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Article de méthode

L'utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l'évaluation des réponses des cellules T

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DOI :

10.3791/51627

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19 juin 2014

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, John Curtin School of Medical Research, Australian National University

Dans cet article

Résumé

La capacité de surveiller les réponses des cellules T en détail in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire. Nous décrivons ici l'utilisation de réseaux de cibles fluorescentes (ALE) dans un test in vivo de cellules T en évaluant> 250 paramètres simultanément par cytométrie de flux.

Résumé

La capacité de surveiller les réponses des lymphocytes T in vivo est importante pour le développement de la compréhension de la réponse immunitaire et les immunothérapies. Nous décrivons ici l'utilisation de la matrice cible fluorescente (ALE) de la technologie, qui utilise des colorants vitaux tels que l'ester carboxyfluoroscéine succinimidylique (CFSE), laser violet colorants excitables (CellTrace Violet: CTV) et laser rouge colorants excitables (prolifération cellulaire Dye eFluor 670: DPC ) à combinatoire lymphocytes de souris d'étiquettes dans> 250 discernables amas de cellules fluorescentes. amas de cellules au sein de ces ALE peuvent être puisées avec majeur d'histocompatibilité (CMH) des peptides de liaison de classe I et du CMH de classe II et ainsi agir comme cellules cibles pour CD8 + et les cellules T CD4 +, respectivement. Ces cellules ALE restent viables et entièrement fonctionnel, et peuvent donc être administrés à des souris pour permettre l'évaluation de CD8 + T meurtre à médiation cellulaire des cellules cibles de l'ALE et T CD4 + hel médité cellulairep B de FTA cellules cibles des cellules en temps réel in vivo par cytométrie de flux. Depuis> 250 cellules cibles peuvent être évaluées à la fois, la technique permet la surveillance des réponses des lymphocytes T contre plusieurs épitopes antigéniques à plusieurs concentrations, et dans de multiples répétitions. En tant que tel, la technique permet de mesurer les réponses des lymphocytes T à la fois quantitative (par exemple, l'ampleur cumulée de la réponse) et un (avidité fonctionnelle par exemple. Épitope et-réactivité croisée de la réponse) qualitative niveau. Ici, nous décrivons comment ces ALE sont construits et donnent un exemple de la manière dont ils peuvent être appliqués afin d'évaluer les réponses des cellules T induites par un vaccin contre le virus de la variole recombinant.

Introduction

Lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative et sont souvent la cible de la manipulation dans l'immunothérapie. Cellules CD4 + T effecteurs répondent à un antigène étranger en sécrétant des cytokines qui régulent de nombreux aspects de l'immunité et peuvent aussi aider directement les cellules B à fabriquer des anticorps. Cellules T cytotoxiques CD8 + (CTL) peuvent également répondre à un antigène étranger en sécrétant des cytokines ainsi que de jouer un rôle central à tuer directement les cellules exprimant un antigène étranger. L'interaction fondamentale qui initie ces fonctions effectrices des cellules T implique l'interaction du récepteur de lymphocyte T (TCR) avec des peptides étrangers présentés sur les molécules du CMH à la surface des cellules. Cellules T CD4 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe II sur les cellules présentatrices de l'antigène et des cellules T CD8 + reconnaissent peptides présentés sur les molécules du CMH de classe I qui sont habituellement affichées sur les cellules microbiennes infectés.

Pourafin d'évaluer le rôle des cellules T jouent dans une réponse immunitaire, il est indispensable que leurs fonctions effectrices sont mesurées par des techniques fiables et sensibles. Des méthodes communes pour l'évaluation de la réponse T cellulaire comprennent; CMH class-I/II/peptide tétramère réactivité; la production de cytokine par ELISPOT et coloration des cytokines intracellulaires; et tuant capacité de 51 Cr-tests de libération. Ces tests, cependant, sont généralement effectuées ex vivo avec une stimulation in vitro, ou donnent un aperçu limité dans la fonction des cellules T. Idéalement, lorsque l'on mesure les réponses des cellules T, il serait bénéfique pour les évaluer in situ, in vivo, car ils se produisent, sans aucune manipulation de cellules T de manière à éviter des changements dans les paramètres de fonctionnement qui peuvent se produire par la stimulation in vitro. Parmi les plus couramment utilisés in vivo de cellules T des tests fonctionnels sont basées sur la mesure de meurtre CTL médiée par les cellules cibles marquées avec des peptides du CMH de classe I-contraignantes, qui sont énumérés in vivovia leur détection par marquage fluorescent avec des colorants vitaux tels que CFSE. Bien que ces types d'essais peuvent surveiller meurtre CTL médiation de cibles quand ils se produisent in vivo, ils ont déjà eu une capacité relativement limitée pour évaluer assassinat de cibles multiples présentant différentes concentrations et différents types d'épitopes peptidiques, qui est nécessaire pour permettre paramètres qualitatifs tels avidité fonctionnelle et comme variante de l'épitope de réactivité croisée à évaluer. Ces essais ne fournissent pas d'informations sur les réponses à médiation cellulaire T CD4 +.

