Le développement de l&#39;Amelogenin-chitosane Hydrogel pour<em&gt; In Vitro</em&gt; Émail repousse avec une interface dense

Résumé

Dans cet article, on décrit un protocole de fabrication d'un hydrogel de chitosane-amélogénine à la reconstruction de l'émail superficiel. Organisé croissance in situ de cristaux d'apatite dans l'hydrogel formé dans une interface émail-restauration dense, ce qui permettra d'améliorer l'efficacité et la durabilité des restaurations.

Résumé

La reconstruction biomimétique de l’émail est un sujet important en science des matériaux et en dentisterie en tant que nouvelle approche pour le traitement des caries ou de l’érosion dentaires. Il a été prouvé que l’amélogénine est une protéine essentielle pour contrôler la croissance organisée des cristaux d’apatite. Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour la reconstruction superficielle de l’émail en utilisant un nouvel hydrogel d’amélogénine-chitosane. Comparée à d’autres traitements conventionnels, tels que le fluorure topique et le bain de bouche, cette méthode a non seulement le potentiel de prévenir le développement de caries dentaires, mais favorise également une restauration importante et durable de l’émail. La microstructure organisée semblable à celle de l’émail régulée par les assemblages d’amélogénine peut améliorer considérablement les propriétés mécaniques de l’émail dépoli, tandis que l’interface dense émail-restauration formée par une repousse in situ de cristaux d’apatite peut améliorer l’efficacité et la durabilité des restaurations. De plus, l’hydrogel de chitosane est facile à utiliser et peut supprimer l’infection bactérienne, qui est le principal facteur de risque de survenue de caries dentaires. Par conséquent, cet hydrogel d’amélogénine-chitosane biocompatible et biodégradable est prometteur en tant que biomatériau pour la prévention, la restauration et le traitement de l’émail défectueux.

Introduction

L’émail dentaire est la surface minéralisée dure des dents humaines. Il est composé de nombreux cristaux d’apatite en forme d’aiguilles, qui sont regroupés dans des prismes parallèles organisés pour assurer la résistance mécanique unique et la protection biologique que l’émail offre^1-2. Contrairement à d’autres tissus minéralisés, tels que l’os et la dentine, l’émail mature est acellulaire et ne peut pas se régénérer après une perte minérale substantielle^1-2, qui se manifeste souvent par des caries dentaires ou une érosion. Les produits disponibles dans le commerce, tels que les vernis contenant du fluorure, les dentifrices et les bains de bouche, sont efficaces pour reminéraliser l’émail, mais aucun d’entre eux n’a le potentiel de favoriser la formation de cristaux d’apatite organisés. Cliniquement, le traitement conventionnel de la réparation de l’émail implique une procédure de remplissage avec des matériaux artificiels tels que l’amalgame, la céramique ou la résine composite ³. Cependant, ces matériaux ne s’interfacent généralement pas bien avec le tissu naturel entourant la lésion, car leurs structures, composants et propriétés sont différents de l’émail naturel. En conséquence, des caries secondaires se développent fréquemment au fil du temps à l’interface entre la dent et les corps étrangers. Par conséquent, la repousse in situ de l’émail avec une interface dense est une cible attrayante pour les domaines de la science des matériaux et de la stomatologie. Un moyen particulièrement prometteur d’atteindre cet objectif est la synthèse biomimétique d’un matériau semblable à l’émail à la surface de l’émail. Récemment, de nombreuses tentatives in vitro ont été faites pour préparer des matériaux semblables à l’émail à l’aide de systèmes biomimétiques contenant des nano-apatites ou différents additifs organiques ^4-12. Cependant, le développement de la stratégie biomimétique optimale pour favoriser la reminéralisation des cristaux afin d’obtenir une interface dense parfaite reste un défi.

