préparer Spemann Pipettes

1. L'utilisation d'un bec Bunsen, chauffer le bout étroit d'une pipette Pasteur que le verre peu au-delà du cône commence à fondre. Retirer du feu et tirez jusqu'à ce que la pointe de la pipette devient étanche. Assurez-vous qu'il reste une partie de la partie conique qui a un diamètre extérieur d'environ 0,7-1,0 mm. Briser la fin bouclé environ 4 cm du cône.
2. Attacher environ 2 pieds (60 cm) du tube en caoutchouc à l'échelle (ouverte) extrémité de la pipette. Souffler sur l'autre extrémité du tube en caoutchouc de sorte que l'air ne puisse passer à travers la partie effilée de la pipette Pasteur.
3. L'utilisation d'un cylindre de propane avec un chalumeau à flamme crayon attaché, chauffer une zone ovale d'un côté de la pipette juste en dessous du début de la conicité. Souffler de l'air très doucement et constamment à travers le tube en caoutchouc avec une petite quantité de pression (environ la quantité de pression nécessaire pour dire le début de la letter "P" au niveau de la conversation). Lorsque le verre devient doux d'un côté et commence à se déformer vers l'extérieur, enlever rapidement la pipette de la flamme et souffler fort et stable à travers le tube de caoutchouc. Cela entraînera la partie chauffée du verre pour former une bulle en forme de saucisse qui peuvent apparaître, ce qui est bien. Si la bulle est trop petite, essayez de fusion et soufflage de nouveau le verre. La fenêtre ouverte finale dans le verre doit être d'environ 0,25 po (6,35 mm) de large par 0,5 in (12,7 mm) de long.
4. L'extrémité conique pointant vers le haut, gratter la bulle dans un conteneur de déchets de verre tout en soufflant doucement à travers le tube pour empêcher des fragments de verre de pénétrer dans la pipette.
5. Utilisation de la flamme de propane, brûler les bords restants de la bulle et le feu-ongles les côtés de la fenêtre ouverte. Prenez soin de ne pas faire fondre l'arbre de la pipette.
6. En utilisant un crayon de pointe de diamant, marquer l'extrémité effilée de la pipette d'environ 1,25 à (30 mm) à partir de la fenêtre et rompre la pointeavec une pince de sorte que l'ouverture de la pipette est coupé proprement (pipettes de rejet avec pointes cassées ou irrégulières).
7. En utilisant des pinces et le bord d'une flamme d'un brûleur à alcool, plier la partie étroite de la pipette 0,375 in (9,5 mm) de la pointe à un angle d'environ 60 ° de sorte que la partie pliée est dans un plan vertical lors de l'ouverture de fenêtre est à la position 01h00 pour un usage droitier et 11h00 pour l'utilisation de la main gauche. Cette étape est mieux réalisée dans un projet sans boîtier.
8. Fire-poli la pointe en utilisant la flamme de l'alcool sous un microscope à dissection. Soyez sûr de ne pas fermer la pointe mais plutôt garder la manche d'ouverture et lisse sans constriction.
9. Couper une à une (25 mm) de morceau de tube en caoutchouc, pulvériser le morceau de tube avec 70% d'éthanol, et de faire glisser le tube sur la tige de la pipette jusqu'à ce que l'ouverture de fenêtre est complètement recouverte. Ceci fonctionne comme le "diaphragme" de la pipette Spemann.
10. Placez une ampoule ml latex de caoutchouc 2au-dessus de la partie inférieure ouverte de la pipette. L'ampoule maintient la pression négative dans la pipette Spemann.
11. Pour pratiquer l'aide d'une pipette Spemann, transférer perles de chromatographie d'environ 100-200 m de diamètre à partir d'un endroit marqué dans un boîte de Pétri à un endroit marqué dans un autre sous un microscope.
12. Pour nettoyer la pipette Spemann, retirez la poire en caoutchouc et le lieu pipette, la pointe vers le bas, dans un bécher de haut bordée de coton ou de la gaze sur le fond et rempli avec de l'eau distillée et verrerie détergent.

3. Stériliser et incuber des oeufs

1. Essuyer les œufs avec 70% d'éthanol et de placer les œufs sur des plateaux d'œufs en plastique.
2. Réglez les oeufs dans un incubateur chauffé à 37,5 ° C et 85-87%.
3. Incuber les oeufs jusqu'à ce qu'ils atteignent HH9.5, environ 26 h pour les cailles et 48 h pour le canard.

