Électrofilé Fort échafaudages de poly (glycérol-dodécanedioate) pour l'ingénierie des tissus neuronaux De Souris cellules souches embryonnaires

Résumé

Synthèse et la fabrication de fibres longues électrofilé couvrant une zone de plus grand dépôt par un collecteur nouvellement conçu à partir d'un polymère biodégradable roman nommé poly (glycérol-dodécanoate) (PGD) a été signalé. Les fibres sont capables de soutenir la croissance de cellules dérivées de cellules souches pluripotentes de souris.

Résumé

Pour les applications de génie tissulaire, la préparation d'échafaudages biodégradables et biocompatibles est la tâche la plus souhaitable, mais difficile. Parmi les différents procédés de fabrication, électrofilage est le plus intéressant en raison de sa simplicité et sa polyvalence. En outre, les nanofibres électrofilées imitent la taille de la matrice extracellulaire naturelle assurant un soutien supplémentaire pour la survie et la croissance cellulaire. Cette étude a montré la viabilité de la fabrication de fibres longues couvrant une plus grande surface de dépôt pour un polymère biodégradable et biocompatible roman nommé poly (glycérol-dodécanoate) (DPI) ¹ en utilisant un collecteur nouvellement conçu pour électrofilature. DPI présente des propriétés élastiques uniques avec des propriétés mécaniques similaires aux tissus nerveux, il est donc approprié pour des applications de génie tissulaire de neurones. La synthèse et la fabrication mis en place pour la fabrication de matériaux d'échafaudage fibreux était simple, hautement reproductible et peu coûteux. Dans biocompatibilitéles essais, les cellules dérivées de cellules souches embryonnaires de souris pourraient adhérer à et se développer sur les fibres électrofilées de DPI. En résumé, ce protocole fournit un procédé de fabrication polyvalent de fabrication de fibres DPI électrofilé pour soutenir la croissance des cellules de la lignée de cellules souches embryonnaires de souris dérivées de neurones.

Introduction

Électrofilage est l'un des procédés de traitement efficaces pour produire des échafaudages de fibres de taille de micropore de nanomètres. Le principe de base de électrofilature implique un cône de Taylor de la solution qui se tient à l'orifice d'une aiguille par application d'une haute tension entre la pointe de l'aiguille et un collecteur de terre. Lorsque la répulsion électrostatique dans la solution dépasse la tension de surface, un jet de fluide chargé est éjecté hors de la pointe de l'aiguille, se déplace à travers l'air par évaporation de solvant, et est finalement déposé sur le collecteur à la masse. La pompe de seringue fournit un flux continu de solution sortant de la filière et par conséquent des copies multiples des fibres électrofilées peut être fabriqué à l'intérieur d'une courte période de temps. Au cours de sortie de la filière d'arriver au niveau du collecteur, le jet chargé va subir des étirements et fouetter selon un certain nombre de paramètres qui comprennent la viscosité et la tension superficielle de la solution de polymère, les électrostatiques!force de c dans la solution, et l'interaction du champ électrique externe, etc ^2.

Dans le procédé d'électrofilage, un collecteur servant de substrat conducteur, où les fibres à micro-nanomètres pourraient être déposées. Dans cette étude, un nouveau type de collecteur de fibres a été conçue pour obtenir des mats de fibres avec la taille souhaitée (longueur x largeur). Traditionnellement, la feuille d'aluminium est utilisée en tant que collecteur, mais il est difficile de transférer les fibres à partir de la surface plane à un autre substrat. La difficulté de la récolte d'une natte de fibres intactes à partir d'un collecteur traditionnel était principalement dû au fait que les fibres électrofilées fixent fermement à la surface du collecteur. Par conséquent, nous avons modifié le collecteur par pliage d'un morceau de feuille d'aluminium en une bande rectangulaire et sa fixation perpendiculairement à une plaque de métal plate. Les fibres électrofilées sont étirées à travers la zone entre l'extrémité de la bande et la plaque métallique, qui peut être facilement transféré à un autre Substrate.