Pour surmonter bon nombre des difficultés avec les méthodes actuelles utilisées pour évaluer les réponses des lymphocytes T, nous avons récemment mis au point un test multiplex sur la base de tableaux fluorescentes cibles (ALE), qui permet le suivi des réponses des lymphocytes T contre> 250 cellules cibles simultanément dans un animal par la cytométrie de flux 1, 2. ALE sont constitués de lymphocytes marqués par sevconcentrations et combinaisons sieurs de colorants vitaux comme CFSE, CTV et DPC permettant> 250 groupes de cellules de fluorescence unique à être générés. Étant donné que ces cellules restent viables et totalement fonctionnel, elles peuvent être injectées dans des animaux pour permettre la surveillance de leur interaction avec les cellules in vivo 3 T effectrices. Par exemple, les agrégats de cellules ALE peuvent être puisées avec des peptides de classe I du CMH de liaison pour permettre une évaluation de la mise à mort médiée par des CTL spécifiques de l'antigène des cellules cibles 1. En outre, les agrégats de cellules d'ALE peut également être puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant, ce qui permet l'évaluation de spécifique cellulaire de l'antigène T auxiliaire (T H) de l'activité par l'évaluation de l'activation (par évaluation des marqueurs d'activation tels que CD69, CD44 et / ou CD62L) des cellules B dans l'ALE portant peptide apparenté 2. Depuis plus de 250 cibles peuvent être détectés simultanément, il est possible de mesurer de CTL et T H réponses contre de nombreux amas de cellules cibles puisées avec npeptides ombreux à différentes concentrations et l'inclusion de nombreux répétitions. Le test FTA fournit donc un niveau de T effecteur cellulaire évaluation de la réponse in vivo sans précédent.

Ici, nous décrivons en détail la construction d'un ALE et montrons comment ils peuvent être appliqués à l'évaluation des réponses des lymphocytes T in vivo. Le mode opératoire décrit la construction d'un FTA composé de 252 groupes de cellules discernables par l'utilisation de trois colorants vitaux, composés de six répétitions de 42 groupes de cellules puisées avec des peptides de liaison II-CMH de classe I et. L'étiquetage des 42 groupes de cellules se produit dans 10 ml conique à fond des tubes et il est utile de prévoir ceux-ci dans un porte-tube, comme décrit dans le Tableau 1. Cette méthode peut être ajustée pour un plus petit nombre de grappes discernables au besoin, en réduisant la quantité d'étiquetage de chaque colorant a effectué 1.

Nous soulignons l'utilité de l'analyse en montrant comment il peut mesurer responsabes générés par la vaccination poxvirus recombinant contre plusieurs épitopes dans une petite cohorte de souris. Ceci montre comment le dosage ALE peut être utilisée pour mesurer les réponses cumulatives et avidité fonctionnelle par le biais, respectivement, l'utilisation de l'aire sous la courbe (AUC) et les évaluations mesure de la concentration de peptide efficace nécessaire pour générer des réponses maximales moitié (CE 50).

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Protocole

Remarque: Les souris utilisées en vertu du présent protocole ont été traitées conformément aux directives du Comité d'éthique expérimentation animale Australian National University et les souris ont été euthanasiés par dislocation cervicale.