Au cours de la minéralisation de l’émail, la croissance et l’allongement orientés des cristaux d’apatite sont régulés par une matrice riche en amélogénine ^1,13-14. Pour imiter la matrice organique dans le développement de l’émail, nous décrivons ici un protocole détaillé pour la fabrication d’un hydrogel d’amélogénine-chitosane (CS-AMEL) pour la repousse de l’émail in situ sur une surface d’émail dépolie à l’acide utilisée comme modèle pour les lésions érosives. En tant que « milieu de croissance le plus polyvalent » pour les cristaux ¹⁵, les matrices d’hydrogel ont un avantage sur un système de solution car elles sont cliniquement plus faciles à manipuler. De plus, le CS-AMEL est biocompatible, biodégradable et possède des propriétés antimicrobiennes et d’adhérence uniques qui se comparent favorablement à d’autres systèmes biomimétiques pour les applications dentaires ¹⁶. Il est important de noter que la minéralisation in situ des cristaux d’apatite à la surface de l’émail fournit une interface dense entre la couche réparée et l’émail naturel, ce qui peut potentiellement améliorer la durabilité des restaurations et prévenir la formation de nouvelles caries à la marge de la restauration.

Protocole

Les molaires humaines ont été extraites en suivant les procédures standard pour l'extraction de l'École de médecine dentaire Ostrow de l'Université de Californie du Sud et manipulés avec l'approbation de l'Institutional Review Board.

1. Préparation de la Dent dépoli à l'acide Slice

1. Sélectionner une troisième molaire humaine sans caries restaurées.
2. Retirer la partie racine de la molaire, et couper la couronne de la molaire longitudinalement en tranches de 2 mm d'épaisseur en utilisant un faible débit diamant scie refroidi à l'eau. Nettoyer par ultrasons ces tranches pendant 2 min, puis les rincer avec de l'eau déminéralisée 3 fois.
3. Pour simuler des lésions érosives, graver les tranches de dents avec 30% d'acide phosphorique pendant 30 secondes puis les rincer immédiatement avec de l'eau déminéralisée.
4. Nettoyer par ultrasons des tranches gravées pendant 2 min, puis les rincer avec de l'eau déminéralisée 3 fois.

