Quantification et Taille-profilage des vésicules extracellulaires Utilisation accordable résistive Pulse Sensing

Summary

Vésicules extracellulaires jouent des rôles importants dans les processus physiologiques et pathologiques, y compris la coagulation, la réponse immunitaire, ou le cancer et comme agents thérapeutiques potentiels dans l'administration de médicaments ou de la médecine régénératrice. Ce protocole présente des méthodes pour la quantification et la caractérisation granulométrique des vésicules extracellulaires isolés et non-isolés dans divers liquides à l'aide accordable détection d'impulsion résistive.

Abstract

Vésicules extracellulaires (VE), y compris les «microvésicules» et «exosomes», sont très abondants dans les fluides corporels. Ces dernières années ont vu une augmentation considérable de l'intérêt pour les véhicules électriques. On a montré que les véhicules électriques à jouer des rôles importants dans divers processus physiologiques et pathologiques, y compris la coagulation, la réponse immunitaire et du cancer. En outre, les véhicules électriques ont un potentiel en tant qu'agents thérapeutiques, par exemple comme véhicules d'administration de médicaments ou en tant que médecine régénératrice. En raison de leur petite taille (50 à 1000 nm) quantification précise et la taille profilage des véhicules électriques représente un défi technique.

Ce protocole décrit comment accordable impulsion résistive de détection (PST) de la technologie, en utilisant le système qNano, peut être utilisé pour déterminer la concentration et la taille des véhicules électriques. Le procédé, qui repose sur la détection des véhicules électriques lors de leur transfert à travers un pore de taille nanométrique, est relativement rapide, suffit l'utilisation de petits volumes d'échantillon et ne nécessite pas le purfication et de la concentration de véhicules électriques. Échantillons Suivant le protocole de fonctionnement normal une approche alternative est décrit en utilisant dopés avec des billes de polystyrène de taille et de concentration connue. Cette technique en temps réel d'étalonnage peut être utilisée pour surmonter les difficultés techniques rencontrées lors de la mesure VE directement dans les fluides biologiques.

Introduction

Les vésicules d'origine cellulaire sont très abondants dans les fluides corporels ^1. Ces vésicules dites extracellulaires (VE) (50 - 1 000 nm de taille) sont formés soit par fusion des corps multi-vésiculaires avec la membrane cellulaire ou vers l'extérieur par bourgeonnement direct de la membrane cellulaire. Au cours des dernières années, l'intérêt scientifique dans les véhicules électriques a considérablement augmenté, ce qui entraîne une pléthore de publications EV-concentré, dans lequel les nouvelles fonctions et les caractéristiques des véhicules électriques sont décrits ^1. VE sont maintenant soupçonnés d'être impliqués dans un large éventail de processus physiologiques et pathologiques tels que la transduction du signal, la régulation immunitaire, et la coagulation du sang ^1-4. Dans le cancer, les véhicules électriques semblent jouer un rôle dans la formation de niches prémétastatique ^5,6, le transfert de pro-cancéreuse contenu ^7,8 et la stimulation de l'angiogenèse ^8. En outre, les véhicules électriques sont explorées comme agents d'exécution d'agents thérapeutiques ^9.

Malgré ces dedéveloppements, la quantification fiable des véhicules électriques reste difficile. Traditionnellement, les méthodes de quantification indirects sont utilisés, qui repose sur la quantification de la teneur en protéines totales ou des protéines spécifiques. Bien que largement utilisé, ces techniques ne tiennent pas compte des différences de protéines par-EV, et ne discriminent pas entre la contamination des agrégats de protéines et de protéines dans les véhicules électriques. En outre, ces techniques nécessitent l'isolement des véhicules électriques, qui dans bien des cas rend la comparaison des concentrations de EV dans des échantillons biologiques impossible.

Par conséquent, des efforts sont entrepris pour développer de nouvelles méthodes qui permettent de mesurer EV plus précise et directe ^10. Ce rapport décrit l'utilisation d'accordable détection d'impulsion résistive (de permis de séjour temporaire) pour la quantification fiable et la taille profilage des véhicules électriques.

