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Article de méthode

Nanomanipulation de molécules d'ARN simple par pinces optiques

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DOI :

10.3791/51542

⸱

20 août 2014

 ,  ,  , 
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering, University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute, University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences, University at Albany, State University of New York

Dans cet article

Résumé

Des pinces optiques ont été utilisées pour étudier le repliement de l’ARN en étirant des molécules individuelles à partir de leurs extrémités 5' et 3'. Ici, des procédures courantes sont décrites pour synthétiser des molécules d’ARN pour l’épilation, l’étalonnage de l’instrument et les méthodes de manipulation de molécules uniques.

Résumé

Une grande partie du génome humain est transcrit mais non traduit. Dans cette ère de la génomique de poste, les fonctions de réglementation de l'ARN a été démontré que de plus en plus importante. En fonction de l'ARN est souvent fonction de sa capacité à adopter des structures alternatives, il est difficile de prédire l'ARN structures tridimensionnelles directement à partir de la séquence. Seule molécule approches montrent potentiels pour résoudre le problème de l'ARN polymorphisme structural par le suivi des structures moléculaires d'une molécule à la fois. Ce produit présente une méthode pour manipuler précisément le pliage et la structure de molécules d'ARN simple à l'aide de pinces optiques. Tout d'abord, les méthodes pour synthétiser des molécules convenant à une seule molécule travail mécanique sont décrits. , Diverses procédures d'étalonnage Suivant pour assurer les opérations propres des pinces optiques sont discutées. Ensuite, diverses expériences sont expliquées. Pour démontrer l'utilité de la technique, les résultats d'déroulent mécaniquement épingles à cheveux d'ARN et un ARN simple Kissincomplexe de g sont utilisés comme éléments de preuve. Dans ces exemples, la technique de nano-manipulation a été utilisé pour étudier le pliage de chaque domaine structural, secondaire et tertiaire, y compris, de façon indépendante. Enfin, les limitations et les futures applications du procédé sont discutées.

Introduction

Le développement de la technique des pinces optiques, a longtemps été accompagné de son application dans la recherche biologique. Lorsque l'effet de piégeage optique a été découvert, Arthur Ashkin observé que les bactéries dans l'eau contaminée pourraient être piégés au foyer laser 1. Depuis lors, les bactéries de piégeage est devenu, une expérience amusante involontaire pour des générations d'étudiants de biophysique ainsi que d'un outil de recherche sérieuse pour étudier la physiologie microbienne 2,3. La technique de piégeage optique utilise faisceau laser focalisé à immobiliser un objet microscopique 1. En pratique, le fonctionnement d'un piège à laser comme un ressort optique, qui mesure également la force (F) sur l'objet emprisonné par son déplacement à partir du centre du piège (AX). Dans un court intervalle, F = κ x AX, dans κ est la constante du ressort du piège. Le piège optique peut être utilisé pour exercer une force dans picoNewton (PN) de précision à un microsobjet endoscopique et de mesurer sa position nanomètre (nm) exactitude. Dans les deux dernières décennies, les pinces optiques sont devenus l'une des techniques unique de molécules les plus utilisées en biophysique. La technique a été utilisée pour étudier le pliage et la mécanique de l'ADN 4-6, 7-9 ARN, protéines et 10,11. Pinces optiques ont également été utilisés pour observer la replication de l'ADN 12, 13 transcription de l'ARN, et la synthèse des protéines 14,15, ainsi que de nombreux autres événements biomoléculaires 16-18.

