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Article de méthode

Aiguë traumatisme cérébral chez la souris Suivi par longitudinale à deux photons imagerie

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DOI :

10.3791/51559

⸱

6 avril 2014

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1Neuroscience Center, University of Helsinki

Dans cet article

Résumé

Traumatisme cérébral aigu est une blessure grave qui n'a pas de traitement adéquat à ce jour. La microscopie multiphotonique permet d'étudier longitudinalement le processus de développement du cerveau de traumatisme aigu et stratégies thérapeutiques sondage chez les rongeurs. Deux modèles de traumatisme cérébral aigu étudié avec in vivo à deux photons imagerie cérébrale sont démontrées dans ce protocole.

Résumé

Bien traumatisme cérébral aigu entraîne souvent des dommages de tête dans différentes accidents et affecte une fraction importante de la population, il n'existe aucun traitement efficace pour le moment. Limites de modèles animaux actuellement utilisés empêchent la compréhension du mécanisme de la pathologie. La microscopie multiphotonique permet d'étudier les cellules et les tissus dans le cerveau des animaux intacts longitudinalement dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous décrivons deux modèles de lésion cérébrale aiguë étudiés au moyen de l'imagerie à deux photons du comportement des cellules du cerveau dans des conditions post-traumatiques. Une région du cerveau est lésé choisi avec une aiguille pour produire un traumatisme, d'une largeur et une profondeur contrôlée dans le parenchyme cérébral. Notre procédé utilise stéréotaxique piqûre avec une aiguille de seringue, qui peut être combinée avec l'application simultanée de médicaments. Nous proposons que cette méthode peut être utilisée comme un outil de pointe pour étudier les mécanismes cellulaires de conséquences physiopathologiques de traumatisme aigu dans le cerveau des mammifères

Introduction

Lésion cérébrale aiguë est un problème important de santé publique avec une incidence élevée de blessures dans des accidents de véhicules à moteur, les chutes ou les agressions, et la forte prévalence de l'incapacité chronique ultérieure. Approches thérapeutiques pour le traitement des lésions du cerveau restent totalement symptomatique, limitant ainsi l'efficacité des soins préhospitaliers, chirurgicale et critique. Cela rend l'impact social et économique de la lésion cérébrale particulièrement sévère. Pour une variété de raisons, la plupart des essais cliniques n'ont pas réussi à démontrer l'amélioration de la récupération après une lésion cérébrale à l'aide de nouvelles approches thérapeutiques.

Les modèles animaux sont cruciales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques vers un stade où l'efficacité du médicament peut être prédite chez les patients avec des lésions cérébrales. À l'heure actuelle, plusieurs modèles animaux bien établies de traumatisme crânien existent, y compris l'impact contrôlé corticale 1, percussion fluide blessure 2, déformation dynamique corticale 3, à chute de poids4, et 5 photo blessures. Un certain nombre de modèles expérimentaux ont été utilisés pour étudier certains aspects morphologiques, moléculaires et comportementaux de traumatisme crânien-pathologie associée. Toutefois, aucun modèle animal unique est tout à fait réussi à valider de nouvelles stratégies thérapeutiques. Développement de modèles animaux fiables, reproductibles et contrôlées de lésion cérébrale est nécessaire d'évaluer les processus pathologiques complexes.

La nouvelle combinaison des dernières technologies d'imagerie microscopique et journalistes fluorescentes codées génétiquement offre une occasion sans précédent d'étudier toutes les phases de la lésion cérébrale, qui comprennent des blessures primaire, la propagation de la lésion primaire, secondaire blessures et la régénération. En particulier, in vivo microscopie à deux photons est une technique optique non linéaire unique qui permet la visualisation en temps réel des structures cellulaires et sous-cellulaires, même dans les couches corticales profondes du cerveau de rongeurs. Plusieurs types de cellules et des organelles peuvent être visualisés simultanément en combinant différents marqueurs fluorescents. Grâce à cet outil puissant, nous pouvons visualiser les changements morphologiques et fonctionnels dynamiques cerveau vivant dans des conditions post-traumatiques. Les avantages de in vivo microscopie à deux photons dans l'étude des lésions cérébrales ont été récemment démontré par Kirov et ses collègues 6. L'utilisation d'un modèle de convergence de contusion corticale doux, ces auteurs ont montré que la blessure aiguë dendritique dans le cortex pericontusional est déclenché par la baisse du débit sanguin local. En outre, ils ont démontré que le cortex métaboliquement compromis autour du site de contusion est en outre endommagé par la dépolarisation d'étalement. Ce dommage secondaire affecte circuit synaptique, rendant les conséquences de la lésion cérébrale traumatique plus sévère.