4. Fenêtre oeufs

1. Suppression d'un petit morceau de la coque extérieure de la partie supérieure de l'œuf avec une pince, en prenant soin de ne pas percer la coque intérieure membrane.
2. En utilisant une seringue avec une aiguille 18 G par 1 pouce, percez un trou à l'extrémité la plus étroite de l'œuf et de retirer environ 1-2 ml d'albumine.
3. Placez du ruban adhésif transparent sur le trou et ponction marque dans la coque.
4. Couper une «fenêtre» le long de la surface supérieure de l'œuf (par la bande transparente) avec des ciseaux courbes.

5. Visualisez embryons et préparer à la chirurgie

1. Avec une tige de verre, brosser doucement une petite quantité de rouge neutre (0,02 g / ml dans BSS de Hank) sur l'embryon.
2. Couper la membrane vitelline et le tirer sur l'embryon en utilisant une aiguille de tungstène flamme aiguisé.
3. Re-sceller l'œuf en plaçant du ruban adhésif transparent sur la fenêtre.

6. Séparer le tissu du donneur de l'embryon des bailleurs de fonds

1. Retirer le ruban de la fenêtre sur l'œuf de l'embryon donneur.
2. Pour couper le pli neural de l'ectoderme adjacent de l'embryon donneur, faire des fentes sur les deux sides du tube neural, à l'aide d'une aiguille de tungstène flamme aiguisé (fabriqué comme décrit ci-dessus).
3. Ensuite, couper à travers le tube neural au antérieure et postérieure de la greffe niveaux souhaités et séparer le greffage du reste du tube neural.
4. Retirer le pli neural à partir de l'embryon de donneur en utilisant soit une pipette Spemann ou tout autre type de micro-pipette.
5. Ensuite, retirez la bande de la fenêtre sur l'œuf hôte et utiliser la pipette Spemann de placer le donneur de neurones fois aux côtés de l'embryon hôte adjacente à la région du tube neural qui recevra la greffe.

7. Séparer le tissu de l'hôte et de la transplantation du tissu du donneur

1. Séparer le pli neural du tube neural de l'embryon hôte, comme cela se fait avec le donateur. Prendre soin d'enlever un greffon de taille égale que le tissu du donneur.
2. Poussez doucement ce tissu hôte loin de l'embryon.
3. Puis, avec une aiguille de tungstène contondant ou le bout arrondi d'un kmcropipette, se déplacer légèrement le pli neural donneur dans le tube neural d'accueil, le maintien des orientations antéro-postérieur et dorso-ventral appropriés. Assurez-vous que la greffe est niché dans le long des côtés, mais veillez à ne pas pousser ou d'endommager les tissus sous-jacents. Pour aider à garder une trace de la note d'orientation de l'original tout asymétrie dans le tissu du donneur ou coloration différentielle du rouge neutre. Nous avons également photo-document, l'embryon de donneur avec le tissu excisé accompagnant, ainsi que la chimère immédiatement après la chirurgie.
4. Une solution saline stérile doit être ajouté à l'oeuf, si l'embryon hôte montre des signes d'assèchement.
5. Maintenant, soigneusement re-joint et étiqueter l'œuf, et doucement revenir à un incubateur d'humidité élevé (70-80%) où l'embryon chimérique peut se développer jusqu'au stade désiré pour l'analyse.

8. Collection de chimères

1. Soyez sûr de recueillir des embryons chimériques dans fraîchement fixateur de froid Serra et les placer immédiatement sur un rocker à 4 ° C pour une fixation O / N. Cela permettra une détection plus sensible des cellules de caille avec l'anticorps anti-caille.
2. Pour les analyses d'expression génique par RT-qPCR, congeler les embryons directement dans l'azote liquide avant l'extraction de l'ARN.

Résultats

Préalablement à une analyse plus poussée, l'efficacité de la greffe doit être dosé. Pour histologique, l'expression morphologique ou génétique des analyses sur des échantillons de tissu, des cellules de caille doivent être détectés par immunohistochimie en utilisant un anticorps Q ¢ PN tel que décrit ^36. Pour les analyses d'ARN, spécifiques à l'espèce contributions aux tissus d'intérêt peuvent être calculées en utilisant une stratégie basée sur la PCR ^58. Après l'efficacité de la transplantation a été validée, d'autres mesures de résultats morphologiques et moléculaires peuvent être évalués dans des chimères. Les interactions entre les donateurs cellules de la crête neurale et les tissus environnants dérivées de l'hôte qui sous-tendent histogenèse et la morphogenèse du complexe cranio-facial approprié ont déjà été étudiés. En particulier, la crête neurale mésenchyme dirige morphologie spécifique de l'espèce de la face ^{7, 13, 51, 59,} modèle de plume ^52, modèle de muscle ⁵⁶ jusqu'à>, et le cartilage ^{53, 57} à la régulation de l'expression de gènes de l'hôte. Par exemple, la crête neurale mésenchyme dicte quand formes d'os dans la mandibule en régulant le temps Bmp4 expression ^55.

