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Profils MicroRNA d'expression de cellules iPS humaines, l'épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

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DOI :

10.3791/51589

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24 juin 2014

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research, JBSA Fort Sam Houston

Dans cet article

Résumé

Le profil des souches d'origine humaine pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de l'homme induit-souches pluripotentes (iPS) (iPS-RPE), et RPE fœtale microARN (miARN), ont été comparés.

Résumé

L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour comparer le profil des anthropique-souches pluripotentes (iPS), l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS humaines (iPS-RPE), et RPE fœtale microRNA (miRNA). Les protocoles comprennent la collecte de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules. Les méthodes de culture de cellules iPS et RPE fœtale sont expliqués. Le protocole utilisé pour la différenciation de l'EPR de iPS humaines est également décrite. La technique d'extraction d'ARN, nous décrivons a été choisie pour permettre une récupération maximale de l'ARN très faible pour une utilisation dans un microréseau miARN. Enfin, voie cellulaire et l'analyse du réseau de données de puces à ADN est expliqué. Ces techniques vont faciliter la comparaison des profils de miARN de trois types de cellules différents.

Introduction

Les cellules souches ont la capacité de se répliquer sans limite et le potentiel de se différencier en n'importe quel type de cellules somatiques. Le développement des techniques de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches pluripotentes a suscité beaucoup d'enthousiasme dans la communauté des chercheurs et des cliniciens, comme l'avènement de la régénération des tissus personnalisé à l'horizon 1. Induire-souches pluripotentes (iPS) présentent les mêmes caractéristiques de potentiel réplicatif illimité et pluripotence comme souches embryonnaires (ES) des cellules tout en contournant les dilemmes éthiques liés à la CES. En outre, les cellules souches provenant de patients ne seront pas stimuler une réponse immunitaire, ce qui augmente considérablement la probabilité de succès des applications thérapeutiques 3.2. Dans des conditions de culture spécifiques, les cellules iPS ont été montrés pour se différencier en plusieurs types différents de cellules in vitro, y compris les cardiomyocytes, les neurones, les cellules bêta pancréatiques, des hépatocytes, et l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE) 4-12.

La RPE est une couche de cellules epitheliales spécialisées pigmentés situés à l'arrière de la rétine qui exécute plusieurs fonctions qui sont essentielles pour la santé visuelle et fonction telle que l'absorption de la lumière parasite, la phagocytose des segments externes des photorécepteurs, et le traitement des rétinoïdes pour la production de chromophore visuelle. Le dysfonctionnement de l'EPR en raison de dommages ou maladie affecte profondément la santé des photorécepteurs et la fonction visuelle comme en témoignent les maladies cécitantes qui sont le résultat de la pathologie de l'EPR sous-jacente comme la dégénérescence liée à l'âge (DMLA), la maladie de Stargardt et la rétinite pigmentaire (RP) 13. Traitements vraiment efficaces qui peuvent restaurer la vision n'ont pas été atteints, et le remplacement des RPE malade avec sain RPE peut être la meilleure option pour éviter la perte de vision 14-15. EPR dérivé de cellules iPS (iPS-RPE) est une source possible de cellules pour remplacer l'EPR endommagé. iPS-RPE exprime caracprotéines RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF, et RPE65; affiche la classique fortement pigmentée hexagonale RPE morphologie; et exerce des fonctions RPE comme la phagocytose, le traitement rétinoïde, et la sécrétion de 11 - 5,16 rétinienne cis. Toutefois, avant iPS-RPE peut être utilisé en thérapeutique, l'IPS-RPE doit être caractérisée à fond. La compréhension des facteurs qui régissent différenciation RPE est nécessaire d'améliorer le rendement et la pureté des cellules pour être utilisé pour des applications cliniques.