Ici, nous proposons la méthode de piqûre stéréotaxique avec une aiguille de seringue, qui peut être combinée avec l'application du médicament topique simultanée, en tant que modèle avancée de cerveau localeblessure et comme un outil pour étudier les conséquences physiopathologiques de traumatisme aigu dans le cerveau des mammifères in vivo.

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Protocole

Toutes les procédures présentées ici ont été réalisées selon les recommandations locales pour les soins des animaux (La loi finlandaise sur l'expérimentation animale 62/2006). licence d'animaux (ESAVI/2857/04.10.03/2012) a été obtenu de l'autorité locale (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Souris adultes de 1-3 mois d'âge, poids 24-38 g, ont été maintenus dans des cages individuelles dans l'animalerie de l'Université certifié et fourni de la nourriture et de l'eau ad libitum.

Une. D'imagerie cérébrale des blessures à travers une fenêtre crânienne

  1. Anesthésier les animaux et la préparation du champ opératoire
    1. Anesthésier les souris par injection peritoneale d'un mélange de kétamine (Ketalar, 80 mg / kg) et de xylazine (Rompun, 10 mg / kg) dissous dans du tampon phosphate saline stérilisée par filtration (PBS), pH 7,4. Vérifiez les réflexes de la souris régulièrement (de la queue et de la sonde de pincement de l'orteil) pour vérifier la profondeur de l'anesthésie. Augmenter la dose si nécessaire, pour maintenir l'anesthésie adéquate mais éviter Overdose.
    2. Maintenir l'animal à 37,0 ° C en utilisant un coussin chauffant pendant une opération chirurgicale, séance d'imagerie et de la première heure après le réveil.
    3. Pour protéger les yeux de la souris de se dessécher, appliquer du lubrifiant de l'oeil.
    4. Administrer la dexaméthasone (Rapidexon vétérinaire, 2 mg / kg) par injection sous-cutanée pour réduire l'inflammation et l'œdème cérébral.
    5. Administrer un analgésique (par exemple, par voie intrapéritonéale Ketoprophene) jusqu'à 30 min avant ou immédiatement après la chirurgie. Si l'animal présente des symptômes de la douleur, comme la réticence à se déplacer, manger ou boire, ou la perte de poids, salivation, horripilation, ou respiratoire anormale sons après la chirurgie, répéter l'injection d'analgésique.
    6. Raser la «tête de souris avec une machine de rasage (voir Matériel et équipement). Éviter d'endommager les moustaches.
    7. Traiter la peau sur la tête de la souris avec une solution d'éthanol à 70% pour nettoyer la zone rasée.
    8. Avec des ciseaux chirurgicaux (voir Matériaux etÉquipement) et une pince (voir Matériel et équipement), couper la peau de la ligne médiane entre les oreilles sur le front.
    9. Gratter doucement le tissu conjonctif attaché au crâne avec une lame émoussée microchirurgie.
    10. Faites glisser les frontières de la peau sur le côté et tirez barres d'oreilles légèrement dans les orifices auditifs du crâne de la tête et la fixation de la peau.
    11. Nettoyez le crâne avec du PBS stérile et traiter le site de la chirurgie sur la tête de la souris avec 0,5% de digluconate de chlorhexidine, puis séchez la surface du crâne à l'aide d'une combinaison de coton-tiges stériles et d'air comprimé.
  2. Infliction de la blessure de piqûre
    1. Placez un petit instrument de stéréotaxique animal avec un support des animaux (voir Matériel et équipement).
    2. Ajuster la position du microscope binoculaire à côté de l'instrument stéréotaxique de se concentrer sur la surface du crâne de l'animal.
    3. En utilisant un microscope binoculaire, localisez le point sur le crâne de bregma.
    4. Identifier la région d'intérêt en utilisant les coordonnées stéréotaxiques.
      REMARQUE: Évitez les domaines d'intérêt qui sont situées directement sur les navires corticales superficielles. Destruction de ceux-ci peuvent affecter fortement la progression de traumatisme.