1. Dye et Peptide Préparation

  1. préparation de colorant
    Remarque: Les colorants sont pré-dilués à différentes concentrations pour permettre l'étiquetage des cellules à des intensités de fluorescence discrets. CFSE est utilisé à sept concentrations effectués par des dilutions en série de 3,5 fois, et CTV et CPD sont utilisés à six concentrations différentes faites par des dilutions en série 3,7 fois (voir les tableaux 2-4). Les actions des concentrations de colorants énumérés dans les tableaux 2-4 seront utilisés pour marquer les cellules cibles à des concentrations de colorant finales figurant dans les tableaux 2-4. Colorants réagissent lors de l'exposition à la solution aqueuse. Il est donc important que les flacons soient équilibrés à température ambiante avant de l'ouvrir pour minimiser l'exposition des colorants à condensation.
    1. CFSE
      Remarque: CFSE est acheté sous forme d'ester diacétate de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFDA, SE; MW 557,47), généralement à 25 mg / flacon.
      1. Reprendre 25 mg de CFSE dans 4,48 ml de DMSO pour obtenir une solution mère à 10 mM.
      2. Série diluer CFSE: Ajouter 35 ul de 10 mM CFSE actions dans 87,5 ul de DMSO et répéter ce avec une solution d'achat d'actions dilué pour donner à chaque concentration de colorant dans le tableau 3.
    2. CTV
      Remarque: CTV est généralement acheté en paquets de 9 flacons, dont chacun peut être reconstitué avec 10 pl de DMSO pour produire une solution à 10 mM du colorant.
      1. Reconstituer et mettre en commun tous les 9 flacons de CTV avec 90 ul de DMSO pour donner une solution à 10 mM.
      2. Série diluer CTV: Ajouter 11 ul de 10 mM CTV actions dans 29,7 ul de DMSO et répéter ce avec une solution d'achat d'actions dilué pour donner à chaque concentration de colorant dans le tableau 2.
    3. DPC
      Remarque: CPD (MW 792,6) est typiquement acheté que 0,5 mg / flacon.
      1. Remettre en suspension 0,5 mg de CPD dans 63 ml de DMSO pour obtenir une solution à 10 mM.
      2. Série diluer CPD: Ajouter 11 ul de 10 mM CPD actions dans 29,7 ul de DMSO et répéter ce avec une solution d'achat d'actions dilué pour donner à chaque concentration de colorant dans le tableau 4.
        Remarque: les stocks de teinture peuvent être conservés à -20 ° C pendant plusieurs mois et peuvent être décongelés et recongelés plusieurs fois sans perte significative de la fonction.
  2. préparation d'un peptide
    Remarque: Les peptides du CMH de classe I de liaison sont généralement utilisés pour pulser des cellules cibles à 6 concentrations différentes réalisés en utilisant 10 dilutions d'un facteur à partir d'une concentration de départ de 1 pM (tableau 5). CMH de classe II-peptides de liaison sont généralement utilisés pour pulser des cellules cibles à 6 concentrations différentes réalisés en utilisant trois dilutions à partir d'une concentration de départ de 400 pM (tableau 5). Chaque peptide est effectué à une concentration finale de 2 x dans du PBS telle that chaque concentration de peptide a un volume minimum de 250 ul. stocks de peptides peuvent être préparés avant la construction FTA et stockés à -20 ° C sans perte significative de la fonction.
    1. Peptides préparation actions CMH de classe I contraignants
    2. Préparer la plus forte concentration de chaque épitope peptidique 2 solutions uM d'actions (2x 1 uM)
    3. Diluer en série peptides de classe-I-liaison du CMH: ajouter 44,4 ul de 2 uM peptide solution stock dans 400 pi de PBS. Répétez cette opération avec la solution mère diluée pour donner à chaque concentration de peptide dans le tableau 5.
    4. Peptides préparation actions CMH de classe II contraignants
    5. Préparer la plus forte concentration de chaque épitope peptidique à 800 um solutions mères (2x 400 uM).
    6. Diluer en série du CMH de classe II peptides de liaison: ajouter 150 ul de solution de peptide 800 uM dans 300 pi de PBS. Répétez cette opération avec la solution mère diluée pour donner à chaque concentration de peptide dans le tableau 5 .

2. Préparation ALE

Remarque: la procédure ci-dessous décrit la construction d'un FTA composé de cellules puisées avec 7 épitopes peptidiques différents à six concentrations différentes (c.-à-42 clusters cellulaires. Répétées 6 fois) pour générer des amas de cellules 252 discernables. Dans chaque répétition, un amas de cellules non marquées avec une épitope (Nil), est inclus en tant que témoin. Il est utile pour les ALE pour CD45 ont une différence de allotype à partir d'animaux hôtes pour permettre leur discrimination de cellules receveuses par marquage de l'anticorps au moment de l'analyse. Sinon ALE peut être marqué avec d'autres colorants tels que PKH-26 à cet effet (décrit à l'étape 2.6). En règle générale, la procédure de préparation ALE est réalisée de bout en bout au cours d'une séance.