La différenciation cellulaire est le résultat de l'expression des gènes fortement réglementé. Remodelage épigénétique du génome et de la coordination des facteurs de transcription sont requis pour les décisions du destin cellulaire qui se produisent lors de la différenciation et de développement 17. Règlement de message de l'ARN (ARNm) traduction par les microARN (miARN) présente encore un autre niveau de la réglementation qui affecte le destin des cellules 1. MiRNAs sont courtes, ~ 22 nt, longueurs de nucléotides qui soit la traduction suppress parla liaison à la 3 'UTR de l'ARNm ou de cibler l'ARNm de la dégradation. MiRNAs ont été détectés dans pratiquement tous les tissus et à ce jour plus de 2000 microARN humains uniques ont été enregistrés dans la base de données miRBase. Depuis miARN exigent complémentarité partielle de se lier à l'ARNm cible, un seul miARN peut potentiellement se lier à des dizaines ou des centaines de cibles, et vice versa, c'est à dire un seul ARNm peut être visé par plusieurs miARN différents. Cette caractéristique de liaison promiscuité augmente considérablement le niveau de complexité de la réglementation ainsi que le niveau de difficulté de déterminer les fonctions de miARN individuels et le rôle de chacun dans les fonctions cellulaires 18-21. Néanmoins, des études ont montré que les miARN affine l'expression des gènes lors de la différenciation en affectant le statut de méthylation d'ADN 17. Dans une étude plus spécifique de l'EPR, miR-204/211 a été montré pour promouvoir le phénotype épithélial de l'EPR 22. Un autre groupe a analysé le profil miRNAde RPE cours de la différenciation des cellules ES et révélé ensembles distincts de miARN sont exprimés au cours du processus de différenciation 23. En fait, les profils de miARN peuvent clairement distinguer les types de cellules, y compris les cellules souches embryonnaires, des cellules précurseurs et des cellules à différenciation terminale 24,25. Plus de 250 miARN sont exprimés dans la rétine. Sur la base de ces études, nous faisons l'hypothèse que les miARN jouent un rôle important au cours de la différenciation des RPE de iPS.

L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles pour la différenciation des RPE de IMR90-4 cellules iPS, collection de l'ARN pour l'analyse par puces à ADN, et l'analyse des données de puces à ADN pour identifier les miARN qui sont exprimés de manière différentielle entre trois types de cellules, les cellules iPS , iPS-RPE et RPE fœtale. L'ARN total a été extrait à partir de cultures de chaque type de cellule et hybride à une puce à ADN miRNA, contenant des sondes spécifiques pour 1205 miARN humains et 144 miARN viraux. Les résultats de puces à ADN ont été comparerd pour déterminer le miARN ont été exprimés de façon différentielle entre les différents types cellulaires. miARN avec 2 fois ou plus facteur de variation de l'expression ont été sélectionnés pour une analyse plus approfondie. Un logiciel d'analyse miARN a été utilisé pour identifier des cibles potentielles des miARN exprimés de manière différentielle et de générer des réseaux cellulaires régulés par les miARN sélectionnés.

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Protocole

1. Préparation de la Culture Réactifs et Culture Plaques

  1. mTeSR1 médias: Préparer médias mTeSR1 selon les instructions du fabricant. Décongeler 100 ml de supplément mTeSR1 5x nuit à 4 ° C. Ajouter 100 ml de supplément mTeSR1 5x 400 ml de mTeSR1 milieux de base et bien mélanger. Ce support est stable à 4 ° C pendant jusqu'à 2 semaines et à -20 ° C pendant 6 mois.
  2. médias de différenciation: Préparez le support de différenciation dans DMEM/F12 pour obtenir 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 2,0 mM de L-glutamine, sérum de KO de 10%, et 10 pg / ml de gentamicine.
  3. iPS-RPE médias: Préparer médias iPS-RPE dans MEM pour donner supplément 1x N1, 0,1 mM acides aminés non essentiels, 250 ug / taurine ml, ml de sel de sodium de 13 ng / triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml d'hydrocortisone, 5 ug / ml de gentamicine, 15 et 26% de FBS.
  4. Sel de sodium solution stock triiodo-L-thyronine. Pour préparer la solution mère dissoudre 1,0 mg de triiodo-L-thyroninesel de sodium 1 N dans de l'hydroxyde de sodium en remuant doucement. Suivant ajouter 49,0 ml de milieu de base pour faire 50,0 ml de 20 pg / ml de sel de sodium triiodo-L-thyronine. Préparer des aliquotes et congeler à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Utiliser un volume approprié pour atteindre la concentration souhaitée dans les milieux de culture final.
  5. Hydrocortisone solution stock: Pour préparer une solution stock d'hydrocortisone, solubiliser 1 mg d'hydrocortisone dans 1 ml d'éthanol absolu par agitation douce. Ensuite, ajoutez 19,0 ml de milieu de base pour 20 ml d'hydrocortisone solution stock de 50 pg / ml. aliquoter et congeler à -20 ° C jusqu'à utilisation. Utiliser un volume approprié pour obtenir la concentration désirée dans le milieu de culture final.
  6. Milieu de croissance de RPE foetal. Préparer le milieu de croissance en mélangeant tous les réactifs dans le kit RTEGM dans le milieu de base, selon les instructions du fabricant, sauf pour le FBS.
  7. Fœtale médias RPE de placage. Préparer des milieux placage par transfert d'une petite quantité de milieu de croissance dans un récipient stérile et d'unedd FBS à une concentration finale de 2%.
  8. Dispase: Préparer la solution de travail de dispase de 1 mg / ml dans DMEM/F12.
  9. Matrigel plaques enduites: Préparer matrigel dans DMEM/F12 à 0,08 mg / ml.
  10. Manteau de chaque puits d'une plaque à 6 puits avec 1,0 ml de la solution de Matrigel.
  11. Incuber les plaques revêtues à la température ambiante pendant 1,0 h.
  12. Après l'incubation de 1,0 heures, aspirer l'excédent DMEM/F12.
  13. Ajouter 0,5 ml de milieu mTeSR1 pour éviter le séchage. Les plaques de matrigel enduit sont maintenant prêts à être utilisés.