Approches molécule unique sont utilisés dans la recherche de l'ARN structurel principalement à explorer le robuste paysage énergétique de pliage de l'ARN. Une séquence d'ARN peut souvent se replier en plusieurs structures stables et mutuellement exclusifs, en raison des règles simples de composition chimique et à éplucher de base d'ARN. Il est connu depuis longtemps que l'ARN polymorphisme structural, comme cela se produit dans riboswitchs 19,20, joue un rôle important dans la régulation des gènes. A en Eurt sondage de l'ensemble du génome a révélé que les variations de température d'à peine quelques degrés influencent grandement la structure et la synthèse des protéines d'une grande partie du transcriptome cellulaire 21. Cet exemple laisse entendre que le rôle biologique de remplacement pliage de l'ARN est peut-être plus importante et omniprésente que prévu précédemment. Polymorphisme structural, pose cependant un défi pour les approches biochimiques et biophysiques traditionnelles, qui examinent les propriétés moyennes de nombreuses molécules. Par exemple, la "marche" et conformations "off" d'un riboswitch sont mutuellement exclusifs. Une structure moyenne dérivée de structures hétérogènes n'est pas susceptible de ressembler à l'une des conformations biologiquement pertinentes. En outre, l'ARN non traduite de l'ARNm et forment généralement des structures. Leur interaction avec les protéines et les ARN régulateurs nécessite souvent déroulement de la structure existante dans le cadre de l'interaction. Par conséquent, l'étude de l'ARN dépliage / repliage devient pertinentequestion de l'ARN biologie. Pour répondre à un tel défi, l'approche unique molécule a été utilisée pour démêler l'ARN polymorphisme structural par l'étude d'une molécule à la fois 22-27.

Par rapport à la méthode populaire de fluorescence de molécules uniques, pinces base mécanique déroulement offre un avantage que les conformations de molécules individuelles peuvent être manipulés par la force appliquée et être mesurées avec une précision nanométrique. Cette capacité de nanomanipulation peut être utilisé pour surveiller le déploiement / repliement des domaines structuraux individuels tels que le pliage d'un grand hiérarchique ARN peut être 28 disséqué. En variante, un seul brin peut être dirigé pour se plier dans une de plusieurs conformères; ou une structure existante peut être induite mécaniquement à se replier en une conformation différente 29. Dans les conditions biologiques, une structure d'ARN peut être modifié lors d'un changement de température ou la liaison du ligand. La capacité de manipulation directement s moléculairestructure ouvre un nouveau lieu d'ARN étude structurale. En principe, d'autres techniques mécaniques, telles que la microscopie à force atomique et des pinces magnétiques, peuvent également être utilisées pour étudier le pliage de molécules d'ARN simple. Cependant, ces applications sont limitées en grande partie en raison de la relativement faible résolution spatiale 30.

L'emploi de pinces optiques permet structures d'ARN à être déployés par la force mécanique.

L'avantage de mécanique déroulement est plusieurs fois. La force peut être utilisée pour déployer la fois des structures secondaires et tertiaires, alors que les ions métalliques et ligand induit pliage se limitent principalement à des structures tertiaires. Température et dénaturant peuvent affecter de manière significative les activités de l'eau et de solutés. En revanche, force est appliquée localement pour perturber des structures moléculaires; l'effet de la force sur l'environnement est négligeable. En outre, la fusion thermique est le mieux d'étudier la thermodynamique de pliage de petites structures d'ARN,tandis que les pinces optiques ont été utilisées pour étudier les structures d'ARN avec différentes tailles, allant de un à sept paires de bases tétraboucle épingle à cheveux 28 à un ribozyme 31 400 nucleotides. En outre, les structures d'ARN peuvent être dépliés mécaniquement à des températures mésophiles. En revanche, les ARN de se dérouler dans une expérience de fusion thermique, la température est généralement élevée bien au-dessus des températures physiologiques, ce qui augmente considérablement l'hydrolyse de l'ARN, en particulier en présence d'ions Mg 2 +.