Actuellement, la qNano instrument (Figure 1a) est la seule plate-forme disponible dans le commerce pour les points sensibles. Dans les points sensibles, une membrane élastique non-conducteur ponctué wie un pore nanométrique est séparant deux cellules du liquide. L'une des cellules du liquide est rempli avec l'échantillon d'intérêt, tandis que l'autre cellule est remplie d'électrolyte exempte de particules. En appliquant une tension, un flux / courant électrique ionique est établi, qui est modifié lors du transfert des particules à travers les pores (Figure 1b). L'ampleur de ce blocage de courant ('d'impulsion résistive') est proportionnelle au volume de la particule ¹¹ (figure 1c). La durée de blocage peut être utilisé pour évaluer le potentiel zêta de particules, qui s'appuie sur les caractéristiques des particules telles que la charge ou de la forme ^12. Taille des particules de profilage inconnu peut être effectuée en comparant les impulsions de résistifs provoqués par les particules inconnues avec les impulsions de résistifs provoqués par des particules d'étalonnage d'un diamètre connu. En plus de la grandeur d'un événement de blocage, le taux de celles-ci qui se produisent est mesurée. Ce taux de comptage relies sur la concentration des particules. Comme la concentration et la vitesse de blocages sont linéairement proportionnel ^13, à l'aide d'un seul échantillon d'étalonnage avec une concentration connue de particules et la taille des particules permet la mesure de la concentration ¹⁴ et la distribution de taille ¹¹ d'un échantillon inconnu.

Le mouvement des particules à travers le nanopore est déterminée par les forces électro kinetic- (électrophorèse et électro-osmotique) et fluidiques ^15. En utilisant le module de pression variable (VPM) une différence de pression de fluide entre les cellules peut être induite en tant que force supplémentaire. En appliquant une pression positive augmente le taux de particules de flux, ce qui peut être bénéfique lorsque la concentration en particules est faible. En outre, la pression peut être appliquée pour réduire l'effet des forces électro-cinétique. Ceci est particulièrement important lors de l'utilisation des nanopores par rapport à un diamètre de pores de petite taille (NP100, NP150 et NP200 éventuellement) le plus souvent utilisé pour la détection de véhicules électriques.Pour ces nanopores, même en appliquant une forte pression, les forces électro-cinétique peuvent, en fonction de la charge de surface des particules, rester non négligeable ^16. En mesurant le taux de particules à plusieurs pressions, un électro-cinétique corrigée, et par conséquent plus précis, la concentration EV peut être calculé.

Ici, les protocoles détaillés sont fournis pour déterminer la distribution de la taille et de la concentration de véhicules électriques. Suivant le protocole de fonctionnement normal, une autre approche est décrite où les échantillons sont dopés avec des billes de polystyrène de la taille et de la concentration ¹⁷ connue. Cette technique de calibration en temps réel peut être utilisée pour surmonter certaines des difficultés techniques rencontrées lors de la mesure VE directement dans les fluides biologiques, tels que l'urine, le plasma et le surnageant de culture cellulaire, ou lorsque la stabilité du nanopore pendant une longue période de temps de mesure ne peut pas être assurée.

