Article de méthode

Méthode pour l'obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d'échantillons solides

DOI :

10.3791/51581

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4 février 2014

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1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Heath, University of Minnesota, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Maricopa Medical Center and St Josephs Hospital and Medical Center, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Dans cet article

Résumé

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Cette étude décrit un procédé détaillé pour l'isolement et la caractérisation de cellules de cancer ovarien primaire à partir de spécimens cliniques solides. Spécimens cliniques sur le cancer de l'ovaire sont soumis à une digestion enzymatique pour obtenir viable, libre fibroblastes cancer épithélial de l'ovaire (COE) de cellules très approprié pour des applications en aval.

Résumé

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Des outils fiables pour enquêter sur l'initiation de cancer de l'ovaire et la progression sont nécessaires d'urgence. Bien que l'utilisation de lignées de cellules de cancer de l'ovaire reste un outil précieux pour la compréhension du cancer de l'ovaire, leur utilisation a de nombreuses limites. Il s'agit notamment de l'absence d'hétérogénéité et la pléthore de modifications génétiques associées à des passages in vitro prolongée. Ici, nous décrivons une méthode qui permet de créer rapidement des cellules de cancer ovarien primaire forment les échantillons cliniques solides collectés au moment de la chirurgie. Le procédé consiste à soumettre les échantillons cliniques à une digestion enzymatique pendant 30 minutes. La suspension de cellules isolées est autorisé à croître et peut être utilisé pour une application en aval, y compris le criblage de médicaments. L'avantage de l'ovaire primaires des lignées cellulaires de cancer sur des lignées cellulaires de cancer de l'ovaire est établi qu'ils sont représentatifs des échantillons cliniques spécifiques originaux dont ils sont dérivés et peuvent être dérivées de différents sites si primacancer de l'ovaire ry ou métastatique.

Introduction

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Malgré sa faible incidence, le cancer de l'ovaire est le plus meurtrier des maladies gynécologiques et la cinquième cause de décès par cancer chez les femmes 1,2. Ceci est principalement dû à l'absence d'outils et de modèles fiables qui récapitulent fidèlement l'initiation et la progression de la maladie 3. La plupart de nos connaissances d'aujourd'hui sur le cancer de l'ovaire a été possible grâce à l'utilisation de cellules immortalisées ovariennes épithéliales de surface (IOS), des lignées de cellules de cancer de l'ovaire et les cellules cancéreuses ovariennes primaires récupérées à partir du liquide d'ascite 4-7. Malheureusement, leur utilisation présente plusieurs limites, y compris un certain nombre de modifications génétiques et phénotypiques liées au processus d'immortalisation ou dans les passages in vitro et l'hétérogénéité de la population résultant de la préparation fluide ascite.

Par conséquent, les cellules ovariennes cancéreuses primaires dérivées à partir d'échantillons solides identifiables et spécifiques d'un cancer de l'ovaire représentent uniquoutil de e pour l'étude de la progression du cancer de l'ovaire.

Les principales difficultés rencontrées dans le ces cellules malignes obtention sont dues à une prolifération de cellules stromales ou les fibroblastes avec la perte de la viabilité et de l'absence prématurée de la capacité de prolifération dans la culture de ces cellules COE. Plusieurs méthodes pour créer une seule cellule suspensions de tumeurs solides existent actuellement, par des moyens mécaniques ou dissociation enzymatique, mais certaines techniques donnent une plus grande quantité de la solution privilégiée 8. Ici, nous montrons que la digestion enzymatique à la dispase II entraîne une récupération efficace des cellules de SOE gratuit fibroblastes viables. Les cultures COE ainsi obtenus sont très sensibles à la manipulation génétique et sont également utiles dans des tests de dépistage de drogue, ce qui indique que ces cultures SOE sont adaptés à de nombreuses applications en aval.

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Protocole

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Déclaration d'éthique
Échantillons solides de cancer de l'ovaire ont été obtenus par le Fonds pour l'Université du Minnesota tissus sur les marchés publics (TPF) après Comité Institutional Review Board: Conseil de sujets humains (CISR) approbation.

Une. Configuration de réactifs

  1. Préparer le milieu complet DMEM en la complétant avec du DMEM 10% FBS, et 100 unités de pénicilline-streptomycine. Stocker le milieu à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant de l'utiliser.
  2. Aliquote dispase II dans des volumes séparés de 5-10 ml pour éviter le gel multiples dégèle et conserver à -20 ° C dans un congélateur sans nonfrost.

2. Collection de tissus

  1. Prélever des échantillons solides de cancer de l'ovaire (~ 5 g en taille) au moment de l'intervention chirurgicale à partir des zones macroscopiquement identifiés comme le cancer par un pathologiste. Les échantillons cliniques sont dé-identifiés et enregistrés conformément aux protocoles institutionnels.
  2. Placer les échantillons dans un stérile, scREW couvercle, le polypropylène spécimens récipient rempli avec 30 ml de PBS glacé. Le transport des spécimens de laboratoire de pathologie chirurgicale au laboratoire de recherche pour le traitement de la glace, et dans les 30 minutes à partir de la collecte de l'échantillon (Figure 1).