  1. Étiquette 42, 10 ml à fond conique des tubes en plastique de 1 à 42 (comme dans le tableau 1, par exemple).
  2. Préparation de cellules
    1. Isoler la rate et / ou lymphnodes de souris. Préparer seule suspension de cellules provenant de tissus de brassage à travers un tamis de 70 um à pores avec un piston de seringue de 5 ml et compter les cellules en utilisant un hématimètre.
    2. Reprendre lymphocytes jusqu'à 200 x 10 6 cellules / ml dans 11,5 ml de Rochester Park Memorial Institute 1640 (RPMI, ou équivalent) contenant 5% de sérum de veau foetal (SVF). Remarque: il est important d'utiliser un tampon à haute teneur en amine à minimiser la toxicité pour les cellules de colorant 3.
  3. Étiquetage CTV
    Note: Les cellules sont d'abord marquées avec 6 concentrations de CTV.
    1. Remettre en suspension les cellules à fond en renversant le tube plusieurs fois. Ajouter 1,9 ml de suspension cellulaire à 6 des tubes de 10 ml étiquetés 37-42, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes.
    2. Pour marquer les cellules avec CTV, retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    3. Ajouter 83 pi de PBS à la partie non mouillée au sommet du tube, et à cette ajouter 17 ul d'actions CTV (voir Table 2 pour lesquels la solution mère est affectée à ce tube). Remarque: un tube non mouillée est important pour empêcher un mouvement de suspension de cellules et mélange prématuré de la solution de cellules avec la solution de colorant.
    4. Boucher le tube et mélanger la suspension de cellules avec le colorant rapidement et complètement par vortex.
    5. Répétez les étapes 2.3.2-2.3.4 pour les solutions de stockage de CTV dans les tubes désignés décrits dans le tableau 2.
    6. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante (20 ° C).
  4. Étiquetage CFSE
    1. Après marquage CTV, ajouter 5 ml de milieu RPMI contenant 5% de FCS dans chaque tube et remettre en suspension les cellules à fond au vortex.
      1. De tube 37 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 31, 25, 19, 13, 7 et 1.
      2. De tube 38 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 32, 26, 20, 14, 8 et 2.
      3. De tube 39 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 33, 27, 21, 15, 9 et 3.
      4. De 40 tubes de transfert de 1 ml de cellulessuspension à tubes 34, 28, 22, 16, 10, et 4.
      5. De tube 41 de transfert de 1 ml de suspension cellulaire aux tubes 35, 29, 23, 17, 11, et 5.
      6. De tube 42 transfert 1 ml de suspension de cellules dans des tubes de 36, 30, 24, 18, 12, et 6
        Remarque: Prenez soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes au cours des étapes 2.4.1.1-2.4.1.6.
    2. Pour marquer les cellules avec CFSE, retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    3. Ajouter 103 ml de PBS à la partie non mouillée au sommet du tube, et à ce module 7 ml de stock CFSE (voir le tableau 3 pour lesquels la solution mère est affectée à ce tube).
    4. Boucher le tube et mélanger la suspension de cellules avec le colorant rapidement et complètement par vortex.
    5. Avez étapes 2.4.2-2.4.4 pour les solutions de stockage de CFSE dans les tubes désignés décrits dans le Tableau 3.
    6. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante (20 ° C).
    7. Laver les cellules: Diluer la suspension cellulaire avec 9 ml de 20 ° CRPMI contenant 5% de FCS, les sédiments par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 20 ° C et enlever les surnageants par aspiration avec une pipette de transfert.
  5. Peptide pulsation et le lavage des cellules
    Remarque: Après que les cellules ont été marquées avec CTV et CFSE, ils sont puisées avec des peptides de liaison (préparé en 1.2) du CMH de classe I et / ou du CMH de classe II. Un des populations de cellules doivent également pas être puisées avec le peptide (par exemple. Nil dans le tableau 1) et utilisé comme contrôle négatif pour le calcul des réponses des lymphocytes T.
    1. Peptide pulsation
      1. Resuspendre les cellules dans un volume total de 250 pi de milieu RPMI contenant 5% de FCS. Remarque: En général 50 pi de suspension cellulaire reste après aspiration du surnageant à la fin de l'étape 2.4.7, donc ajouter 200 ul de milieu à la cellule pastille.
      2. Ajouter 250 ul de stocks de pré peptidiques préparés (comme dans le tableau 5) à tubes désignée de manière appropriée (comme dans le tableau 1) et être sure pour inclure un tube de commande de PBS ajouté seul sans peptide comme un contrôle Néant.
      3. Mélanger des suspensions de cellules avec un vortex. Remarque: Il est essentiel que chaque épitope peptidique et chaque concentration de peptide est affecté à un seul tube et ce de noter clairement sur ​​la base de la fluorescence attendue des cellules dans ce tube, depuis la signature de fluorescence de cette grappe définira ce peptide (comme dans le tableau 1 par exemple).
      4. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure.
    2. Cellule à laver