Protocol

1 Protocole d'exploitation standard

1.1 Configuration de l'instrument et la préparation d'échantillons

1. Connecter l'appareil à un ordinateur avec le logiciel Control Suite Izon installé.
2. Choisissez la taille de nanopores à utiliser: pour la taille et la concentration mesure des véhicules électriques une NP150 (cible gamme de taille de 85 à 300 nm) ou NP200 (fourchette cible de la taille de 100 à 400 nm) sont le plus souvent utilisés. Lorsque vous travaillez avec des véhicules électriques qui ont été isolés en utilisant un protocole qui consiste en l'ablation des grandes véhicules électriques, par exemple en faisant passer l'échantillon à travers un filtre de 220 nm, un pore de NP100 (cible de gamme de taille de 70 à 200 nm) peut être utilisé. Lorsque vous travaillez avec des véhicules électriques dans un échantillon biologique ou les véhicules électriques isolés en utilisant un protocole différent, le NP200 peut être utilisé, car il se boucher moins souvent. Autres nanopores comme le NP300 (fourchette cible de la taille de 150 à 600 nm) ou le NP400 (fourchette cible de la taille de 200 à 800 nm), ou encore plus nanopores, peuvent être utilisés pour les grands types de véhicules électriques.
3. Choisissez le calibr de polystyrèneparticules ation qui complètent le nanopores sélectionné à l'étape 1.1.2. Pour une NP100, NP150 et NP200 nanopores utilisent le CPC100, particules CP100 et CPC200, respectivement. Pour une estimation précise de la taille, de sorte que les particules d'étalonnage ont une taille similaire à celle des particules inconnues.
4. Pour assurer l'homogénéité des particules d'étalonnage, de vortex brièvement (30 s). Eventuellement, appliquer ultrasons pour éliminer les agrégats.
5. Diluer les particules d'étalonnage dans du PBS à la concentration de la cible dans un volume d'au moins 40 pi. Remarque: La concentration de la cible varie en fonction du nanopore sélectionné à l'étape 1.1.2. Concentrations cibles sont fournis avec les nanopores.
6. Appliquer et à retirer directement 78 pi de PBS sur la cellule fluide inférieure; ce mouillage de la cellule de fluide inférieure réduit le risque de formation de bulles d'air sous la nanopore lors de l'application d'un électrolyte à la cellule de plus faible lorsque le fluide est en position nanopore.
7. Placez le nanopores sur les 4 bras de l'instrument. Utilisationles étriers numériques pour mesurer la distance entre deux bras opposés et entrer la distance en mm dans le champ de saisie "Stretch" et cliquez sur "calibrer stretch" pour calibrer le tronçon de nanopores.
8. Étirez le nanopores à 47 mm, en tournant la molette de côté et ainsi d'augmenter la distance entre les bras opposés de l'instrument, avant de remettre 78 pi de PBS à la cellule de fluide inférieure.
   Remarque: Les interférences électriques peut considérablement influencer la qualité des mesures. Lorsque vous utilisez un ordinateur portable pour exécuter le logiciel Control Suite Izon, assurez-vous que l'ordinateur portable est connecté au réseau électrique en utilisant une prise de courant et prise de terre. Les téléphones portables tenus à proximité de l'instrument peut également être une source d'interférences électriques. Les interférences électriques est observé que les pics constamment répétées dans le courant de base, souvent avec la moyenne quadratique (RMS) bruit> 10 pA.
   Remarque: Presque tout tampon peut être utilisé pour diluer les particules d'étalonnage et les véhicules électriques de PST tytion. La présence de sels est une condition préalable pour l'établissement d'un courant électrique. Pour les mesures de EV utiliser comme un tampon PBS. particules d'étalonnage doivent toujours être dilués dans le même tampon que les véhicules électriques afin d'assurer des mesures précises.

1.2. Déterminer les réglages optimaux pour la mesure

Remarque: Avant l'enregistrement, il est important de définir les paramètres optimaux de mesure. L'ampleur de blocage provoquée par une particule passant à travers le nanopore est fonction de l'étirement appliqué et la tension appliquée. Pour des mesures fiables du bruit RMS doit être <10 pA et le blocus ampleur de mode doit être> 0,1 nA.

1. Placez la cellule fluide supérieur et de la cage de blindage sur la nanopores et introduire 40 pi de particules d'étalonnage dilués dans la cellule fluide supérieure. Utilisez le VPM à appliquer ≥0.8 pression positive kPa.
2. Réduire le tronçon appliquée lentement vers 44 mm tandis que l'analyse des événements de blocus causés par l'étalonnageparticules. Remarque: Lors de la réduction du diamètre des pores le mouvement des particules à travers le nanopore aura moins de chance et donc le taux de particules diminue. Toutefois, en raison de l'augmentation relative du blocage des pores d'un événement de blocage supérieure, se traduit par un meilleur rapport signal-sur-bruit. L'augmentation de la tension peut en outre augmenter l'ampleur de blocus, mais peut également augmenter le bruit RMS.
3. Réduire l'étirement jusqu'à ce que les événements de blocus appropriées (Figure 1c) sont observées dans le panneau "Signal Trace". (> 0,1 nA Mode) et le taux de particules correspondant est> 100 / min. Note: Le taux de particules est une coupure moins strict, mais comme des mesures d'au moins 500 particules sont idéales, les taux de <100 / min de particules entraînera l'enregistrement des durées d'au moins 5 min. des taux plus élevés de 2000 / min de particules peuvent entraîner des mesures moins précises (si elle est présente, la dilution des échantillons doit être effectuée).