Il est important de noter que l'effet mécanique de la force dépend de la façon dont elle est appliquée sur une structure. La force appliquée bascule le paysage énergétique de pliage. Par exemple, lorsqu'une force est appliquée sur une épingle à cheveux, les paires de bases sont brisées de façon séquentielle, un à la fois (figure 1a). La fourche de déchirure progresse en hélice le long de l'axe, qui est perpendiculaire à la force appliquée. En revanche, quand un complexe kissing minimal est sous tension, les deux n'embrassepaires de bases, qui sont parallèles à la force appliquée, la part de la force de charge (figure 1b). Les différentes géométries de l'épingle à cheveux et embrassant complexe par rapport au résultat de la force appliquée à la réponse mécanique différente, qui peut être utilisé pour distinguer pliage secondaire et tertiaire 28,32. L'aspect théorique de la mécanique qui se déroule a déjà été examinée 8,9,30. Ce travail décrit les approches de base pour mettre en place et exécuter un test déroulement mécanique seule molécule.

Configuration expérimentale. Dans notre expérience de traction mécanique, l'échantillon d'ARN est constituée de pinçage de l'ARN d'intérêt flanquée par deux poignées doubles brins d'ADN / ARN (figure 2) 7. L'ensemble de la molécule peut être attaché à deux bourrelets micron de taille à revêtement de surface (Spherotech) via la streptavidine-biotine et les interactions anticorps anti-digoxigénine-digoxigénine, respectivement. Une bille est maintenue par un tr optique de mesure de forceap, tandis que l'autre se tient sur la pointe d'une micropipette. La distance relative entre les billes peut être modifiée soit par le piège de direction ou de déplacement de la micropipette. En utilisant cette approche, une molécule d'ARN simple attacher les billes peut être étiré et relâché.

Préparation des échantillons. La synthèse des échantillons d'ARN pour épilation comprend plusieurs étapes (Figure 3). Tout d'abord, la séquence d'ADN correspondant à l'ARN d'intérêt est d'abord clone dans un vecteur plasmidique. Ensuite, trois réactions de PCR sont réalisées pour produire les deux poignées et une matrice pour la transcription. Le modèle de transcription comprend les régions de la poignée et les séquences insérées. L'ARN de pleine longueur est synthétisé par transcription in vitro. Enfin, l'ARN et les poignées modifiés chimiquement sont recuites ensemble pour produire les molécules pour l'épilation.

Calibrage et le fonctionnement des pincettes. La conception de base de l'utilisation Minitweezersd dans ce travail suit celle des double faisceau pinces optiques 33. Avec de nombreuses améliorations, les Minitweezers affichent une stabilité extraordinaire par rapport aux pinces optiques de première génération. Un certain nombre de groupes de recherche dans plusieurs pays utilisent les Minitweezers dans leur recherche de molécule unique 14,15,34-37. Les détails de la construction, de l'étalonnage et le fonctionnement de l'appareil, y compris des vidéos d'instruction, sont disponibles sur le site Web "pincettes Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Ici, des améliorations et des procédures d'étalonnage qui doivent être effectuées sur des bases quotidiennes sont décrites en détail.