2. IPS Culture

  1. Avant iPS cellules semis ont tous les tubes, les médias mTESR1 chaud à la température ambiante, et les matrigel plaques enduites de prêts.
  2. Dégeler rapidement les cellules iPS IMR90-4 dans un bain d'eau à 37 °. Ensuite, retirer le tube cryogénique du bain d'eau et stériliser en utilisant 70% d'éthanol.
  3. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml à l'aide d'une pipette 2 ml de réduire au minimum la rupture des agrégats cellulaires.
  4. Goutte à goutte, ajoutez 5 ml de warm médias mTeSR1 aux cellules et mélanger délicatement. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante et retirer le surnageant.
  5. Remettre en suspension soigneusement les agrégats de cellules dans 2 ml de milieu mTeSR1 et épépiner les cellules sur un puits d'une plaque de six puits.
  6. Placer la plaque dans un incubateur et la culture à 37 ° avec 5% de CO2, 95% d'humidité.
  7. Changer les milieux de culture de cellules iPS quotidien. Colonies indifférenciées apparaissent 5-7 jours après le semis. Vérifiez colonies indifférenciées qui sont prêts pour le passage (colonies avec un centre dense).

3. Repiquage des cellules iPS

  1. Avant de commencer le passage des cellules iPS, ont tous les tubes, solution dispase, DMEM/F12 et mTERS1 médias réchauffé jusqu'à la température ambiante, et le matrigel revêtu des plaques prêtes.
  2. Avant de passage de cellules iPS, retirez tous les domaines de la différenciation en grattant la zone et aspirer les médias. La différenciation devrait rester en dessous de 20% du bien pour une grandecultures de qualité. Rincer soigneusement le contenant des cellules iPS-bien avec 2 ml DMEM/F12 et ajouter 1 ml de 1 mg / ml dispase à chaque puits.
  3. Incuber à 37 ° C pendant 7 min. Aspirer la dispase et rincer délicatement les colonies de cellules avec 2 ml de DMEM/F12 deux fois.
  4. Après rinçage, ajouter 2 ml de mTSER1 à chaque puits.
  5. L'utilisation d'un pipette de 5 ml gratter doucement les colonies de la plaque pour former des agrégats.
  6. Transférer les colonies individuelles dans un tube conique de 15 ml. Ajouter un média mTeSR1 suffisantes pour ensemencer la suivante passage des cellules.

4. Différenciation des cellules iPS pour iPS-RPE

  1. Plaquer les cellules iPS sur une plaque nouvellement revêtu dans les médias mTESR1.
  2. Permettre aux colonies de cellules iPS à développer pour 4-5 jours de culture.
  3. Médias mTeSR1 substitut avec les médias de différenciation 4 ml. Changer la moitié des médias tous les 3 jours.
  4. Permettre aux foyers pigmentées de croître suffisamment grande pour être disséqué manuellement de la culture (40-50 jours).
  5. Utilisez un200 pi pointe de la pipette pour couper autour et lever les colonies pigmentées.
  6. Recueillir et mettre en commun les colonies disséqués dans un tube conique de 15 ml.
  7. Ajouter ensuite 5 ml de DMEM/F12 aux cellules de l'EPR en gestion commune et centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à deux reprises.
  8. Préparer une solution à une seule cellule par incubation de la mise en commun iPS-RPE avec 0,25% de trypsine EDTA.
  9. Rincer les cellules iPS-RPE avec les médias iPS-RPE et plaquer les cellules recueillies sur un matrigel revêtu bien dans 4 ml de milieu iPS-RPE frais.
  10. Culture des cellules pendant 3 semaines avant au passage. Modifiez les médias tous les 3 jours. Pour l'expérience, plaque iPS-RPE à 100 000 cellules / cm 2. Recueillir des cellules le jour 17. Comptez le jour de l'ensemencement comme jour 0.