1.3 Mesure de l'étalonnageParticules, laver de la cellule fluide Uper et évaluation échantillon

1. Dans cette section, les véhicules électriques à partir du surnageant de culture de cellules de glioblastome multiforme la lignée cellulaire U87-MG / EGFRvIII sont caractérisés. L'isolement et la préparation de ces véhicules électriques a été précédemment décrits et visualisé ^18.
2. Placez les particules d'étalonnage de la cellule fluide supérieure. Appliquer une pression (par exemple 0,8 kPa) en utilisant le VPM et records> 500 particules.
3. Si l'exécution d'une mesure multi-pression, augmenter la pression appliquée (par exemple à 1,0 kPa) et enregistrer un second fichier de calibration. Note: Un minimum de 0,2 kPa différence est nécessaire.
4. Enlever l'échantillon de calibration de la cellule de fluide supérieur. Laver la cellule fluide supérieure 3 fois avec 100 pi de PBS pour éliminer les particules résiduelles. Avant l'introduction de l'échantillon dans la cellule fluide supérieure, utiliser un tissu non pelucheux pour enlever toute PBS résiduelle de la cellule fluide supérieure.
5. Introduire l'échantillon dans la cellule de fluide supérieur. Assurez-vous que le courant de référence est à moins de 3% du courant de base observé lors de la mesure des particules d'étalonnage. Si ce n'est pas moins de 3%, appliquer la stratégie décrite ci-dessous pour stabiliser le courant de référence. Appliquer les pressions exactes appliquée aux particules d'étalonnage et d'enregistrer les fichiers d'exemples.
   Remarque: L'intrigue de taux de particules doit afficher la détection de particules constant (Figure 2a). En cas d'interruption soudaine de la détection des particules, une baisse soudaine du courant de base, ou une augmentation soudaine de bruit RMS, le pore peut être obstrué; ainsi, interrompre l'enregistrement. Afin de rétablir la ligne de base, appuyez sur ou tordre le capuchon de protection, appliquer le piston, ou supprimer complètement la nanopores et le laver avec de l'eau déminéralisée et le remplacer sur l'instrument.
   Remarque: En variante, augmenter l'étirement de nanopores à 47 mm en combinaison avec la pression maximale de VPM pendant environ 5 min.

Analyse des données 1.4

1. Cliquez sur "; Analyser onglet Données »pour entrer dans la section d'analyse du logiciel. Traiter l'étalonnage et des exemples de fichiers par un clic droit sur le "Fichiers non transformés" et en sélectionnant "Traiter les fichiers".
2. Cochez la case à côté de l'échantillon dans la colonne "calibré" pour joindre les fichiers d'exemple pour les enregistrements d'étalonnage. Sélectionnez les fichiers d'exemples et d'étalonnage correspondantes et cliquez sur "OK". Remarque: lorsque vous utilisez l'option d'étalonnage multi-pression sélectionnez l'onglet "Calibration multi-pression" sur la gauche pour quelques échantillons multiples à plusieurs fichiers de calibration.
3. Une fois couplé avec succès, le logiciel Control Suite Izon affiche caractéristiques de l'échantillon différents, tels que la taille de distribution (Figure 2b), les durées de référence, largeur à mi-hauteur (LMH) et une analyse de la concentration. En option: Pour chaque échantillon, les points de données individuels peuvent être exportés sous forme de virgule fichier séparé.

2.Protocole LTERNATIVE - Dopage échantillons avec perles d 'étalonnage

Remarque: En général, la procédure d'exploitation standard peut être utilisé lorsque vous travaillez avec des véhicules électriques isolés. Lorsque vous travaillez avec des véhicules électriques non isolées dans des échantillons biologiques, ou des préparations EV isolés contaminés avec de grands agrégats de protéines, d'utiliser l'appareil peut être difficile. Ces problèmes consistent essentiellement en un taux élevé de blocage des nanopores (chute soudaine du courant de base), l'incapacité à récupérer les courants de base à moins de 3% de la mesure de calibrage ou de différences significatives dans les taux de particules entre des échantillons identiques (Figure 3a). Pour les échantillons présentant ces difficultés un protocole alternatif pour quantifier les véhicules électriques a été mis au point ^17. Cette méthode repose sur l'introduction de grandes perles de polystyrène d'étalonnage dans l'échantillon d'intérêt (figure 3b). Une procédure détaillée pour ce protocole alternatif est discuté ci-dessous.