2. Préparation d'hydrogel chitosane-Amelogenin

1. Preparation de la solution mère de chitosane
   1. Dissoudre 1% (w / v) chitosane (masse moléculaire moyenne, 75 à 85% désacétylée) dans une (v / v) d'une solution à 1% d'acide acétique suivi par une agitation à 80 ° CO / N.
   2. Après refroidissement de la solution à la température ambiante, filtrer la solution de chitosane à l'aide d'un filtre de 0,45 um. Ajuster le pH à 5,0 par addition d'une solution de NaOH.
2. Préparation de calcium et de solution stock de phosphate (0,1 M)
   1. Peser le chlorure de calcium (CaCl ₂₎ et préparer une solution à 0,1 M, puis mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire. Ajuster la valeur du pH à 11 par addition d'une solution de NaOH.
   2. Peser le phosphate disodique (Na ₂ HPO ₄₎ et préparer une solution à 0,1 M, puis mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
3. Expression et purification de l'amélogénine recombinant ^17-18
   La pleine longueur amelogenin porcin recombinant (rP172) utilisé ici a 172 acides aminés et est un analogue de la pleineLongueur porcine P173 natif, mais sans la méthionine N-terminale ainsi que d'un groupe phosphate sur Ser16 ^18.
   1. Ajouter 20 g de bouillon Lysogénie (LB) Agar en poudre dans 500 ml d'eau déminéralisée, l'autoclave la solution à 121 ° C (réglage de liquide) pendant 20 min. Laisser refroidir la gélose à ~ 55 ° C, ajouter de l'ampicilline (100 ug / ml) dans une solution d'agar.
   2. Transférer la solution de gélose des boîtes de Petri, laisser chaque plaque froide jusqu'à ce qu'il soit solide, puis retournez pour éviter la condensation sur la gélose. plaques de magasins dans des sacs en plastique à 4 ° C.
   3. Streak la plaque de gélose LB avec des cellules recombinantes (E. coli-BC21) du stock de glycérol (-80 ° C). Incuber les plaques O / N à 37 ° C.
   4. Préparer 50 ml de milieu NZCYM et autoclave les médias à 121 ° C pendant 30 min. Autoriser les médias à refroidir, ajouter 50 ul de 100 pg / ml d'ampicilline à 50 ml de milieu.
   5. Inoculer une colonie unique à partir de la plaque d'agar-agar dans le milieu LB 50 ml de NZCYM supplémenté avec ampicillIncuber les cellules po O / N dans un incubateur agitateur à 37 ° C.
   6. Préparer 1 L de médias NZCYM et autoclave les médias à 121 ° C pendant 30 min. Ajouter 1 ml de 100 mg / ml d'ampicilline à 1000 ml de milieu. Prenez une densité optique (DO) de la lecture comme une vierge à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis. NOTE: Ne pas jeter ce après la première lecture.
   7. Inoculer 10 ml de la culture cellulaire de l'étape 2.3.5 dans 1000 ml de milieu de l'étape 2.3.6. Lire la densité optique à 595 nm immédiatement après l'inoculation. Prendre la mesure de la densité optique pour assurer le suivi de la croissance. REMARQUE: Lire la vierge à chaque fois la DO est prise.
   8. Induire avec 700 ul d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 M) lorsque la croissance bactérienne atteint à environ 0,75 ~ 0,8 DO à 595 nm.
   9. Récolter les cellules lorsque la DO atteint 1.1. Verser le contenu de la fiole dans des bouteilles en plastique 6. Et peser les bouteilles avant d'utiliser la centrifugeuse. Centrifuger pendant 20 min à 8554 g à 4 ° C.Conserver le culot cellulaire dans l'-20 ° CO / N.
   10. Sortez les culots de cellules et de les combiner dans un tube de 50 ml. Ajouter 3,5 ml de guanidine HCl 4M par L de fermentation. Fois Soniquer 2-3 sur la glace, 30 secondes à chaque fois, avec des intervalles de 1 min.
   11. Faire des dilutions 6x de volume de la cellule avec de l'acide formique à 0,5% et laisser remuer dans la chambre froide pendant 2 heures. Centrifuger pendant 30 min, 8554 g à 4 ° C. Gardez le surnageant. Ajouter 20% de sulfate d'ammonium saturé à l'aide de la solution mère saturée et remuer dans la chambre froide, O / N.
   12. Centrifuger pendant 30 min, 8554 g à 4 ° C et garder le culot. Reconstituer les pastilles dans 0,1% d'acide trifluoroacétique (TFA), de la charge sur une colonne C4 (10 x 250 mm, 5 um), et fractionner en utilisant un gradient linéaire de A = 0,1% de TFA et B = 60% d'acétonitrile dans du TFA, à une taux de 1,5 ml · ^{min -1} débit.
   13. Congeler la solution de protéine sur glace sèche et lyophiliser l'échantillon congelé O / N.
4. Préparation de amelogenin-chitosane (CS-AMEL) hydrographieel (figure 1A)
   1. Ajouter 200 ug de rp172 dans un tube contenant 960 pi de solution de chitosane à 1%, puis mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire.
   2. Ajouter 25 ul de 0,1 M CaCl ₂ solution suivis par 15 ul de 0,1 M de Na ₂ HPO ₄ solution à la solution de chitosane contenant amélogénine-, puis mélanger à l'aide d'un vortex pendant 5 min.
   3. Ajuster le pH de la solution de CS-AMEL à 6,5 en ajoutant avec précaution une solution de NaOH. CS-AMEL hydrogel se forme lorsque la valeur du pH atteigne 6,5.