    5. Placez l'aiguille au-dessus de la région choisie 30 G et marquer l'emplacement cible en grattant la surface du crâne.
    6. Percer le crâne avec toutes les précautions possibles pour éviter l'élargissement inutile de la zone affectée de la surface de l'os. Utilisez une perceuse chirurgicale à grande vitesse (voir Matériel et équipement) sous le microscope. Arrêter le forage si le liquide apparaît dans la zone de forage.
    7. Toucher le fond du puits foré avec l'aiguille.
    8. Tremper l'aiguille sans à-coup dans le cerveau (taux d'insertion de 5 à 10 mm / min), à la profondeur de 0,5 à 2,0 mm en fonction des coordonnées du point d'application de la piqûre.
    9. Retirez l'aiguille immédiatement après avoir atteint la profondeur souhaitée (taux de rétraction 5-10 mm / min) et essuyer le sang qui apparaît après la piqûre d'un petit tampon (seMatériaux et équipements électroniques).
    10. Exécuter la micro-injection de 100 uM sulforhodamine 101 ou un autre composé d'intérêt dans le site de lésion à l'aide d'une pompe à microseringue (WPI) et 10 ul de seringue Hamilton assembler avec pipette en verre.
      Remarque: Au cours de la préparation de la pipette capillaire de verre à partir de verre de borosilicate, d'aiguiser la pointe d'un diamètre de 10 à 20 um.
    11. Infuser 250-1,500 nl de la solution d'injection à un taux de 5.2 nl / sec.
      NOTE: Laisser la pipette après la fin de la perfusion pendant au moins 5 min dans le parenchyme cérébral, puis retirez-le doucement et lentement pour éviter solution sorties.
  3. Craniotomie pour fenêtre crânienne chronique
    1. Percer le crâne doucement et soigneusement pour faire une fenêtre de cercle autour du site de la lésion. Utilisez diamètre de 3-3,5 mm de fenêtre.
    2. Appliquer une goutte de tampon de cortex (125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de glucose, 10 mM d'HEPES, 2 mM de CaCl2 2 mM et MgSO 4 dans H 2 O distillée) pour couvrir le wiNdow.
    3. Placez une lamelle de verre ronde (# 1.5 d'épaisseur) sur la fenêtre crânienne.
    4. Enlever l'excès de tampon de cortex autour de la lamelle couvre-objet.
    5. Sceller les bords de la lamelle avec de la colle acrylique (voir Matériel et équipement).
      REMARQUE: Assurez-vous que la colle n'est pas appliquée à la surface supérieure de la lamelle. Si le couvercle en verre est contaminé avec de la colle, attendre jusqu'à ce que le verre est stable collé sur le crâne et la colle sur la surface du verre devient sèche, puis retirez soigneusement la colle contaminer avec un microlame.
    6. Attendez 5 min pour laisser la colle sécher.
    7. En utilisant la barre de l'oreille vis de hauteur, ajuster la position de la tête de sorte que le support métallique peut être placé.
    8. Appliquez une petite quantité de colle acrylique sur l'anneau de la porte en acier (voir Matériel et équipement).
    9. Coller l'anneau de la porte en acier de la lamelle de verre avec la poignée de porte métallique dirigée vers l'arrière.
    10. Attendez 5 min pour laisser la colle sécher.
    11. Mix ciment dentaire (voir Matériel et équipement) avec de la colle acrylique dans un plat de 3,5 cm de Pétri (ou analogique) pour obtenir des conditions visqueux.
    12. Sceller les bords de la fenêtre crânienne avec le mélange + de la colle de ciment et de couvrir la surface exposée du crâne avec le même mélange jusqu'à la frontière de la peau.
    13. Attendre 15 minutes pour laisser le mélange de colle de + de ciment sécher puis enlevez barres d'oreilles.
    14. Effectuer excitation à deux photons microscopique (TPEM) imagerie pour la région d'intérêt et une zone de contrôle comme il décrit dans le protocole 3.
    15. Après l'imagerie, permet à l'animal de se remettre de l'anesthésie sur un coussin chauffant et le garder dans une cage individuelle en observation jusqu'à guérison complète. Nourriture humide ne peut être donnée pour faciliter la mastication et de l'hydratation.