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Protocole

1 Préparation de molécules d'ARN pour une seule molécule Tweezing

  1. Clonage de la séquence d'intérêt. Clonage de la séquence d'ADN correspondant à la structure de l'ARN dans un vecteur.
  2. Synthèse et purification de la matrice de transcription. Synthétiser un modèle de transcription par PCR. [Lieu le tableau 1 ici] Ensuite, purifier les produits de PCR en utilisant un kit de purification PCR, et concentrer l'échantillon à> 200 ng / ul. Étant donné que l'ADN purifié est utilisé pour la transcription, la RNase eau libre doit être utilisé dans l'élution et concentration.
  3. La transcription in vitro. La synthèse d'ARN par transcription in vitro à 37 ° C pendant une nuit afin de maximiser le rendement en ARN. [Lieu le tableau 2 ici] Après transcription, ajouter 1 pl DNase I à digérer la matrice d'ADN pendant 15 min à 37 ° C. On purifie l'ARN en utilisant une colonne de centrifugation de silice.
  4. Synthèse de la poignée biotinylé A. Tout d'abord, produire la poignée non modifié par PCR utilisant des amorces Af et Ar et concEntrate l'ADN amplifié à> 200 ng / ul. Ensuite, incorporer des modifications de la biotine dans le produit de PCR en utilisant une réaction d'extension d'amorce. [Lieu tableau 3 ici] REMARQUE: La poignée biotinylé A (biotine-HA) peut être utilisé directement dans le recuit sans purification. Comme la biotine-HA doit être recuite à ARN, il est essentiel d'utiliser la RNase eau libre dans les deux étapes.
  5. Synthèse de la poignée de la digoxigénine-modifié B. Synthétiser digoxigénine modifié poignée B (dig-HB) par PCR en utilisant une amorce oligo Bf et la digoxigénine modifié Dig-Br (figure 3). Ensuite, purifier le produit de PCR et concentrer l'échantillon à> 200 ng / ul.
  6. ARN de recuit sur les poignées. Recuit de l'ARN avec des poignées. [lieu tableaux 4 et 5 ici]
  7. Purifier l'échantillon recuit. Ajouter 3 volumes d'éthanol de l'échantillon recuit et bien mélanger. Stocker le mélange à -70 ° C pendant au moins 1 h. Isoler à 15 800 xg et éliminer le surnageant. Sécher les granulés à l'aide d'un lyophilisateur. Dissoudre le culot dans100 de l'eau sans RNase ul. NOTE: L'échantillon est prêt à être utilisé et peut être conservé à -20 ° C.

2. étalonnage et le fonctionnement des pinces optiques

  1. Calibrer Pixel Taille de moniteur vidéo
    1. Utilisez le piège optique pour piéger un cordon de diamètre connu (de taille standard).
    2. Capture d'images d'un cordon piégé en utilisant un logiciel d'imagerie (figure 4).
    3. Déterminer le diamètre de la bille à l'aide du logiciel de formation d'image sur la base de la méthode centroïde.
    4. Répétez cette procédure pour déterminer le diamètre de perles de différentes tailles.
    5. Monter les diamètres mesurés et connus des billes par une régression linéaire pour obtenir la taille physique d'un pixel.
  2. Vérifiez Calibration de distance
    1. Utilisez le piège optique pour piéger un cordon.
    2. Déterminer la position de pixel de son centre de gravité par le logiciel de capture d'image et enregistrer sa position en utilisant les Minitweezers.
    3. Dirigez le bourrelet à DIFFE louer positions et répéter la détermination de la position.
    4. Autre les positions X et Y de la bille à partir de pixels à l'unité de m en utilisant la taille de pixel calibré.
    5. Comparer les X et Y entre les positions mesurées par vidéo et par les Minitweezers. Les deux ensembles de valeurs devraient convenir. Comme la résolution de l'image est> 0,1 um, déplacer le bourrelet par-dessus 1 um entre les mesures pour assurer l'exactitude. Si l'étalonnage à distance n'est pas comparable à celui enregistré dans les Minitweezers, réglage de l'instrument.
  3. Piège rigidité étalonnage
    1. Capturez un cordon à l'aide du piège optique et maintenez-le encore.
    2. Enregistrer la force de la machine en utilisant une acquisition rapide de données de dérivation à un taux> 5 kHz pendant 3 sec.
    3. Générer un spectre de puissance à partir de l'enregistrement du mouvement des billes en utilisant un logiciel. Monter le spectre de puissance à une lorentzienne (Figure 5) 38:
      542 / 51542eq1.jpg "width =" 200 "/> (Eq. 1)
      où S (f) est la puissance à la fréquence de f, f c est la fréquence de coupure, et S 0 est la puissance asymptotique. La fréquence de coupure f c est la fréquence à laquelle la puissance de l'agitation thermique a diminué à la moitié de la valeur asymptotique. Comme f c varie avec la puissance du laser et la taille des billes, calibrer chaque bille piégée individuellement.
    4. Calculer la constante du ressort du piège, κ, de f c:
      figure-protocol-1 (Équation 2.)
      où γ est le coefficient de traînée du bourrelet (Eq. 3). Utilisez la constante de rappel pour déterminer les changements d'extension d'un ARN de changement de force.
  4. Droit d'essai de Stokes
    1. Capturez un cordon à l'aide du piège optique. Déplacez la bille va-et-vigueur à des vitesses différentes.
    2. Enregistrer le mouvement de la bille et le forcer à l'aide des Minitweezers.
    3. Calculer le rayon de la bille.
      NOTE: La force de frottement, F d, généré par le mouvement d'une particule sphérique dans un fluide peut être décrit par la loi de Stokes:
      figure-protocol-2 (Équation 3.)
      dans laquelle r est le rayon de la sphère, v est la vitesse, et h est la viscosité dynamique du fluide, qui peut être trouvée dans les tables de référence. Utilisation de la force F mesurée comme d, le rayon de la bille peut être calculée en utilisant l'équation. 3 (Figure 6) et doit concorder avec celle déterminée par le logiciel d'acquisition d'image. Le test de la loi de Stokes teste efficacement les étalonnages et les performances de l'instrument global.