      1. Ajouter 5 ml de la glace froide (4 ° C) du milieu RPMI contenant 5% de FCS à la suspension de cellules et remettre les cellules en inversant le tube. Sous-tendait soigneusement la suspension de cellules avec 3 ml de glace froide (4 ° C) de SVF.
      2. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Utiliser l'accélération et le freinage lent pour assurer l'interface de FCS et de la solution de suspension de cellules est maintenue.
      3. Aspirer soigneusement le RPMI puisles FCS avec une pipette de transfert, en laissant les culots cellulaires lavés non perturbé. Remarque: L'utilisation d'une sous-couche de FCS pour laver les cellules permet d'assurer la solution de peptide est éliminé autant de cellules que possible et en limitant ainsi l'exposition de populations de cellules à de multiples peptides libres lorsque les cellules sont mises en commun.
      4. Laver les cellules encore: Remettre en suspension les culots cellulaires dans 10 ml de 4 ° C du milieu RPMI contenant 5% de FCS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Décanter les surnageants.
      5. Piscine toutes les populations de cellules ensemble dans un seul tube avec une pipette en utilisant 6 ml de 4 ° C RPMI contenant 5% de FCS. Sédiments cellules réunies par centrifugation à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette de transfert.
  6. DPC étiquetage portable
    Remarque: A ce stade, six répétitions intra dosage peuvent être générés par les cellules puisées étiquetage peptidiques avec 6 concentrations différentes de DPC.
    1. Ajouter 11,4 ml de 20 ° CRPMI contenant 5% de FCS pour le culot cellulaire et remettre en suspension soigneusement mis en commun à l'aide d'une pipette.
    2. Ajouter 1,9 ml de suspension cellulaire à 6, 10 ml tubes étiquetés AF, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure des tubes.
    3. Pour marquer les cellules CPD, retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    4. Ajouter 92 pi de PBS à la partie non mouillée au sommet du tube, et à cette ajouter le bouillon DPC (voir le tableau 4 pour la quantité de solution mère attribué à chaque tube).
    5. Boucher le tube et mélanger la suspension de cellules avec le colorant rapidement et complètement par vortex.
    6. . Ne pas 2.6.3-2.6.5 pour les solutions de stockage de CPD dans les tubes désignés décrits dans le Tableau 4 Note: Contrairement CFSE et CTV, la concentration de l'étiquetage de CPD n'est pas précisément une relation linéaire entre l'intensité de la fluorescence résultant de cellules marquées, et de sorte que la concentration de l'étiquetage utilisé pour obtenir des pics fluorescents équidistants de plusieurs populations marquées a étédéterminée empiriquement (voir tableau 4).
    7. Incuber les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante (20 ° C).
    8. Laver les cellules deux fois: Remettre en suspension les cellules à 10 ml avec du milieu RPMI à 20 ° C contenant 5% de FCS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette de transfert. Répétez.
    9. Piscine toutes les cellules ensemble dans un seul tube en utilisant 8 ml 4 ° C RPMI contenant 5% de FCS avec une pipette. Sédiments cellules rassemblées par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C et aspirer le surnageant avec une pipette de transfert.
  7. (Facultatif) PKH-26 étiquetage portable
    Remarque: Si ALE ne peut pas être réalisé avec des cellules exprimant une différence allotypique CD45 pour accueillir des souris, ils peuvent être marqués avec PKH-26 afin de permettre leur discrimination à partir des cellules receveuses.
    1. Ajouter 2,9 ml de PBS à 20 ° C au culot de cellules et remettre en suspension regroupée soigneusement avec une pipette.
    2. Ajouter la suspension cellulaire à un pas d'n mouillée tube de 10 ml, en prenant soin de ne pas mouiller la moitié supérieure du tube.
    3. Retirez le bouchon du tube et jeter le tube horizontalement.
    4. Ajouter 58 ul de diluant C (dans le kit de teinture PKH-26) à la partie non mouillée au sommet du tube, et à cette ajouter 42 ul de 1 mM PKH-26.
    5. Boucher le tube et mélanger la solution de cellules avec le colorant soigneusement au vortex.
    6. Incuber les cellules pendant au moins 10 min à température ambiante (20 ° C).
    7. Laver les cellules deux fois: Remettre en suspension les cellules à 10 ml avec du milieu RPMI à 20 ° C contenant 5% de FCS. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 20 ° C. Aspirer le surnageant avec une pipette de transfert. Répétez.
  8. L'injection ALE en animaux d'accueil
    Remarque: Pour mesurer les réponses des cellules T in vivo, les ALE sont injectées dans les animaux qui ont une réponse immunitaire active et laissé en place jusqu'à 24 h. Il est essentiel que les ALE sont également injectés dans un animal naïf comme contrôle négatif.
    1. Compter et remettre les cellules à 2,5 x 10 8 cellules par ml dans du PBS. Injecter 200 ul de cellules par voie intraveineuse à des souris de l'hôte, y compris un animal naïf comme témoin.