L'intérêt pour les polymères élastomères thermiquement réticulés est en pleine expansion en raison du travail de pionnier du groupe Robert Langer, qui a introduit le poly (glycérol sebacate) (PGS), un polyester qui est analogue au caoutchouc vulcanisé en 2002 ^3. Similaires à PGS, nous avons développé avec succès poly (glycérol-dodécanoate) (DPI) par condensation thermique de glycérol et l'acide dodécanedioïque et démontré sa propriété unique à mémoire de forme ^1. Contrairement rigide matériaux synthétiques poly (hydroxy butyrate) ou poly (L-lactide) (le modules de Young de 250 MPa et 660 MPa respectivement), le DPI présente une propriété élastomère comme du caoutchouc, avec un module de Young de 1,08 MPa lorsque la température est supérieure à 37 ° C, qui est un match serré au nerf périphérique in-situ (0,45 MPa). En outre, le DPI est biodégradable et le temps de dégradation peut être affiné en faisant varier le rapport de glycérol et l'acide dodécanedioïque. Dodécanedioïque est un sous-douze carboneposition avec deux groupes carboxyliques terminaux, HOOC (CH _{2) 10} COOH. Acides dicarboxyliques même numérotées comme l'acide sébacique et l'acide dodécanedioïque peuvent être métabolisés en acétyl-CoA et entrez le Krebs (TCA) / (acide citrique) cycle. Le produit métabolique des acides dicarboxyliques, le succinyl-CoA, est un précurseur intermédiaire gluconeogenetic et de cycle TCA ^4. Ainsi, certaines études ont suggéré qu'ils pourraient être utilisés en tant que substrat de carburant alternatif pour la nutrition entérale et parentérale, en particulier dans les états pathologiques. En outre, le DPI présente une mémoire de forme unique, car sa température de transition vitreuse est de 31 ° C, donc il montre des propriétés mécaniques distinctes, à température ambiante et à la température corporelle. En somme, le DPI est biodégradable, biocompatible, présentant des propriétés élastiques uniques avec des propriétés mécaniques similaires aux tissus nerveux; Par conséquent, il s'agit d'un matériau approprié pour des applications nerf d'ingénierie tissulaire. Dans ce protocole, la électrofiléfibres longues couvrant une vaste zone de dépôt ont été fabriqués par le collecteur nouvellement conçu de DPI. Les échafaudages de fibres peuvent soutenir la croissance des cellules souches pluripotentes de souris et de la différenciation.

Protocole

1. Configuration Électrofilage Collector

1. Couper la feuille d'aluminium dans une pièce rectangulaire.
2. Pliez le morceau rectangulaire dans une bande rectangulaire, et l'attacher perpendiculaire à une plaque de métal plat avec du ruban adhésif (figure 1). Remarque: La taille de la natte de fibre dépend de la longueur et de la largeur de la bande. Ainsi, les dimensions de la bande peut être ajustée selon les besoins.

2. Préparation de la solution polymérique

1. Mélanger le glycérol et l'acide dodécanedioïque (DDA) dans un rapport molaire 1:1 dans un bécher à 120 ° C pendant 100 heures pour obtenir un polymère de DPI.
2. Dissoudre du poly (oxyde d'éthylène) (PEO) et de la gélatine dans 65% d'éthanol avec un rapport en poids de 1.5:3:95.5 dans un tube de 15 ml, serrer le bouchon et chauffer le mélange dans une étuve à 60 ° C pendant 1 h sous agitation jusqu'à ce qu'il devienne une solution homogène (solution de fond).
3. Pour électrofilature, mélanger le polymère de DPI et la solution de base à 04h06 ratio de poids. Remarque: concentration DPI a un big effet sur le diamètre des fibres. 30% -50% pour cent DPI est acceptable pour produire des fibres de plus de 5 cm de diamètre de la fibre a augmenté.
4. Ajouter 0,1% de la riboflavine à la solution de polymère et bien mélanger.

3. Électrofilage

1. Nourrir la solution de polymère dans une seringue de 5 ml en standard avec un 18 G émoussé aiguille en acier inoxydable.
2. Insérer la seringue dans une pompe à seringue.
3. Fixer le fil de mise à la terre d'une source de puissance à haute tension à la plaque métallique et le conducteur chargé positivement à l'aiguille.
4. Ajuster la distance entre l'aiguille et la bande de feuille d'aluminium à 15 cm.
5. Placer la pompe à seringue dans un angle d'environ 15 ° avec l'horizontale pour empêcher l'agrégation des fibres à l'avant de la bande.
6. Mettre en marche la pompe à seringue et d'ajuster le débit de la pompe d'écoulement de 0,6 ml / h.
7. Mettre en marche la source d'alimentation à haute tension et régler la tension de fonctionnement à 14,6 kV.

4.Traitement de la fibre

1. Après la collecte est terminée, exposer le mat de fibres à une lumière UV pendant 60 min pour la réticulation.
2. Transférer la nappe fibreuse de la bande de papier d'aluminium pour une boîte de Pétri de 100 mm, et de l'exposer à une lumière UV pendant 20 minutes pour la stérilisation.
3. Dans une enceinte de biosécurité, couper la natte en fibres en morceaux ronds de la même taille avec une lame chirurgicale et placer les morceaux dans une plaque de 24 puits.
4. Pour la cellule de traitement pré-semis, plonger échantillons de fibres dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
5. Le lendemain, aspirer soigneusement PBS, ajouter 1 ml de milieu de différenciation (DMEM/F12, N2, et FGF2) (voir la recette dans le tableau Matériaux) à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 3 heures.
6. milieu de différenciation de Aspirer soigneusement, ajouter 0,2 ml de matrigel pour chaque échantillon de fibre et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Remarque: La laminine peut également être utilisé pour le revêtement de la fibre. Ajouter 0,2 ml de 20 pg / ml de lamininepour la fibre et incuber à température ambiante pendant 3 heures.
7. Retirez délicatement l'excès matrigel de chaque puits. Rincer avec 2 ml de milieu de différenciation fois. Note: Les échantillons de fibres sont prêtes pour la culture cellulaire.