3. Émail repousse dans Amelogenin-chitosane hydrogel

1. Préparation de la solution de salive artificielle
   1. Dissoudre une certaine quantité de chlorure de magnésium (MgCl _2, 0,2 mM), du chlorure de calcium (CaCl _2, 1 mM), du dihydrogénophosphate de potassium (KH ₂ PO _4, 4 mM), du chlorure de potassium (KCl, 16 mM) et de chlorure d'ammonium ( NH ₄ Cl, 4,5 mM) dans 20 mM d'HEPES(4 - (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthane-sulfonique) en mémoire tampon ^12.
   2. Ajuster le pH à 7,0 avec NaOH 1 M et de stocker la solution de salive artificielle à 4 ° C.
   3. Avant d'utiliser la solution, ajouter du fluorure de sodium (NaF, 300 ppm).
2. Application de CS-AMEL hydrogel
   1. Appliquer environ 20 ul hydrogel CS-AMEL à la tranche de la dent mordancée à l'aide d'une seringue (Figure 1B).
   2. Sécher la dent tranche recouverte d'un hydrogel dans un dessiccateur à la température ambiante pendant 2 h.
   3. Transférer la tranche de la dent dans un bêcher contenant 30 ml d'une solution de salive artificielle. Recouvrir de papier d'aluminium, puis garder le bécher dans un four à 37 ° C pendant 7 jours.
   4. Retirez la tranche de la dent et le sécher dans un dessiccateur à la température ambiante.

4. Caractérisation de l'interface entre la couche nouvellement Cultivé et émail

La microstructure de l'interface entre la couche nouvellement développé et l'émail a été observed par microscopie électronique à balayage (MEB) et microscopie électronique à transmission à haute révolution (HR-TEM). L'échantillon de MET a été préparé en utilisant un faisceau d'ions focalisé (FIB) de la technique, pour les étapes qui sont les suivantes.

1. Chargez l'échantillon dans un instrument FIB-SEM et terminer tous les alignements selon les instructions de fonctionnement. REMARQUE: Le réglage fin de Z doit être effectuée au moins 2 fois.
2. Déposer une couche de carbone (15 x 3 um) sur l'échantillon afin de protéger la structure sous-jacente (figure 2A).
3. Mill soigneusement l'échantillon sur les côtés supérieur, inférieur et droit de la couche de carbone pour préparer un petit morceau de l'échantillon, et ensuite coupé la partie inférieure de cette pièce mince. REMARQUE: Vérifiez l'alignement du faisceau d'ions avant chaque étape de broyage (figure 2B).
4. Souder une pointe de Pt sur ​​la pièce mince et couper la partie gauche de séparer l'échantillon pièce (figure 3C). REMARQUE: Vérifiez l'alignement du faisceau d'ions avant l'étape de soudage.
5. Sortez til pt basculer avec l'échantillon lentement, et monter l'échantillon lamellaire sur une grille de TEM-soulèvement.
6. Détachez la pointe de l'échantillon, et mince de l'échantillon jusqu'à ce que son épaisseur est inférieure à 100 nm (figure 3D). Enlever l'échantillon de l'instrument pour effectuer l'observation TEM. REMARQUE: Vérifiez l'alignement du faisceau d'ions avant chaque processus d'amincissement.

5. Évaluation des propriétés de liaison et mécaniques de la couche nouvellement Grown

1. La résistance de liaison est évaluée par un traitement aux ultrasons. Gardez la tranche de dent réparée dans un nettoyeur à ultrasons (42 kHz, 100 W) pendant 10 min, puis observer l'interface entre la couche réparé et l'émail naturel avec un électron rétrodiffusé analyse SEM.
2. Mesurer la dureté et le module d'élasticité à 20 points de test sur chaque surface de l'émail réparé (n = 3) par un nano-indentation avec une pointe Berkovich.

6. Immunofluorescence

1. Laver la tranche de la dent avec du Tris Buffer solution saline (TBS) pendant 15 min.
2. Bloquer avec 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du TBS pendant 15 minutes.
3. Éliminer le liquide de l'échantillon et incuber O / N avec 1 ° Ab (1:500 poulet anti-Amelogenin) dilués dans du TBS (0,1% de BSA, 0,3% de Triton X-100).
4. Laver l'échantillon avec le SCT pour 30 min et incuber O / N avec 2 ° Ab (1:100 anti-poulet FITC) dilué dans du TBS.
5. Laver l'échantillon avec le SCT pour 30 min et laisser sécher pendant 30 min.
6. Observez par microscope à fluorescence.