3. Nanomanipulation de molécules d'ARN simple

  1. Faire fluidique.
    1. Percez six trous (mm de diamètre 2 chacun) sur un couvercle de verre n ° 2 (figure 7a) et couper trois fentes (largeur 2 mm) dans du ruban adhésif double-face polyimide (figure 7b) à l'aide d'un graveur laser.
    2. Faire une chambre d'écoulement en prenant en sandwich deux couvercle en verre avec deux couches de ruban adhésif double face Kapton. Insérez une micropipette et deux tubes de dérivation entre la bande (figure 7c).
    3. Montez la chambre de flux sur un cadre métallique en faisant correspondre les trous fluidiques (figure 7d).
    4. Connectez les canaux fluidiques de la chambre à 10 ml seringues remplies avec le tampon de choix par les tuyaux de polyéthylène (figure 7e).
    5. Montez la totalité de la chambre sur les pinces optiques entre les deux objectifs. Assurez-vous que la face avant de la chambre avec les canaux fluidiques face à la droite. Rétracter le droit objectif et branchez les broches en laiton du cadre (figure 7e) à trous de montage sur til pincettes. Serrez les vis pour fixer la position de la chambre.
  2. Mélanger l'échantillon et perles recuit. Mélanger l'échantillon recuit avec des perles anti-digoxigénine-enduits (DIG-perles), et laissez le mélange de rester à la température ambiante pendant 5-10 min. Typiquement, 1 ul de l'échantillon recuit est mélangé avec 5 ul DIG-billes dans 1 ml de tampon. REMARQUE: La quantité de billes à être chargée dans la chambre d'écoulement doit être choisi pour assurer une quantité suffisante de billes à être délivré à partir du tube de dérivation. Le rapport entre l'échantillon recuit à billes ne peut pas être facilement quantifiée. Dans un cas idéal, la plupart des billes n'ont pas d'ARN de telle sorte que seule une petite fraction de billes peut avoir seulement une molécule d'ARN par bille. Comme les échantillons recuits et la suspension de billes sont difficiles à quantifier, et la meilleure manière actuellement est seulement de faire varier le rapport de mélange et le mélange tester sur la pince à épiler.
  3. Fournir des billes vers le site de réaction dans la chambre d'écoulement (par exemple, de quelques micromètres au-dessus de la mipointe de cropipette, figure 7c).
    1. Chargez une suspension de billes revêtues de streptavidine (streptocoque-billes) dans une seringue de 1 ml.
    2. Raccorder la seringue au tube de fluide conduisant à la voie inférieure de la chambre d'écoulement (figure 7a).
    3. Poussez la seringue à couler les streptocoques-billes dans la chambre.
    4. Déplacer l'ensemble de la chambre en utilisant un logiciel de commande des moteurs afin de placer le piège optique à proximité de l'ouverture du tube de dérivation inférieur (Figure 7b). Actionnez ensuite le piège optique par un trackball pour capturer une angine de billes.
    5. Déplacer la bille à proximité de la pointe de la micropipette à l'aide du logiciel de commande du moteur.
    6. Tirer la seringue reliée à la micropipette à sucer la perle sur la micropipette.
    7. Appliquer flux doucement en appuyant sur la seringue pour le canal central pour débusquer streptocoque-perles supplémentaires.
    8. De même, fournir le mélange de l'échantillon et les fouilles-perles (voir l'étape 3.2) à la chaîne haut de la chambre.
    9. Capturer une fouille-perle et l'amener près de la strep perle utilisant le piège optique.
    10. Nettoyer le canal du milieu en appliquant flux. NOTE: La streptomycine et Dig-perles sont choisis pour être de tailles différentes afin qu'ils puissent être distingués visuellement sous la vue microscopique (Figure 4).
  4. Pêche "une seule molécule d'attacher entre une paire de talons.
    1. Placez le dig-perle verticalement au-dessus de l'angine de billes (figure 4).
    2. Déplacez le dig-talon descendant vers le streptocoque de billes en orientant le piège. Ouvrez une fenêtre de tracé vigueur distance sur l'ordinateur pour visualiser les changements de force.
    3. Au contact des deux perles, déplacez le dig-perle verticalement loin de l'angine de billes.
    4. Si aucun contact spécifique est faite, la force reste presque nulle. Si les deux bourrelets sont reliés par des molécules, la force augmente de façon significative lorsque les deux billes se séparent. Ce procédé, communément appelé "pêche", est souvent perfORMED plusieurs fois sur chaque paire de talons pour trouver une attache seule molécule efficace.