3. Cytométrie en flux

  1. 18-24 heures après l'injection ALE récolte du sang ou de la rate (ou d'autres tissus d'intérêt) de souris hôtes.
  2. Préparer une suspension cellulaire unique à partir de tissus en écrasant à travers un tamis de 70 um pores avec une seringue de 5 ml plongeur.
  3. Remettre en suspension les cellules jusqu'à 65 x 10 6 cellules / ml dans du PBS contenant 0,1% de BSA.
  4. Distribuer des aliquotes de 100 pl de suspension cellulaire dans les puits d'une microplaque de titration pour le marquage de l'anticorps.
  5. cellules d'étiquetage avec fluorochrome anticorps marqués et les sondes de viabilité fluorescents à fluorescence spectrale compatible avec CFSE, CTV et DPC. Remarque: Les anticorps à des marqueurs de cellules B tels que le B220 et les marqueurs d'activation tels que CD69 est essentiel de mesurer l'activation des cellules B, si à l'aide du FTUn de mesurer les réponses des cellules T H 2. Inclure un anticorps à CD45.1 et / ou CD45.2 si les ALE et les souris hôtes aient une différence allotypique CD45.
  6. Ajouter 100 ul de 2x solution stock de colorants anticorps / de viabilité (dans du PBS contenant 0,1% de BSA) à 100 aliquotes de cellules, bien mélanger et incuber sur de la glace (4 ° C) pendant 30 min.
  7. Laver les cellules: les cellules de sédiments par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et enlever le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS contenant 0,1% de BSA, les cellules du sédiment par centrifugation à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  8. Resuspendre les cellules dans un volume total de 400 ul de PBS contenant 0,1% de BSA, les cellules de filtrage à travers une maille de 70 pm et d'analyse par cytométrie de flux dans un cytomètre en flux capable de détecter les colorants fluorescents et des conjugués concernés. Gagner jusqu'à 3 x 10 6 événements de lymphocytes afin de résoudre chaque grappe de cellules ALE et gagner suffisamment de cellules pour statistiquementanalyse cal. Remarque: S'assurer que tous les contrôles typiques (tels que les contrôles colorées simples) pour cytométrie de flux sont employés. Typiquement, CFSE nécessite une excitation provenant d'une source laser bleu (typiquement à 488 nm) et de détection avec des filtres passe-bande centré sur 520 nm; CTV nécessite d'excitation provenant d'une source laser violet (typiquement à 405 nm) et de détection avec des filtres passe-bande centré sur 450 nm; et CPD nécessite une excitation à partir d'une source laser rouge (typiquement à 633 nm ou 640 nm) et de détection avec des filtres passe-bande centré sur 670 nm.

