Méthode pour l'obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d'échantillons solides

Malgré sa faible incidence, le cancer de l'ovaire est le plus meurtrier des maladies gynécologiques et la cinquième cause de décès par cancer chez les femmes ^1,2. Ceci est principalement dû à l'absence d'outils et de modèles fiables qui récapitulent fidèlement l'initiation et la progression de la maladie ^3. La plupart de nos connaissances d'aujourd'hui sur le cancer de l'ovaire a été possible grâce à l'utilisation de cellules immortalisées ovariennes épithéliales de surface (IOS), des lignées de cellules de cancer de l'ovaire et les cellules cancéreuses ovariennes primaires récupérées à partir du liquide d'ascite ^4-7. Malheureusement, leur utilisation présente plusieurs limites, y compris un certain nombre de modifications génétiques et phénotypiques liées au processus d'immortalisation ou dans les passages in vitro et l'hétérogénéité de la population résultant de la préparation fluide ascite.

Par conséquent, les cellules ovariennes cancéreuses primaires dérivées à partir d'échantillons solides identifiables et spécifiques d'un cancer de l'ovaire représentent uniquoutil de e pour l'étude de la progression du cancer de l'ovaire.

Les principales difficultés rencontrées dans le ces cellules malignes obtention sont dues à une prolifération de cellules stromales ou les fibroblastes avec la perte de la viabilité et de l'absence prématurée de la capacité de prolifération dans la culture de ces cellules COE. Plusieurs méthodes pour créer une seule cellule suspensions de tumeurs solides existent actuellement, par des moyens mécaniques ou dissociation enzymatique, mais certaines techniques donnent une plus grande quantité de la solution privilégiée ^8. Ici, nous montrons que la digestion enzymatique à la dispase II entraîne une récupération efficace des cellules de SOE gratuit fibroblastes viables. Les cultures COE ainsi obtenus sont très sensibles à la manipulation génétique et sont également utiles dans des tests de dépistage de drogue, ce qui indique que ces cultures SOE sont adaptés à de nombreuses applications en aval.

Déclaration d'éthique
Échantillons solides de cancer de l'ovaire ont été obtenus par le Fonds pour l'Université du Minnesota tissus sur les marchés publics (TPF) après Comité Institutional Review Board: Conseil de sujets humains (CISR) approbation.

Une. Configuration de réactifs

1. Préparer le milieu complet DMEM en la complétant avec du DMEM 10% FBS, et 100 unités de pénicilline-streptomycine. Stocker le milieu à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant de l'utiliser.
2. Aliquote dispase II dans des volumes séparés de 5-10 ml pour éviter le gel multiples dégèle et conserver à -20 ° C dans un congélateur sans nonfrost.

2. Collection de tissus

1. Prélever des échantillons solides de cancer de l'ovaire (~ 5 g en taille) au moment de l'intervention chirurgicale à partir des zones macroscopiquement identifiés comme le cancer par un pathologiste. Les échantillons cliniques sont dé-identifiés et enregistrés conformément aux protocoles institutionnels.
2. Placer les échantillons dans un stérile, scREW couvercle, le polypropylène spécimens récipient rempli avec 30 ml de PBS glacé. Le transport des spécimens de laboratoire de pathologie chirurgicale au laboratoire de recherche pour le traitement de la glace, et dans les 30 minutes à partir de la collecte de l'échantillon (Figure 1).

3. Traitement des tissus

1. Travailler dans des conditions stériles, transférer les échantillons sur une boîte de Pétri (60 mm x 60 mm) contenant 10 ml de frais, PBS glacé et en utilisant une lame de rasoir stérile, outre les couper en plus petits morceaux possibles (2 mm ou moins) ( Figures 2A et 2B).
2. Transférer les tissus hachés dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml d'préchauffé (37 ° C pendant 30 min) dispase II (2,4 U / ml) dans du DMEM et incuber à 5% _de CO2 et à 37 ° C pendant 30 min. Pour assurer une digestion optimale des échantillons, agiter manuellement la suspension de cellules toutes les 5 min.
3. Après 30 min d'incubation, le transfert (en utilisantune pipette sérologique de 10 ml) de la suspension cellulaire sur un tamis cellulaire (70 um de maille) placé sur le dessus d'un tube conique de 50 ml et d'appliquer une légère pression contre la grille, avec un piston de la seringue. Jeter n'importe quel tissu non dissocié (restant sur le dessus de la maille) et recueillir la suspension cellulaire obtenue dans le tube de 50 ml conique stérile. Centrifuger à 320 g pendant 7 minutes à 4 ° C (figure 3).
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS.
5. Incuber la suspension de cellules dans une boîte de Petri à 5% de CO ₂ et 37 ° C (Figure 4).
6. Changer le milieu après 24 h de la plaque initiale. Ceci permet d'éliminer les débris cellulaires et la majorité des erythrocytes présents dans la culture.
7. Changer le milieu tous les trois jours pendant les deux semaines suivantes, après quoi les cultures de primaire EOC sont prêts pour des applications en aval.