5. Prélèvement des échantillons

  1. Cellules iPS Collection
    1. Culture des cellules iPS jusqu'à colonies indifférenciées sont observés à être dense au centre.
    2. Rincer les colonies dans DMEM/F12.
    3. Dissocier en cellules individuelles en utilisant accutas e. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 2 ml de DMEM/F12.
  2. Fœtale Collection RPE
    1. Rincer les cultures de cellules foetales RPE avec DMEM/F12 et se dissocier en cellules individuelles en utilisant 0,25% de trypsine EDTA.
    2. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans 2 ml de DMEM/F12.
  3. iPS-RPE cellulaire Collection
    1. Lorsque l'IPS-RPE atteindre passage 3 et 5 passage, recueillir les cellules sur Jour 17 après le passage. Rincer iPS-RPE deux fois dans du PBS et on prépare une suspension de cellules isolées par incubation avec 1,0 ml de trypsine à 0,25%.
    2. Neutraliser la trypsine avec 2 ml de glace froide médias iPS-RPE.
    3. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
    4. Remettre en suspension la suspension de cellules dans 3 ml de tampon de coloration du kit de microbille.
ve_title "> 6. négatif Sélection des iPS-RPE pour éliminer les cellules indifférenciées

  1. Conservez tous les réactifs à 4 ° C jusqu'à leur utilisation, mais ne fonctionnent pas sur la glace. Centrifugeuse cellule suspension de l'étape 5.3.4 à 300 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
  2. Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon de coloration du kit de microbilles par 2 x 10 6 cellules.
  3. Ajouter 10 ul d'anti-TRA-1-60-PE anticorps par 2 x 10 6 cellules.
  4. Bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 10 min.
  5. Laver les cellules dans 1-2 ml de tampon par 2 x 10 6 cellules. Centrifugeuse pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant.
  6. Resuspendre les cellules dans 80 ul de tampon de coloration par 2 x 10 6 cellules. Ajouter 20 ul de microbilles anti-PE marqués (dans le kit) par 2 x 10 6 cellules. Mélangez bien. Incuber pendant 15 min à 4 ° C.
  7. Ajouter 1-2 ml de tampon de coloration par 2 x 10 6 cellules. Centrifugeuse pendant 10 min à 300 x g. Aspirer le surnageant.
  8. Remettre les cellules dans 500 & #956; l de tampon de coloration.
  9. Séparation magnétique de cellules:
    1. Placez colonne de tri cellulaire magnétique. Rincer la colonne avec 3 ml de tampon de coloration.
    2. Appliquer suspension cellulaire de 6,8 sur une colonne.
    3. Placez un tube au port négatif pour recueillir les TRA-1-60 cellules négatives.

7. Extraction de l'ARN total

  1. Lyse des cellules en exécutant les échantillons à travers une colonne microcentrifuge homogénéisateur mini tour disponible dans le commerce conçu pour minipreps d'acides nucléiques.
  2. Extraire l'ARN total des cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale avec le kit d'extraction d'ARN disponible dans le commerce destinée à préserver les petites molécules d'ARN 27.
  3. Déterminer des concentrations d'ARN totaux en utilisant un spectrophotomètre de Nanodrop.

8. Bioanalyzer et biopuces Assay

  1. Vérifier l'intégrité de l'ARN avec Bioanalyzer en conjonction avec kit disponible dans le commerce de la qualité de l'ARN.
  2. Incuber 100 ng del'ARN total avec la phosphatase intestinale de veau à 37 ° C pendant 30 minutes
  3. Dénaturer l'ARN en utilisant 100% de DMSO à 100 ° C pendant 5 min.
  4. Étiqueter les échantillons avec du PCP-Cy3 utilisant la T4 ligase par incubation à 16 ° C pendant 1 heure.
  5. S'hybrider sur un format de tableau 8_x_15K miARN humain.
  6. Laver les tableaux selon les instructions du fabricant et de numériser à une résolution de 5 um en utilisant un scanner.
  7. Acquérir des données en utilisant un logiciel d'extraction de caractéristiques de puces à ADN compatible avec la puce miARN.
  8. Traiter les signaux de miARN pour déterminer le niveau relatif d'expression de chaque échantillon.
  9. Comparer les niveaux de chaque miRNA entre les groupes d'échantillons d'expression. Sélectionnez miARN avec l'expression différentielle au moins deux fois pour une analyse ultérieure.
  10. Utilisation d'un logiciel disponible dans le commerce pour l'analyse des données, suivez les instructions pour générer des cartes de chaleur pour la visualisation des miARN exprimés de manière différentielle 28.