Récemment, des enquêtes ont porté sur les interactions tissulaires survenant très tôt dans le développement cranio-facial. À cet égard, des expériences utilisant des chimères caille-canard ont montré embryons hôtes influencer la migration de la crête neurale par la détermination de limites morphologiques. C'est, dans les embryons chimériques Quck, les cellules de la crête neurale donneur de caille migrent dans l'hôte canard mandibulaire arc dans un modèle de canard comme (figure 1D). Malgré cette contribution hôte à la taille de la population de la crête neurale, le donateur de la crête neurale continue à générer un squelette mandibulaire qui est caille-comme la taille et la forme (figure 1E).

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Figure 1. Quail-Canard système chimérique. (A) Quail et (B) des crânes de canard présentent des différences considérables dans la taille et la forme, et donc, sont idéales pour l'utilisation d'un système chimérique pour étudier le développement cranio-facial (modifié par Tokia et al. ^56). (C) conception expérimentale pour générer unilatérales embryons chimériques Quck de HH9.5 caille stade appariés et d'embryons de canard. Le pli neural est retiré d'un côté d'embryons de caille et transplantées dans des embryons de canard après une pièce équivalente du pli neural a été supprimé. (D) des cellules de caille donateurs (vert) peut être suivie dans des chimères en utilisant un anticorps anti-caille (Q ¢ PN) comme le montre la vue ventrale de HH12 embryon chimérique. (F) En mandibules Quck à HH38, la caille donateurs dérivé Meckel7, s cartilage est plus courte et plus droite que celle observée pour le dérivé de canard hôte controlatéral cartilage de Meckel, qui est plus grande et incurvée. Reproduit Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) avec la permission de Elsevier.

Discussion

La crête neurale est une population de cellules embryonnaires transitoires qui migre intensivement dans tout l'embryon et se différencie en divers types de cellules, y compris les chondrocytes et les ostéoblastes, qui contribuent au squelette cranio-facial. Transplantation crête neurale dans le système chimère caille-canard a grandement contribué à notre compréhension des interactions de tissus et les voies de signalisation qui régulent le développement du squelette cranio-facial. Toutefois, étant donné le vaste potentiel de la crête neurale également générer des cellules musculaires lisses, les adipocytes, les mélanocytes, les cellules de Schwann et les neurones, le système de chimère caille-canard a un énorme potentiel pour de futures applications, en particulier en liaison avec l'évolution rapide de la biologie des cellules souches et la médecine régénérative. Depuis la caille et le canard sont deux espèces élevées dans le commerce, un approvisionnement d'œufs fécondés relativement peu coûteux est disponible à partir d'une variété de fermes. Ainsi, cette technique doit être accessible à rechercsienne opérant dans un large éventail de budgets et de l'espace de l'installation.

Bien que cette technique est très puissant, il reste plusieurs limitations. Comme d'autres techniques chirurgicales, la qualité et la viabilité des chimères caille-canard s'appuient sur les compétences chirurgicales du chercheur, et par conséquent, il n'y aura plus de variation inter-et intra-individuelle entre les expériences que par rapport à d'autres modèles, comme ceux utilisant la souris génétique. En outre, il existe également des variations dans les taux de développement des embryons et les étapes de individuelles qui contribue à la reproductibilité et de la réussite de chaque greffe. Embryons d'oiseaux sont également très sensibles à la déshydratation et donc des étapes cruciales pendant la chirurgie incluent maintenant les niveaux de lumière faible, le temps sous le microscope à un minimum, les œufs scellées avec du ruban adhésif, autant que possible, et une forte humidité dans l'incubateur post-opératoire à éviter la dessiccation.

En termes de viabilité des chimères, usually entre 50-75% survivent, même si ces pourcentages peuvent diminuer plus l'étape de la collecte. Dans une session typique 4-6 heures de chirurgie, un chirurgien expérimenté peut générer 10-15 chimères. Le succès des greffes dépend aussi fortement de la qualité des outils. De bons outils conduisent à plus des résultats cohérents et reproductibles. L'utilisation d'un chalumeau au propane pour faire des aiguilles de tungstène permet aiguilles très pointues à faire. Le type de torche utilisée fait une grande différence, car il contrôle la taille de la flamme. Affûtage électrolytique peut également être utilisé, mais cette approche ne vient même pas proche de la production d'aiguilles pointu. Utiliser des tiges de tungstène au lieu de fil bobiné de telle sorte que les aiguilles peuvent être faites directement.