2. Brain Injury imagerie à travers le crâne Diluée

  1. Anesthésier les animaux et la préparation du champ opératoire
    1. Anesthésier la souris et le préparer pour un traumatisme inductioncomme décrit dans l'étape 1.1.
  2. Crâne amincissement et d'infliger de la blessure de piqûre
    1. Placez un petit instrument de stéréotaxique animal avec le détenteur des animaux (voir Matériel et équipement).
    2. Ajustez la position d'un microscope binoculaire à côté de l'instrument stéréotaxique de se concentrer sur la surface du crâne de l'animal.
    3. Localiser le point de bregma sur le crâne à l'aide du microscope binoculaire, identifier la zone du cerveau à imager la base des coordonnées stéréotaxiques et marquer par le grattage.
      REMARQUE: Crâne situation éclaircie ne doit pas être situé sur ou à proximité sutures crâniennes, comme la stabilité du crâne est compromise dans ces domaines. En outre, les grands navires et des méninges situés sous les sutures du crâne corticales ou méningées sont susceptibles de provoquer des artefacts d'imagerie.
    4. Placer le support de métal revêtu de la colle sur la zone d'intérêt sur le crâne de l'animal, appliquer une légère pression et patienter pendant 5 min jusqu'à ce que le support métallique est solidement collées au crâne.
    5. Mélanger le ciment dentaire (voir Matériel et équipement) avec de la colle acrylique dans un plat de 3,5 cm de Pétri (ou analogique) pour obtenir des conditions visqueux.
    6. Sceller les bords du support métallique avec le mélange + de la colle de ciment et de couvrir la surface exposée du crâne avec le même mélange jusqu'à la frontière de la peau.
    7. Attendre 15 minutes pour laisser le mélange de ciment et de colle sèchent.
    8. Rincer la région amincie du crâne et les parties avoisinantes de la porte métallique à plusieurs reprises avec du PBS, de sorte que les restes de colle non polymérisée sont éliminés par lavage.
      NOTE: Il est essentiel d'assurer une fixation stable de crâne à la porte. Ceci permet à la stabilité de la préparation pendant l'imagerie.
    9. Utilisation du mode de grossissement de la loupe binoculaire, enlever les couches supérieures de l'os du crâne avec un micro-forage à grande vitesse pour créer une zone de crâne amincie de ~ 0,5-1,5 mm de diamètre. Utiliser de l'air comprimé en cours de forage pour enlever les débris osseux. Effectuer le intermittentl de foragey durant la procédure d'amincissement, afin d'éviter une surchauffe provoquée par friction. On refroidit le trépan de forage en utilisant la solution de la température ambiante et à appliquer périodiquement un tampon de la zone amincie pour absorber la chaleur.
      REMARQUE: Pour éviter d'endommager le cortex, ne pas percer sur de grandes régions (> 1,5 mm) jusqu'à une couche mince (<50 um).
      NOTE: La structure rongeurs d'os de crâne se compose de deux couches minces d'os compact séparées par une couche épaisse d'os spongieux. Minuscules cavités de la forme de l'os cercles concentriques et canalicules spongieux, qui contiennent des vaisseaux sanguins. Utiliser le micro-foret pour éliminer à la fois la couche externe de l'os compact et plus de la couche spongieuse. Rupture des vaisseaux sanguins au sein de l'os spongieux peut provoquer des saignements. Utilisez l'hémostase éponge de collagène pour arrêter cette hémorragie.
    10. Utilisez génération de seconde harmonique (SHG) Imagerie d'examiner si la majorité de l'os spongieux a été supprimé. Soyez prudent pour éviter un amincissement excessif, assurez-vous que l'os restant est eIcker de 50 um à ce stade de la préparation.
    11. Mettre une goutte de tampon chaude (35-37 ° C) au-dessus de la région amincie. Utilisez une lame de microchirurgie ou Micro finition Bur pour éliminer encore des couches osseuses et former une zone lisse de ~ 700 m de diamètre avec une épaisseur de l'os de ~ 20 um. Au cours de cette étape, il est utile d'effectuer une imagerie de SHG répétitif et mesurer régulièrement l'épaisseur de l'os.
    12. Effectuer une imagerie de TPEM pour la région d'intérêt et une zone de contrôle.
    13. Ajustez la position de la tête en utilisant la barre de l'oreille vis de la hauteur de manière à ce que amincie région est positionné strictement horizontalement. Placez l'aiguille au-dessus de la région amincie et assurez-vous qu'il n'y a pas de grands navires sous le site ciblé.
    14. Faire une lésion par immersion de l'aiguille dans le cerveau, à la profondeur de 0,5 à 2,0 mm de la surface du crâne amincie et en fonction des coordonnées du point d'application de la piqûre.
    15. Retirez l'aiguille et supprimer hémorragie apparaissant après til aiguë lésion cérébrale avec tampon hémostatique (voir Matériel et équipement). Attendez jusqu'à ce que la formation de caillots sanguins et forme navire pulsation au site de la lésion s'arrête.
    16. Exécuter la micro-injection de 100 uM sulforhodamine 101 ou un autre composé d'intérêt dans le site de la lésion, comme décrit ci-dessus dans la section 1.2.10.
    17. Effectuer une imagerie de TPEM pour surveiller la progression de la blessure et de récupération comme décrit dans le protocole 3.
    18. Après l'imagerie, permet à l'animal de reprendre conscience de l'anesthésie sur un coussin chauffant. Ne pas laisser l'animal sans surveillance et le retourner à sa cage seulement après la récupération physique complet.