Échantillons cliniques fraîches de cancer de l'ovaire sont recueillies après une intervention chirurgicale (figure 1) et coupées en petits morceaux (Figures 2A et 2B) constituant la suspension cellulaire. Cela permet d'obtenir une exposition optimale des spécimens pour le traitement enzymatique. Suspension cellulaire est exposée à une digestion enzymatique et on a incubé à 37 ° C pendant 30 min. Au cours de la période d'incubation de la suspension devient de plus en plus nuageux (en particulier après chaque agitation) et c'est un signe de désagrégation du tissu. A la fin de la période d'incubation, la suspension est transférée sur un tamis cellulaire pour séparer les cellules de SOE non dissocié à partir de n'importe quel tissu (Figure 3). La suspension cellulaire récupérée est placé à 5% de CO 2 et 37 ° C (F igure 4). A ce stade, la morphologie des cultures de cellules révèle la présence de deux cellules de SOE comme une suspension de cellules individuelles et en petits amas. La culture à ce point révèle également la présentation CE des érythrocytes et de petits débris, comme indiqué à la figure 5. Il est important alors que le COE va lentement (sur une période de 1-3 jours) adhérer au plastique, les érythrocytes et les débris cellulaires ne sera pas et ils finiront progressivement "disparaître de la culture". Au jour 3 de dépôt initial, les cultures COE montrent de plus en plus adhérentes amas de cellules COE et de moins en moins des érythrocytes et des débris comme le montre la figure 6. Par jour 6-7, les cellules forment COE formes tourbillonnantes comme (flèche) et commencent à se propager à la matière plastique pour former des agrégats multicellulaires grandes menant à la morphologie pavée typique des cellules COE comme le montre la figure 7. Au jour 14, les cellules deviennent généralement COE confluence (figure 8) et sont maintenant prêts pour les essais et les applications en aval.

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Figure 1. Prélèvement des échantillons cliniques. Les échantillons solides de cancer de l'ovaire sont recueillies au moment de la chirurgie et placé dans un couvercle à vis, contenant polypropylène spécimen stérile rempli avec 30 ml de PBS glacé.

Figure 2. Traitement des échantillons cliniques. A) spécimen solides transférés sur une boîte de Petri contenant 10 ml de frais, glacée 1x PBS. B) Les échantillons cliniques en outre coupées en morceaux d'environ 2 mm.

Figure 4. Plaquage de cellules résultant EOC suspension. Après l'élimination de tous les tissus non dissociées, la suspension cellulaire est centrifugée et remise en suspension dans 10 ml de DMEM containing 10% de FBS et incubées dans une boîte de Petri à 5% de CO 2 et 37 ° C.

Figure 5. Morphologie du COE cultures de cellules immédiatement après le traitement. Suspension cellulaire immédiatement après placage montre COE comme un seul suspensions cellulaires et en touffes (tous les deux indiqué par les flèches), les érythrocytes et les débris cellulaires abondent encore à ce stade. Grossissement 20X.

Figure 6. Morphologie des cultures de cellules de SOE à jour 3 après placage culture cellulaire. EOC au jour 3 après l'étalement montre semi-adhérent EOC cell groupe (indiqué par la flèche) et de la contamination des érythrocytes moins. Grossissement 20X.

Figure 7. Cultures COE établies après une semaine de placage culture cellulaire EOC. Une semaine après dépôt initial montre grappes de turbulence comme des cellules d'épandage sur le plastique de culture de tissus. Grossissement 20X.

Figure 8. Cultures Confluent COE. Confluent monocouche de cellules COE montrant la morphologie typique pavé épithéliale après 14 jours de culture.

Les auteurs n'ont rien à révéler.