2.1. ÉchantillonPréparation

Remarque: Lors de la préparation des échantillons par la méthode alternative, il est souhaitable d'établir un rapport EV-à-goutte de l'ordre de 1 En outre, il est essentiel d'inclure une "perle de calibration uniquement 'échantillon, afin de permettre' gating 'précise de l' perles d'étalonnage et pour déterminer le nombre de particules de référence (par exemple des agrégats de protéines) présentes dans la mémoire tampon.

1. Centrifugeuse 100 pi de surnageant de culture cellulaire pour 7 min à 300 xg
2. Ajouter 20 pi de surnageant de 20 pi de PBS et 10 ul de 75 heures diluée 335 billes de polystyrène (nm magasin 7e10 / ml).

2.2. Mesure de l'échantillon

1. Utilisez la stratégie décrite dans la section 1.2 afin de déterminer les paramètres optimaux de l'appareil.
2. Mesure de la "bille de calibration uniquement 'échantillon de la première. Assurez-vous que le fond de la détection de petites particules non-talon est aussi faible que possible (<10% de billes).
3. Mesurez chaque individu sample une fois avant l'enregistrement reproduit afin de distribuer des fluctuations dans les conditions de nanopores de façon égale sur les différents échantillons. Mesurer au moins 3 répétitions de chaque échantillon.
4. Mesurer l 'perle d'étalonnage que' échantillon après avoir terminé l'enregistrement de tous les échantillons.

2.3. Analyse des données

Remarque: Lorsque vous utilisez le protocole alternatif, l'utilisation exclusive du logiciel Control Suite Izon ne suffit pas pour le calcul de la concentration. Tableur supplémentaire est nécessaire. Tableau 1 montre un exemple de calcul de la concentration des échantillons représentés sur la figure 3.

1. Ouvrez le «talon d'étalonnage seulement» un ou plusieurs fichiers d'exemples échantillon et.
2. Déterminer qui blocus cas la taille (en nA) peut être utilisé comme une coupure de distinction entre les véhicules électriques et des billes de polystyrène. La détermination de la valeur de blocage (NA) correspondant à la base à gauche de la population de billes de polystyrène ( Figure 3b). Remarque: S'assurer que le réglage égal des bin-tailles de toutes les mesures (pouvant être ajustée dans «ViewSettings» qui est accessible en cliquant sur le bouton "pop-up" en dessous "blocus Trace individuelle").
3. Récupérer les valeurs de nombre total de particules pour chaque échantillon en cliquant sur l'onglet «Analyse de particules Résumé" de l'échantillon.
4. Filtrer les ensembles de données en utilisant le niveau de seuil déterminé à l'étape 2.3.2. en sélectionnant le "Filtrage des données" pop-up. Affichage des particules que plus petite que la coupure.
5. Récupérer les valeurs de nombre de EV pour chaque échantillon de la «Analyse sommaire des particules".
6. Soustraire la quantité de véhicules électriques à partir de particules totales pour déterminer la quantité de billes de calibration.
7. Déterminer le ratio EV-à-perle en divisant le nombre de EV par nombre calibrage de perles.
8. Déterminer le rapport de fond moyen la moyenne des rapports déterminés pour chacun d'# 8220; perle que «échantillon de calibration. Soustraire cette valeur de chaque échantillon.
9. Multipliez le ratio EV-à-perle ajustée par la concentration de billes de calibration pour déterminer la concentration de véhicules électriques pour chaque échantillon.
10. Multiplier la concentration mesurée dans l'étape 2.3.9 par le facteur de dilution EV introduit par l'addition de billes d'étalonnage pour l'échantillon de EV. Remarque: Dans la configuration exemple de l'échantillon, la dilution totale de l'échantillon dans du PBS et billes de calibration est de 2,5 fois et donc la concentration mesurée dans l'étape 2.3.9 doit être multipliée par 2,5 pour déterminer la concentration de l'échantillon EV brut.
11. Calculer des statistiques telles que les moyennes, écart-type et l'erreur standard de la moyenne pour chaque groupe de répétitions.
    Remarque: dans certains cas, les chevauchements entre les véhicules électriques et des billes de polystyrène dopés est observée. Si la correction de la sous-estimation de la concentration EV est nécessaire, les échantillons sans billes de polystyrène dopés devraient également être mesurés. Utilisez la même CUToff comme déterminé à l'étape 2.3.2 pour déterminer un rapport "bourrelet à-EV", pour calculer le ratio de véhicules électriques qui tombent dans la gamme de billes de polystyrène dopés. Ce ratio bourrelet à-EV devrait être ajouté au rapport EV-à-goutte déterminée à l'étape 2.3.8.