4. Analyse des données

  1. Analyser cytométrie de flux de données en utilisant un logiciel de cytométrie de flux standard (voir le résultat représentant un exemple du type de stratégie de déclenchement indépendants).
  2. Pour la destruction spécifique de%, calculer le nombre de cellules dans chaque groupe de cellules ALE pulsé avec des peptides de classe-I-liaison du CMH et les grappes de libre-échange qui n'ont pas été puisées peptide («Néant») et en utilisant la formule suivante pour calculer% Destruction spécifique.
    % Destruction spécifique figure-protocol-1
    Note: Dans la formule ci-dessus «apprêté» fait référence à des cibles d'animaux qui sont considérés comme ayant une réponse immunitaire contre les peptides cibles, "naïf" désigne des cibles provenant d'animaux naïfs, «peptide» se réfère à des cibles puisées avec des peptides et des "nil" se réfère à des cibles non puisées avec des peptides.
  3. Pour l'activation des cellules B en tant que mesure de l'activité de T H, calculer la moyenne géométrique intensité de fluorescence (GMFI) de CD69 anticorps par fluorescence sur des cellules FTA B puisées avec des peptides du CMH de classe II se liant à des animaux "prime" et à partir de cette soustraire la GMFI d' expression de CD69 sur les cellules B ALE correspondants chez les animaux «naïves» pour donner une mesure de l'activité T H.
  4. D'après les statistiques générées dans les étapes 4.2 et 4.3, l'utilisationtableur mathématique comme GraphPad Prism pour calculer d'autres paramètres quantitatifs et qualitatifs tels que la surface sous la courbe et CE 50 (une description approfondie de la façon dont ces calculs sont effectués pour l'ASC peut être trouvé à
    http://graphpad.com/guides/prism/6/statistics/index.htm?stat_area_under_the_curve.htm, et pour EC50: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/curve-fitting/index. htm? reg_the_ec50.htm).

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Résultats

A titre d'exemple de l'utilisation du dosage FTA, une souris BALB / c a été immunisée avec un virus recombinant de la vaccine (VV) exprimant des épitopes du VIH-I (VV-VIH) et les réponses aux épitopes du VIH-I CTL, Gag, mut Gag, Env et Pol, la VV CTL épitopes F2L et F2L mut, et l'épitope du VIH-I T H, Gag Th (comme décrit en 2) ont été évalués à l'aide d'un paramètre 252 ALE essai (figure 1B). variantes d'épitopes de Gag (mut Gag) et F2L (F2L mut) ne sont pa...

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Discussion

L'avantage de tests basés sur l'ALE est qu'elles permettent la discrimination de> 250 populations de cellules cibles viable et pleinement fonctionnel à partir d'un seul animal hôte par cytométrie de flux. Cela fournit un niveau de complexité vivo découler des essais in base cytométrie qui n'a pas été possible avant. Cela est mis en évidence dans les deux expériences sur les animaux indiqués ci-dessus, où les réponses à 7 épitopes viraux distincts à 6 concentrations pourraient êtr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions du projet # 1010395 (BQ et CP) et # 525431 (CR), et un programme de subventions # 455395 (CP) du Conseil de recherches en santé et médical national de l'Australie, un Centre australien pour l'hépatite et le VIH Virologie EOI 2012 subvention (CR et JJR) et une subvention de la Fondation Gordon Bouvier et Gretel (BQ et CR). Nous tenons à remercier Harpreet Vohra et Michael Devoy pour leur excellent entretien du laboratoire JCSMR FACS, le Fonds australien Cancer Research Foundation biomoléculaire ressources, JCSMR, ANU, pour la synthèse peptidique, et le Dr David Boyle, CSIRO animaux laboratoires de santé, Geelong, Australie pour fournir les mères VIH stocks de vaccins.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RPMISigmaR8758
Sérum de veau fœtalSeranaFCS-500
CTVInvitrogenC34557
CFDA, SEInvitrogenC1157
CPDeBioscience65-0840-90
anti-B220 PerCp-Cy5.5eBioscience110730
anti-CD69 violet brillant 605Biolegend104529
PKH-26SigmaPKH26GL-1KT
VortexScientific Industries Inc
CentrifugeuseEppendorf
Cytomètre en flux (Fortessa ou équivalent avec source laser bleue, rouge et violette)BD Bioscience

Références

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