3. Imagerie

  1. Placer l'animal sous le microscope par la fixation du support métallique au châssis construit sur mesure.
  2. Pour l'imagerie, par exemple, utiliser la FV1000MPE deux photons microscope équipé laser Mai Tai DeepSee et XLPLN 25X 1,05 NA objectif à immersion d'eau optimisé pour in vivo à deux photonsl'imagerie.
  3. Identifier le site de la lésion au microscope à fluorescence en utilisant le mode grand champ. Utilisez des filtres passe de longues visualiser vascularisation cérébrale et sélectionnez la zone de contrôle en fonction de la tendance observée des vaisseaux sanguins.
  4. À l'image du signal génération de seconde harmonique (SHG), régler le laser femtoseconde à la longueur d'onde de 800 nm et de recueillir la lumière émise à l'aide du filtre 380-410 nm de dérivation. Pour l'imagerie de fluorescence, en utilisant le filtre passe-bande (515 à 560 nm) pour collecter la lumière émise, et les longueurs d'onde suivantes sont utilisées pour exciter la fluorescence: 860 nm-GFP, YFP-950 nm.
  5. Utilisez un logiciel Fluoview pour l'acquisition de l'image.
  6. Coordonnées de chaque magasin ROI pour l'imagerie répétitive ultérieure. L'image de la même ROI cours du temps, et ajuster à chaque fois les coordonnées de maximiser le recouvrement de l'image.
  7. Analyser les images avec le logiciel approprié (par exemple. ImageJ). Reconstructions présentées ici ont été réalisées en utilisant le logiciel Imaris.