2.4. Facultatif: EV Distribution de la taille avec la méthode alternative.

1. Ouvrez un enregistrement de l'échantillon deux fois dans la Suite Logiciel de contrôle.
2. Définissez les options de filtrage de l'un des échantillons à seulement particules d'affichage plus grande que le seuil déterminé ci-dessus. Cela permet d'afficher les particules d'étalonnage seulement.
3. Mettre l'échantillon filtré à "fichier de calibration" et entrez la taille de mode de billes de calibration.
4. Couple le fichier de l'échantillon et le "fichier de calibration" créé à l'étape 2.4.3 comme décrit au point 1.4.2. L'exemple de fichier affiche maintenant une distribution de taille des deux véhicules électriques et billes de calibration basée sur des billes de calibration dopés.
   Remarque: L'opéra normeprotocole ting sera le plus souvent suffisante pour la détermination de la taille distributions de véhicules électriques. Parfois, cependant, les composants exacts de mémoire tampon ne sont pas connus (par exemple dans le plasma ou l'urine) qui fait qu'il est impossible de préparer un échantillon de perles d'étalonnage dans le même tampon que les véhicules électriques d'intérêt. Un échantillon d'EV dopés avec des particules d'étalonnage peut être utilisé pour EV taille-estimation dans ces conditions particulières.

Results

Pour utiliser l'instrument des points sensibles, un nanopores non conducteur doit être placé sur les quatre bras de la machine (figure 1a) et une tension (figure 1b) doit être appliqué. Une fois qu'un courant électrique de référence est établie, des impulsions de résistifs provoqués par des particules qui passent à travers le pore sera détecté comme illustré sur la figure 1c.

VE ont été purifiés à partir du surnageant de culture cellulaire de la lignée cellulaire de glioblastome U87-MG / EGFRvIII par ultracentrifugation. Une particule taux parcelle stable est observée lorsque l'on mesure les véhicules électriques isolés (Figure 2a) sur un nanopores NP100. Cette particule taux parcelle stable est nécessaire pour une mesure de la concentration de EV fiable. Après le couplage d'enregistrement EV-échantillon pour un enregistrement de 115 nm perles de polystyrène d'étalonnage, une distribution de la taille (figure 2B) et estimation de la concentration de l'IL-échantillon peut être obtenu (données non présentées).

(Figrue 3a). Il en résulte inexactes estimations de concentrations d'exposition. Par dopage de l'échantillon avec des billes de polystyrène de taille et concentration connue, un ratio EV-à-goutte peut être déterminée. Figure 3b illustre les résultats obtenus après enrichissement du surnageant de culture cellulaire avec des billes de polystyrène de 335 nm. Deux populations claires sont observées. Les particules induisant un blocage de moins de 0,46 nA VE sont déterminées, les particules les plus grosses sont déterminées billes de polystyrène. Le rapport entre les véhicules électriques à des billes de polystyrène est utilisée pour calculer la concentration brute de véhicules électriques (tableau 1). Figure 3C illustre l'estimation de la taille des deux populations basées sur les perles de polystyrène à pointes. Le re de configuration utilisé nanoporeconsultés dans la détection de véhicules électriques> 140 nm. Ceci peut être réduit en réduisant l'ouverture de nanopores, mais cela va aussi donner lieu à des événements plus colmatage.