5. Cellule de semis sur fibres

1. Ajouter 1 ml d'Accutase à la boîte de culture cellulaire MES et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
2. Après 10 minutes, les cellules MES sont détachées de la boîte de culture. Ajouter 4 ml de milieu de différenciation de la plaque. Recueillir les cellules MES flottant dans un tube de 15 ml et les cellules de pipette et pour briser colonies (environ 15x).
3. Centrifuger à 400 g pendant 5 min et les cellules re-suspension dans 4 ml de milieu de différenciation.
4. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Transférer 200 pl de la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et diluer 10 fois avec du milieu de différenciation. Transférer 15 ul de la suspension cellulaire diluée à une chambre sur la hémocytomètre avec une lamelle couvre-objet en place. Compterles cellules de la place centrale de 1 mm et les quatre cases de coins de la hémocytomètre sous le microscope. Note: cellule par ml = le nombre moyen par mètre carré x le facteur de dilution x 10 ⁴
5. Placez environ 5 x 10 ⁴ cellules MES sur chaque puits. Déposer lentement la suspension cellulaire sur le milieu des échantillons de fibres, au lieu de glisser sur le côté du puits, pour empêcher la solution de s'écouler hors du tapis de fibres.
6. Ajouter 1 ml de milieu de différenciation à chaque puits, et maintenir la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2, afin de permettre la fixation des cellules, la croissance et la différenciation.
7. Aspirer le vieux milieu de chaque puits et les remplacer par 1 ml de milieu de différenciation frais tous les deux jours.

6. Viabilité cellulaire

1. Aspirer l'ancien milieu de chaque puits.
2. Mélanger 1/10 ^ème volume de résazurine réactif de fluorescence avec du milieu de culture et ajouter 1 ml dans chaque puits.
3. Incubmangé à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 4 heures, à l'abri de la lumière directe.
4. Après 4 heures, transférer 100 pl 3x du réactif de chaque puits à une plaque de 96 puits, puis les échantillons sont prêts à être mesurée sur un spectrophotomètre de fluorescence à l'aide des paramètres de filtre 560EX nm/590EM.

7. PCR en temps réel

1. Après 14 jours de culture, ajouter un tampon de lyse pour les échantillons et d'isoler l'ARN total à partir des cellules sur des échantillons de fibres.
2. Utilisez 4 ul d'ARN total pour synthétiser l'ADNc dans 20 échelles de réaction ul par transcription inverse.
3. Préparer le mélange PCR de réaction dans chaque tube optique: 10 pi Master Mix (2x), 0,2 pi colorant, 8 pi d'eau de nucléase libre, 1 ul d'ADNc, et 1 pi amorce (amorces utilisées dans cette étude sont présentés au tableau 1).
4. Mettre en place le programme de PCR: a. 95 ° C 02:20 min, 1 cycle b. 95 ° C 3 sec → 60 ° C 1 min, 40 cycles c. 95 ° C 15 sec, 1 cycle d. 60 ° C 1min, 1 cycle e. 95 ° C 15 sec, 1 cycle. Choisissez comparative méthode C _T pour déterminer les niveaux d'expression des gènes relative.
5. Après PCR est terminée, analyser les résultats PCR en temps réel avec le logiciel StepOne et exporter les résultats au format Excel.

Résultats

Les principaux composants de l'électrofilage sont présentés dans la figure 1. Un grand matelas de fibres de taille a été généralement obtenue à travers la bande de feuille d'aluminium perpendiculairement ci-joint et d'une plaque métallique plane. Figure 2 montre la conception de collecteur et le mat de fibres d'électrofilage. La largeur et la longueur peut être ajustée pour différentes applications. La longueur de la fibre à base de polymère de DPI et mélange de la solut...

Discussion

Les limitations de collecteurs simples ou les complexités de collecteurs qui sont actuellement utilisés pour augmenter la restriction électrofilage d'obtention de la longueur désirée et la taille de matelas de fibres pour certaines applications tournant. En outre, le transfert des fibres à partir du collecteur de masse à la boîte de culture ou d'autres substrats est un défi ^5. Dans ce rapport, un collecteur nouvellement conçus, fabriqués en attachant une bande de papier d'aluminium pour le collect...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Glycérol	Sigma-Aldrich	G7757
Acide dodécanédioïque	Sigma-Aldrich	D1009
	Gélatine Sigma-Aldrich	D1890
Poly(oxyde d’éthylène) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
riboflavine	Sigma-Aldrich	132350250	0,10 %
Cellules souches embryonnaires	de sourisGlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2 supplément	Invitrogen	17502048	1 %
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Solution saline tamponnée au phosphate (Crédit : PBS)	Invitrogen	10010-031
Colorant de fluorescence Resazurin	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV Système d’isolement de l’ARN total	Promega	Z3100
Système de transcription inverse GoScript	Promega	A5000
qPCR Master Mix	Promega	A6001
Pompe à seringue  ;	Fisher scientific	14-831-200
Source d’alimentation haute tension  ;	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
Lampe UV	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT Lecteur de microplaques multimode	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne Système de PCR en temps réel	Applied Biosystems	4376357

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