Résultats

L'efficacité du protocole décrit ici est mise en évidence par microscopie électronique à balayage (MEB), la diffraction d'électrons de la zone sélectionnée (DSA) et la diffraction des rayons X (XRD) des analyses. Après la réparation par amélogénine-chitosan (CS-AMEL) hydrogel pendant 7 jours, une couche d'émail en forme avec une épaisseur de 15 pm a été formée sur la surface de l'émail mordancé. La couche nouvellement développée a été faite de matrices hautement ordonnées de cristaux d'un diamètre d&...

Discussion

Bien que la teneur en minéraux de l'émail est élevé rend plus difficile le tissu minéralisé dans le corps humain, ce biocéramique est sensible aux processus de déminéralisation, qui se produisent souvent que la carie dentaire ou de l'érosion. Les mutations génétiques peuvent aussi provoquer émail fines et souples menant à une série de maladies héréditaires de malformation de l'émail appelé Amélogenèse imparfaite ^20. Produits de soins de santé bucco-dentaire contenant du fluorure ou CPP-AC...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Troisième molaire humaine  ;	École de dentisterie Ostrow de l’Université de Californie du Sud  ;	Les	molaires humaines ont été extraites selon les procédures standard d’extraction à l’Ostrow School of Dentistry de l’Université de Californie du Sud et manipulées avec l’approbation de l’Institutional Review Board.
Pocine amélogénine recombinante	Expression et purification  ; en laboratoire	N/A	rP172, pleine longueur  ;
Chitosan  ;	Sigma-Aldrich	448877	Poids moléculaire moyen, 75-85 %
d’acide phosphorique désacétylé  ;	VWR	AA033266
Acide acétique glacial	VWR	A036289
Hydroxyde de sodium	VWR	BDH9292
Chlorure de calcium  ;	Sigma-Aldrich	223506
Phosphate de sodium dibasique anhydre	VWR	BDH0316
BL21-CodonPlus (DE3)-RP  ;	Agilent Technologies Inc.
Sulfate d’ammonium	VWR	BDH8001
Acide trifluoroacétique	VWR	AAAL06374
Acétonitrile	VWR	BDH1103
Chlorure de magnésium	VWR	BDH0244
Dihydrogénophosphate de potassium	VWR	BDH9268
Chlorure de potassium  ;	VWR	BDH0258
Chlorure d’ammonium  ;	VWR	AAAA15000
HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthane-sulfonique)	VWR	AAA14777
Fluorure de sodium  ;	VWR	AA11561
Saline tamponnée au Tris	Bio-Rad	170-6435	10× ; TBS
Albumine sérique bovine	EMD Millipore  ;	12659	CalBioChem, albumine, sérum bovin, fraction V, faible teneur en métaux lourds  ;
Triton X-100	EMD Millipore  ;	TX1568-1
Anti-Amélogénine de poulet	N/A	N/A	Un cadeau du Prof. Malcolm Snead, Université de Californie du Sud
Bovin Anti-Poulet IgY-FITC	Santa Cruz Biotechnology	Sc-2700
chromatographie liquide à haute performance	Agilent Technologies Inc.	Varian Prostar 210
C4 colonne	Phenomenx  ;	Jupiter 5&mu ; 300A
;	JEOL  ;	JSM-7001
FIB-SEM  ;	JEOL  ;	JIB-4500
Microscopie électronique à transmission  ;	JEOL	JEM-2100F
Scie diamantée numérique basse vitesse	MTI Corporation	SYJ-150
Microscopie à fluorescence	Leica	DMI3000 B
Nettoyeur à ultrasons  ;	Branson  ;	2510	42 kHz, 100 W
Nano-pénétrateur  ;	Agilent Technologies Inc.	MTS XP