Figure 1: instrument qNano et mode de fonctionnement. (A) Photographie de l'instrument. Un nanopore est positionnée sur l'instrument, la séparation d'une cellule de fluide inférieure d'une cellule de fluide supérieur. Les cellules du liquide sont protégés contre les interférences électriques de l'environnement par le capuchon de protection. (B) Illustration décrivant accordable détection d'impulsion résistive (PST). Un nanopore élastique non-conducteur est de séparer deux cellules de fluide. En appliquant une tension d'un courant électrique est établi à travers le pore percé dans le nanopore. Comme vésicules extracellulaires se déplacent à travers le nanopore, le flux ionique est modifiée et détecté comme une impulsion résistive. Dans les points sensibles de la taille de l'ouverture de la nanopore peut être ajustée (réduite ou accrue) en étirant le nanopore en augmentant la distance entre les bras opposés de l'instrument, ou la réduction de cette distance (C). Exemple illustratif d'impulsions résistives. L'ampleur d'une impulsion unique résistive est proportionnelle au volume de la particule. Grandes impulsions indiquent des particules plus grosses S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: particules compter parcelle et distribution en taille obtenue à partir de la mesure de véhicules électriques isolés à partir de U87-MG / EGFRvIII surnageant de culture de cellules (A) de particules compter parcelle indiquant la détection globale des particules constant.. Brève réduction de particle détection a été observée entre 80 et 100 secondes de l'enregistrement. Après une pause l'enregistrement et en appuyant sur ​​le capuchon de protection, le taux de particules stabilisé après lequel l'enregistrement a été repris. (B) La distribution de la taille des véhicules électriques isolés est tracée après calibrage de l'échantillon inconnu (VE) à 115 nm perles de calibrage de polystyrène. (5 nm taille de la poubelle). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Les PST quantification des véhicules électriques dans le surnageant de culture cellulaire utilisant le protocole alternatif. (A) typiques des parcelles de particules taux obtenus lors de la mesure véhicules électriques directement dans un fluide biologique. L'obstruction des pores provoque de brèves interruptions et les fluctuations du taux de détection des particules. Chaqueparcelle représente une mesure de la répétition du même échantillon. graphes (b) trois répliquée de distribution de taille obtenue après enrichissement du surnageant de culture cellulaire à 335 nm perles d'étalonnage de polystyrène. Toutes les particules induisant une impulsion résistive inférieure à 0,46 nA sont choisis comme VE. (C) Les billes de polystyrène à pointes peuvent être utilisées pour obtenir une distribution de taille de l'échantillon. (5 nm taille de la poubelle). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Mesures	L'étalonnage ne ​​# 1	L'étalonnage ne ​​# 2	Le surnageant ° 1	Le surnageant # 2	Le surnageant # 3
Courant moyen (nA)	117	120	116	118	120
taux de particules	172	194	250	246	196
coupure utilisée (nA)	0,46	0,46	0,46	0,46	0,46
Nombre de particules	303	317	489	488	454
Vésicules extracellulaires	3	1	213	215	213
Billes de calibration à pointes	300	316	276	273	241
VE / billes de calibration	0,01	0,003	0,772	0,788	0,884
Exemple - fond			0,765	0.781	0,877
Vésicules Extracelullar (10 7) / Ml			7.14	7.29	8.18
2.5x de l'échantillon dilué
VE de concentration Raw (10 7) / ml			17.85	18.22	20,46

Tableau 1:. Exemple de calcul de concentration EV en utilisant le protocole de remplacement Une valeur de coupure est déterminée à distinguer les véhicules électriques à partir de perles d'étalonnage. Par la suite, le nombre total de véhicules électriques et de perles peut être récupéré. Pour chaque mesure, le ratio EV-à-bille est calculé. La quantité de particules de base dans l'électrolyte (par exemple des agrégats de protéines) est calculé en faisant la moyenne du ratio IL-à-goutte pour les mesures individuelles de la «perles d'étalonnage uniquement 'échantillon. Pour chaque échantillon, le taux d'arrière-plan est soustrait du rapport obtenu. Cette Adjusterapport de d est multiplié par la concentration des billes d'étalonnage de l'échantillon (dans cet exemple: 9.33e7 / ml). Pour déterminer la concentration brute de véhicules électriques, la concentration obtenue est multipliée par le facteur de dilution totale des véhicules électriques (dans cet exemple: 2,5).

Discussion

Les protocoles décrits dans cette offre manuscrits méthodologies de quantification et de caractérisation granulométrique des véhicules électriques à l'aide de points sensibles. Les principaux avantages de la plate-forme les points sensibles sont la petite taille de l'échantillon, la durée de mesure relative courte et l'absence de manipulation de l'échantillon nécessaire.