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Résultats

Limité par l'espace, nanomanipulation de molécules d'ARN simple est attesté par des seuls exemples qui se déroulent mécaniques des épingles à cheveux d'ARN et un ARN avec une structure tertiaire.

Manipuler simple épingle à cheveux molécules

Une fois qu'une attache est établie entre les billes, et l'extension de la force sur l'attache peuvent être manipulées en utilisant un protocole défini par l'utilisateur. Quatre pro...

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Discussion

Modification et dépannage dans la préparation des échantillons à la pince

Choix du vecteur de clonage. Bien que le schéma général décrit ici (figure 3) ne nécessite pas un vecteur de clonage particulier, le vecteur est préférable de ne pas avoir intrinsèque T7 ou le promoteur T3 pour la facilité de la transcription tel qu'un promoteur peut être introduit par PCR dans des positions souhaitées.

Séquence et lo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de la NSF (MCB-1054449) et une bourse du programme de recherche pilote interdisciplinaire collaborative de l’Institut de l’ARN de l’Université d’Albany à PTXL.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Pinces à étirerSteven B. Smith Engineeringhttp://tweezerslab.unipr.it
Carte d’acquisition de donnéesNational InstrumentsUSB-6351
Carte vidéoNational InstrumentsPCI-1407
Logiciel de programmation LabviewNational Instruments
NI Vision BuilderNational Instruments
Graveur laserEpilogue systèmes laserZing-16
Kit de purification PCRQiagen28104
MEGAscript T7 KitLife TechnologiesAM1334
MEGAclear KitLife TechnologiesAM1908
Biotin-11-UTPThermo Fisher
T4 ADN polyméraseNew England LabsM0203
Microsphère recouverte de streptavidineSpherotechSVP-20-5
Microsphère enduite d’antidigoxigénineSpherotechDIGP-20-2
Taille standard des microsphèresSpherotechPPS-6K
Bande KaptonKaptontape.comKPPTDE-1
N° 2 verre de protectionThermo Fisher12-543D
FERR0081

Références

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