La micropipette Spemann, tandis que beaucoup de temps et difficile à faire, est un instrument idéal pour le transfert de tissu. La pipette peut être personnalisé avec des ouvertures de différentes tailles, et peut être utilisé à plusieurs reprises. Un facteur critique pour usinga Spemann micropipette est d'avoir un peu de liquide dans la pipette avant de toucher la pointe à la surface de l'embryon. Une partie du fluide aura toujours s'écouler lorsque le contact est établi avec la surface du bain au-dessus de l'embryon. Appuyant sur la membrane permet au tissu fluide et greffe à être éjecté très précisément, alors que peu de laisser sur le diaphragme aspire doucement le greffon tissu du donneur dans la pipette. Le maintien d'un peu de pression positive sur le diaphragme maintient le tissu de greffon du donneur à la pointe de la pipette pendant le transfert, et un peu de pression supplémentaire sur la membrane permet le tissu de greffon du donneur à être délibérément placé dans l'hôte.

Pour la protection de la pipette Spemann pendant le stockage et la stérilisation, retirer l'ampoule de l'extrémité large et soigneusement insérer la pointe conique dans le bulbe. Placez la pipette Spemann dans un tube à essai en verre, couvrir le dessus d'une feuille d'aluminium, et l'autoclave avant la chirurgie. Après plusieurs pipettes sont ready à stériliser à nouveau pour la chirurgie, inverser les pipettes, les chauffer près à ébullition dans la même solution d'eau distillée et verrerie détergent, puis rincer abondamment à l'eau distillée. Pipettes autoclave dans leurs tubes individuels. Le tube en caoutchouc qui forme le diaphragme et la poire en caoutchouc doit être remplacé après plusieurs stérilisations ou quand ils deviennent obscurcie et rigide.

La plupart des composants de ce protocole concernent l'équipement dangereux. Par exemple, la procédure pour faire une Spemann Micropipette implique trois types de flammes ainsi que le chauffage, tirage, soufflage, de pliage, de coupe, de polissage et de verre. Par conséquent, de porter un équipement de protection individuelle (EPI) qui augmente la sécurité tels que des lunettes et une blouse de laboratoire est essentiel. En outre, parce que beaucoup de gens souffrent, ou ont le potentiel de se développer, allergiques aux œufs, utilisez toujours des gants lors de la manipulation des œufs. Avec ces précautions à l'esprit, le système chimère caille-canard isa méthode sûre, efficace et relativement accessible qui a de nombreuses applications futures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x PBS	TEK	TEKZR114
Hank' s BSS sans rouge phénol	Invitrogen	14025-092
Rouge neutre	Sigma Aldrich	N4638-5G	0.22 µ ; m stérilisée par filtre
18 G Aiguilles	BD	305195
seringue de 5 ml	BD	309646
n° 5 Pince Dumont	Fine Science Tools	11252-20
Ciseaux droits	Outils de science fine	14028-10
Ciseaux courbes	Fine Science Tools	14029-10
Pipette		Spemann	à la main en laboratoire
Porte-oeuf Cendrier			en verre et pâte à modeler
Brûleur	à alcool Fisher	04-245-1
Ruban transparent	3M Scotch	600
Tige d’agitation en verre	Fisher	11-380C	La pointe est rétrécie et arrondie à l’aide d’une flamme
Fil de tungston (0,004 x 3 pouces)	A-M Systems	7190	L’embout est aiguisé à la flamme dans un chalumeau au propane
Bunsun Burner	Fisher Scientific	S49117
Pasteur Pipette	Fisherbrand	22-183-632	9 pouces (229 mm)
Tube en caoutchouc	Fisher Scientific	14-178C	ambré, paroi mince en caoutchouc naturel ; épaisseur de la paroi : 0,0625 po/1,6 mm ; Diamètre extérieur : 0,375 po/9,5 mm ; D.I. : Bouteille de carburant au propane de 0,25 po/6,4 mm
	BernzOmatic	UL2317	TX-9 avec torche de style « A » avec une torche « flamme de crayon » en laiton à visser
Crayon à pointe de diamant	Fisher Scientific	22-268912
Ampoules en caoutchouc	Fisherbrand	S32325