Pré-requis pour la mesure de précision les points sensibles est de maintenir des conditions identiques entre étalonnage et mesures d'échantillons. Cela comprend l'utilisation de tampons identiques ainsi que les paramètres d'instruments identiques, tels que la taille de nanopores, la tension et la pression appliquée. Le manque de VPM originale d'un mécanisme de réglage précis de la pression appliquée, ce qui provoque de légères différences de pression appliquée entre les échantillons. De plus, l'évaporation du fluide d'amorçage dans la VPM peut induire des différences mineures de la pression lors de la mesure à différents points dans le temps et le VPM doit donc souvent être ré-amorçage. Ces limitations ont potentiellement été résolu par l'introduction de la VPM2, quia une mise à l'échelle en fonction de clic et est basée sur la pression de l'air.

Le protocole alternatif décrit dans ce manuscrit est particulièrement adapté pour la mesure des véhicules électriques dans des échantillons biologiques purifiés non ^17. Nous pensons que les composants tampons, tels que des sucres, des lipides, des protéines et d'autres débris plus grande, dans certains cas, peut influencer les conditions de mesure trop pour le protocole standard pour être applicable. Ajout de billes de calibration de l'échantillon plutôt que de comparer deux mesures distinctes introduit «vrai étalonnage de l'heure». Cette méthode est particulièrement appropriée lorsque l'on compare les échantillons (par exemple du plasma sanguin de donneurs différents) qui ont différents et / ou le contenu d'arrière-plan inconnu fluidiques. Bien que des différences existent entre les véhicules électriques et les particules de polystyrène (densité de particules par exemple, et de charge de surface), les modèles théoriques et les données expérimentales souligner la facilité d'utilisation de billes de polystyrène pour la quantification et la taille profilage des véhicules électriques,sous la condition que la pression importante appliquée à ^15,19. Afin de minimiser l'influence des forces électrocinétiques, l'utilisation de la relativement plus NP150 / NP200 nanopores et pression positive significative est conseillé.

Véhicules électriques et billes de calibration se distinguent par la taille. Par conséquent, le nanopore doit être ouvert par l'application d'étirage, à un diamètre de détection où les véhicules électriques et les grandes particules d'étalonnage est observée. Depuis l'ouverture du pore diminue la sensibilité à l'égard des particules plus petites, ne EVS supérieure à une certaine taille sont enregistrées (souvent les véhicules électriques> 120 nm en utilisant un étalonnage perle 335 nm). La limite de détection pour les véhicules électriques peut être réduite à environ 90 nm, en utilisant 203 billes de calibration nm sur un nanopores NP150. Toutefois, cette configuration peut être viable lorsque de plus grandes voitures électriques induisent colmatage fréquent des nanopores. La présence de ces véhicules électriques obstruction peut forcer l'utilisation d'une configuration où une population de véhicules électriques, trop petit pour reach le seuil de détection, ne sera pas détecté.

La difficulté à faire fonctionner le système augmente en essayant de mesurer les particules plus petites que 100 nm. Dans de tels cas, la détection peut être améliorée en augmentant la concentration en sel de l'électrolyte. Une concentration d'ions accrue va induire une augmentation relative des grandeurs de blocus pour les petites particules (ratio plus grand signal-sur-bruit). La viabilité de cette technique pour les mesures de véhicules électriques doit être validé même si, comme l'augmentation des concentrations de sel peuvent influencer le volume des véhicules électriques.

En conclusion, la plate-forme de permis de séjour temporaire peut être utilisé pour la quantification directe et caractérisation granulométrique des véhicules électriques. Comme aucun isolement ou de manipulation EV (anticorps de marquage fluorescent ou de liaison) est nécessaire, la plate-forme est adapté à la quantification EV directe dans des fluides biologiques. Un protocole alternatif est fourni qui peut être bénéfique pour des échantillons où les composants du tampon induisent importante de pores clogginévénements g, ce qui rend l'utilisation fiable du protocole standard viable.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qNano instrument	Izon Science Ltd.	N/A
Module à pression variable	Izon Science Ltd.	N/A
Nanopore	Izon Science Ltd.	NP100, NP200	Le choix du nanopore varie en fonction de la particule cible. Différents nanopores sont disponibles pour différentes tailles de cibles.
Étalonnage des particules	Izon Science Ltd.	CPC100, CPC200, CPC400	sont disponibles en différentes tailles.
Bain de sonication	Plusieurs disponibles		bain de sonication de base est suffisant
(Mini) vortexer	Plusieurs tissus disponibles
Sans ascenseur	Plusieurs disponibles
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Plusieurs
Izon Control Suite 2.2	Izon Science Ltd.	N/A
Tableur	Plusieurs disponibles	N/A