3. Traitement des tissus

  1. Travailler dans des conditions stériles, transférer les échantillons sur une boîte de Pétri (60 mm x 60 mm) contenant 10 ml de frais, PBS glacé et en utilisant une lame de rasoir stérile, outre les couper en plus petits morceaux possibles (2 mm ou moins) ( Figures 2A et 2B).
  2. Transférer les tissus hachés dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml d'préchauffé (37 ° C pendant 30 min) dispase II (2,4 U / ml) dans du DMEM et incuber à 5% de CO2 et à 37 ° C pendant 30 min. Pour assurer une digestion optimale des échantillons, agiter manuellement la suspension de cellules toutes les 5 min.
  3. Après 30 min d'incubation, le transfert (en utilisantune pipette sérologique de 10 ml) de la suspension cellulaire sur un tamis cellulaire (70 um de maille) placé sur le dessus d'un tube conique de 50 ml et d'appliquer une légère pression contre la grille, avec un piston de la seringue. Jeter n'importe quel tissu non dissocié (restant sur le dessus de la maille) et recueillir la suspension cellulaire obtenue dans le tube de 50 ml conique stérile. Centrifuger à 320 g pendant 7 minutes à 4 ° C (figure 3).
  4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS.
  5. Incuber la suspension de cellules dans une boîte de Petri à 5% de CO 2 et 37 ° C (Figure 4).
  6. Changer le milieu après 24 h de la plaque initiale. Ceci permet d'éliminer les débris cellulaires et la majorité des erythrocytes présents dans la culture.
  7. Changer le milieu tous les trois jours pendant les deux semaines suivantes, après quoi les cultures de primaire EOC sont prêts pour des applications en aval.

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Résultats

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Échantillons cliniques fraîches de cancer de l'ovaire sont recueillies après une intervention chirurgicale (figure 1) et coupées en petits morceaux (Figures 2A et 2B) constituant la suspension cellulaire. Cela permet d'obtenir une exposition optimale des spécimens pour le traitement enzymatique. Suspension cellulaire est exposée à une digestion enzymatique et on a incubé à 37 ° C pendant 30 min. Au cours de la période d'incubation de la suspension devient de plus en plu...

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Discussion

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Une meilleure compréhension de l'étiologie du cancer de l'ovaire et le développement est crucial pour améliorer les résultats des femmes touchées par cette maladie dévastatrice. Dans ce contexte, l'utilisation d'établi et "disponible dans le commerce" lignée de cellules de cancer de l'ovaire a sans doute été extrêmement utile. Cependant, nous savons aujourd'hui que les lignées cellulaires de cancer ne sont pas représentatifs de la tumeur humaine qu'ils proviennent dans de nombreux a...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous tenons à remercier le personnel de l'installation de tissus sur les marchés publics de l'Université du Minnesota de l'aide pour la collecte des échantillons de tissus des patients. Ce travail a été soutenu par le programme du ministère de la Défense recherche sur le cancer de l'ovaire (OCRP) de OC093424 de Mo, par le Fonds communautaire pour MB Shaver Recherche sur le Cancer Randy, par le Minnesota ovaire Cancer Alliance pour Mo et par le fonds oncologie gynécologique du ministère de MB. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou de la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x PBS, stérileInvitrogen14190-144
Couvercle à vis, récipient à échantillons en polypropylène, stérileThermo Scientific02 1090
Milieu DMEM, stérile  ;Invitrogen11995-065
Sérum fœtal de bovin, stérileThermo Scientific HycloneSH30396.03
100x Pénicilline-streptomycine, liquideInvitrogen15140-122
Dispase II, stérileRoche04942 078 001
Petite pince à pointe fine et lame de scalpel, stérileFisher ScientificPince : 08-953E, lames : 08-927-5D
Petits ciseaux de dissection, stérilesFisher Scientific08-945
15 ml Tubes coniques à capuchon, stérilesBD Falcon352097
50 ml Tubes coniques à capuchon, stérilesBD Falcon352027
10 ml Pipette sérologique, stérile.Corning13-678-11E
Piston de seringue de 6 ml, stérileTyco Healthcare8881516911
Filtre en nylon (70 &mu ; m ) passoire à cellules, stérileBD Falcon352350
5 cm Boîte de Pétri, stérileCorning430166 boîte de
Pétri de 10 cm, stérileCorning430167

Références

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  1. Kurman, R. J., Visvanathan, K., Roden, R., Wu, T. C., Ie M, S. hih Early detection and treatment of ovarian cancer: shifting from early stage to minimal volume of disease based on a new model of carcinogenesis. Am. J. Obstet. Gynecol. 198 (4), 351-356 (2008).
  2. Kuhn, E., Kurman, R. J., Shih, I. M. Ovarian Cancer Is an Imported Disease: Fact or Fiction. Curr. Obstet. Gynecol. Rep. 1 (1), 1-9 (2012).
  3. Sarojini, S., et al. Early detection biomarkers for ovarian. J. Oncol. , (2012).
  4. Shepherd, T. G., Theriault, B. L., Campbell, E. J. Nachtigal M.W. Primary culture of ovarian surface epithelial cells and ascites-derived ovarian cancer cells from patients. Nat. Protoc. 1 (6), 2643-2649 (2006).
  5. Tsao, S. W., et al. Characterization of human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV-E6E7 ORFs). Exp. Cell. Res. 218 (2), 499-507 (1995).
  6. Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab. Invest. 71 (4), 510-518 (1994).
  7. Brewer, M., et al. In vitro model of normal, immortalized ovarian surface epithelial and ovarian cancer cells for chemoprevention of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 98 (2), 182-192 (2005).
  8. Sueblinvong, T., et al. Establishment, characterization and downstream application of primary ovarian cancer cells derived from solid tumors. PLoS One. 7 (11), (2012).
  9. Rockwell, S. In vivo-in vitro tumour cell lines: characteristics and limitations as models for human cancer. Br. J. Cancer Suppl. 41 (4), 118-122 (1980).
  10. Wong, C., Chen, S. The development, application and limitations of breast cancer cell lines to study tamoxifen and aromatase inhibitor resistance. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 131 (3-5), 83-92 (2012).

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Mots-clés

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