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Résultats

Nous avons optimisé deux procédures de fonctionnement: 1) la fenêtre crânienne chronique et 2) crâne éclaircie, pour l'imagerie du cerveau post-traumatique chez les souris transgéniques. Vue schématique de la préparation expérimentale est présentée dans la figure 1. Traumatique piqûre par aiguille en acier de 0,3 mm de diamètre extérieur (30 U) est appliquée à la puits foré (figure 1A). Une préparation crânienne succès de la fenêtre permet l'imagerie à des profondeurs allant jus...

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Discussion

traumatisme du cerveau est, un événement imprévisible brusque. Ici, nous décrivons le modèle animal qui reproduit un spectre de changements pathologiques observés chez des patients humains après une lésion cérébrale telle que la neurodégénérescence, l'élimination des dendrites, un oedème cérébral, une cicatrice gliale, des hémorragies dans le cortex cérébral associé à une hémorragie sous-arachnoïdienne focal et une perméabilité accrue de l' barrière hémato-encéphalique. Pour étudier la pathogenèse primaire et se...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous sommes profondément reconnaissants au Dr Frank Kirchhoff pour fournir GFAP-EGFP et souches de souris CX3CR1-EGFP. Le travail a été soutenu par des subventions du Centre de mobilité internationale de la Finlande, Tekes, finlandais Graduate School of Neuroscience (FGSN) et l'Académie de Finlande.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2A-sa pince à épiler muette, 115 mmXYtronicXY-2A-SA
30 G ½ ; en aiguilleBDREF 304000
Tondeuse pour animaux, machine à raserAesculapIsis GT420
Microscope binoculaireZeissStemi 2000
Régulateur de température biologique avec coussin chauffant en acier inoxydableSupertechTMP-5b
Lame microchirurgicale émousséeBDREF 374769
Tube borosilicaté avec filamentSutter InstrumentsBF120-69-10Pour la production de pipettes en verre
CarprofenePfizerRimadyl vet
Chlorhexidine digluconateSigmaC9394
Ciment dentaireDrguDent, DentsplyREF 640 200 271
DexaméthasoneFaunaPharmaRapidexon vet
Forets jetablesMeisingerHP 310 104 001 001 008
Dulbeco' s PBS 10xSigmaD1408
Dumont #5 pince, 110 mmFST91150-20
Extracteur de microélectrodes EalingEaling 50-2013Extracteur vertical pour la production de pipettes en verre
Pommade pour les yeuxNovartisViscotears
perceuseForedomFM3545
Foredom micromoteur à mainForedomMH-145
Plate-forme d’anesthésie gazeuse pour sourisStoelting50264Assemblé sur instrument stéréotaxique Hémostase
Collagen SpongeAvitene, Ultrafoam BARDRef 1050050
ImarisBitplane
KetamineIntervetKetaminol vet
Mai Tai DeepSee laserSpectra-Physics
Support en métalNeurotar
Pince à micropansements, 105 mmAesculapBD302R
MicrofilWPIMF34G-5Micro seringue de remplissage capillaires
Huile minéraleSigmaM8410
Microscope à balayage laser multiphotoniqueOlympusFV1000MPE
NanoFil Seringue 10 &mu ; lWPINANOFILSeringue Hamilton
Écouvillons non tissés 5 x 5Molnlycke Health CareMesoftTampons chirurgicaux
Colle polyacryliqueHenkelLoctite 401
Couvre-objet en verre rond  ;Microscopie électronique Sciences
1,5 épaisseur  ;
Instrument stéréotaxique pour petits animauxDavid Kopf Instruments900
Adaptateur pour souris et rat nouveau-néStoelting51625Assemblé sur instrument stéréotaxique.
Ciseaux à iris d’étudiant, droits 11,5 cmFST91460-11
Sondes moléculairesSulforhodamine 101S-359
Pompe à microseringue UMP3 et contrôleur de pompe à micro-seringue Micro 4WPIUMP3-1Micro-injecteur et contrôleur
XylazineBayer Health CareRompun vétérinaire
Foredom Foredom contrôle de

Références

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