9. Analyse de Pathway

  1. Sauvegardez les données de miARN sélectionnés en 8.9 en format Excel.
  2. Connectez-vous au programme d'analyse en ligne de la voie de l'ARN. Téléchargez le fichier Excel. Sélectionnez "Format flexible" pour le format de fichier et sélectionnez "Agilent" dans la liste déroulante pour le type d'identificateur.
  3. Au point de données brutes, assigner "ID" pour sonder la colonne d'identification et d'attribuer "Observation 1" et "log rapport" à la colonne journal de la ration. Sélectionnez "ignorer" pour toutes les autres colonnes.
  4. Sélectionnez les paramètres d'analyse comme suit: Confiance: observé expérimentalement que; inclure les relations directes et indirectes; et inclure des produits chimiques endogènes; Sélectionnez la base de connaissances d'Ingenuity comme l'ensemble de référence. Choisir la base de données des molécules de référence qui comprend des données provenant de toutes les espèces, toutes les lignées cellulaires et les tissus, et toutes les mutations.
  5. réseau Run et la voie analyses.

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Résultats

cellules iPS (figure 1A) ont été cultivées dans des conditions de différenciation pour induire la différenciation en cellules iPS-RPE. L'IPS-RPE exposé classique phénotype de l'EPR de hexagonal pigmentée morphologie cellulaire (figure 1B) similaire à RPE fœtale (figure 1C).

Pour mieux comprendre le rôle que peut jouer miRNA au cours du processus de différenciation de cellules iPS à iPS-RPE, l'analyse des microréseaux d'expres...

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Discussion

En conclusion, ce rapport décrit les méthodes utilisées pour la culture de cellules iPS, iPS-RPE, et RPE fœtale. EPR dérivé de iPS sont morphologiquement et fonctionnellement similaire à RPE fœtale. L'IPS-RPE exprime aussi des gènes de RPE caractéristiques dont RPE65, CRALBP, PEDF, et LRAT 16. Pour mieux caractériser ces cellules, l'ARN a été extrait et utilisé pour effectuer l'analyse des microréseaux d'identifier exprimé de manière différentielle miARN. Analyse des intensités de signal a rév...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les opinions exprimées dans le présent article sont celles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme fonctionnaire ou comme reflétant les vues du Département de l'Armée ou le ministère de la Défense.

Cette recherche a été réalisée alors que les auteurs Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, et Ramesh R. Kaini tenu un attaché de recherche postdoctorale du Conseil national de recherches à l'USAISR.

analyses de biopuces ont été effectuées par l'Institut de recherche sur le cancer de puces à ADN base la facilité de la Greehey enfants et Département bioinformatique à l'UT Health Science Center à San Antonio.

Ce travail a été soutenu par le Programme de l'armée américaine médecine clinique de réadaptation de la recherche (CRMRP) et militaire du programme de recherche de la médecine opérationnelle (MOMRP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu mTeSR1 + supplément 5XStem Cell Technologies5850
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-&beta ;-mercaptoethanolSigmaM-7154
Acides aminés non essentielsHyclone(Fisher)SH30853.01
Knockout sérum de remplacementLife Technologies10828-028
Gentamicine  ;Life Technologies15750-060
MEM mediaLife Technologies10370-021
N1 supplémentSigmaN-6530-5ML
TaurineSigmaT-8691-25G
HydrocortisoneSigmaH0888-1G
Sérum fœtal bovinHyclone(Fisher)SH3008803HI
Triiodo-l-thyronine sel sodiqueSigmaT6397
Hydroxyde de sodiumSigmaS5881
Média RPE fœtal Kit RTEGMLife Technologies195406
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Saline tamponnée au phosphateHyclone(Fisher)10010-023
TrypsineHyclone(Fisher)25200-072
Tampon de lavage Miltenyi BiotecStemGent130-092-987
Tampon de rinçage Miltenyi BiotecStemGent130-092-222
Kit de microbilles Anti-TRA-1-60StemGent130-095-816
Colonne de tri cellulaire Miltenyi BiotecStemGent130-021-101
RNeasy micro kitQiagen74004
Broyeur QIAQiagen79654
RNA 6000 Pico LabChip kitAgilentG2938-90046
Microarray miARN humain v16AgilentG4471A

Références

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