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Article de méthode

Développement d'une varicelle-zona immunité à médiation cellulaire spécifique-Virus IFN-γ ELISPOT pour évaluer la suite de cordon ombilical transplantation de sang

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DOI :

10.3791/51643

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9 juillet 2014

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1Unité d'Immunopathologie Virale, Centre de Recherche du CHU Sainte-Justine, Department of Microbiology, Infectiology & Immunology, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 2Infectious Diseases Service, CHU Sainte-Justine, Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Paediatrics, Université de Montréal

Dans cet article

Résumé

Générations nouveaux de dosages fonctionnels, tels que l'interféron gamma (IFN-γ) ELISpot, qui détecte la production de cytokines au niveau de la cellule unique et fournissent à la fois la caractérisation quantitative et qualitative des réponses des cellules T peuvent être utilisés pour évaluer les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre la varicelle zoster virus (VZV).

Résumé

Virus varicelle-zona (VZV) est une cause importante de morbidité et de mortalité à la suite ombilical transplantation de sang de cordon (UCBT). Pour cette raison, la prophylaxie anti-herpétique est administré systématiquement aux bénéficiaires UCBT pédiatriques pour prévenir les complications associées à l'infection VZV, mais il n'existe aucune preuve fondée sur le consensus solide, qui définit sa durée optimale. Parce T immunité à médiation cellulaire est responsable du contrôle de l'infection VZV, l'évaluation de la reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV suivante UCBT pourrait fournir des indications quant à la prophylaxie doivent être maintenues ou peuvent être interrompues. A cette fin, un interféron gamma spécifique VZV (IFN-γ) immunospot lié à une enzyme (ELISPOT) a été développée pour caractériser la production d'IFN-γ par les lymphocytes T en réponse à une stimulation in vitro avec le vaccin contre VZV vivant atténué irradié. Ce test fournit une mesure rapide, reproductible et sensible du VZV c spécifiqueell immunité approprié pour la surveillance de la reconstitution de l'immunité spécifique VZV dans un environnement clinique et d'évaluation de la réponse immunitaire aux antigènes de VZV médiation.

Introduction

Tout d'abord effectuée en 1989, UCBT est de plus en plus utilisé dans le cadre du traitement de différentes maladies du sang néoplasiques et non néoplasiques chez les enfants de 1. Le VZV est un alphaherpèsvirus humaine cytopathique qui provoque deux maladies différentes, la varicelle (après l'infection primaire) et l'herpès zoster (après réactivation). Après l'infection primaire, le VZV persiste tout au long de la vie de l'hôte à l'abri dans les nerfs sensoriels de ganglions rachidiens. Une des complications infectieuses les plus menaçants suivants UCBT est associé à VZV 2-4. Dans notre centre clinique, en l'absence de prophylaxie VZV, l'incidence cumulative de la maladie VZV maladie de VZV à 3 ans était de 46% postUCBT 2. Chez ces patients, l'infection de novo avec ou réactivation du VZV est souvent associée à la diffusion viscérale pour le système nerveux central, les poumons et le foie 5-7. En prophylaxie résultat, l'acyclovir, le valacyclovir ou le famciclovir est couramment administré à UBBénéficiaires CT 8,9. Cependant, cette stratégie de traitement ne prend pas en compte le potentiel de protection de lymphocytes T spécifiques de VZV ou la cinétique de reconstitution des réponses des lymphocytes T spécifiques de VZV. Problèmes potentiels liés à l'utilisation croissante de la prophylaxie anti-herpétiques à long terme comprennent a) surtraitement patient; b) le développement de la résistance aux antiviraux 10,11; et c) la dégradation du VZV reconstitution immunitaire spécifique 12,13. Parce que la détection des lymphocytes T spécifiques fonctionnels VZV est en corrélation avec la présence d'une protection à long terme de l'infection VZV et l'amélioration de l'issue clinique 4,14,15, le suivi des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre le VZV pendant la période post-transplantation pourrait aboutir à une utilisation plus rationnelle des médicaments antiviraux traitement en permettant aux médecins de distinguer les patients qui pourraient bénéficier de la prophylaxie VZV de celles dont le système immunitaire est capable de contrôler la réplication du VZV 4,13.

Le test ELISPOT IFN-γ est largement utilisé pour les réponses immunitaires médiées par des cellules de contrôle dans une variété de systèmes expérimentaux et les conditions cliniques. Taches sont générées suivant le clivage d'un substrat chromogène, la génération d'un précipité visible et stable au niveau du site de la réaction. Chaque spot individu représente ainsi l'empreinte d'une cellule de cytokine production individuelle. IFN-γ ELISpot non seulement mesure la capacité des cellules individuelles ex vivo pour produire de l'IFN-γ en réponse à une stimulation in vitro avec l'antigène apparenté, mais il fournit également une estimation de la fréquence de la réponse des cellules dans une population cellulaire donnée 16,17. En plus de sa grande sensibilité, l'IFN-γ ELISpot est simple à effectuer, ce qui rend son utilisation possible dans le cadre de protocoles cliniques personnalisés destinés à guider l'initiation ou l'arrêt du traitement antiviral. La procédure décrite ci-dessous décrivantes un test ELISpot qui est spécifiquement conçu pour détecter et mesurer la production d'IFN-γ par les cellules mononucléaires du sang périphérique après stimulation in vitro avec des antigènes dérivés du VZV.

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Protocole

Ce protocole de recherche a été approuvé par le Conseil du CHU Sainte-Justine, Montréal, Québec, Canada, où l'étude a été menée institutionnelle d'évaluation éthique. Le consentement éclairé a été demandé et obtenu de tous les participants à l'étude, leurs parents ou tuteurs légaux. Toutes les procédures effectuées aux jours 1 et 2 doivent être effectuées dans des conditions stériles (c'est à dire sous une hotte à flux laminaire). Les procédures de sécurité standard pour la manipulation du sang humain doivent être strictement respectées.

1. Revêtement des plaques

  1. Perméabiliser le polyfluorure de vinylidène (PVDF) des membranes en bas de 96 puits MultiScreen IP plaques ELISpot blanc en ajoutant à chaque puits 20 ul d'éthanol à 35% pendant 1 min. Membranes devraient être légèrement translucide.
  2. Laver immédiatement les puits 3 fois avec 200 pi de 1x tampon phosphate salin (PBS; mM NaCl 137 mM, KCl 2,7, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) en utilisant un multichannel pipette ou un dispositif similaire. Cette étape est essentielle dans la mesure où les résidus d'éthanol peuvent affecter la viabilité des cellules et la liaison de l'anticorps de capture. Plaques ELISpot sont fragiles et doivent être manipulés avec soin: l'utilisation d'un laveur de plaques automatique n'est pas recommandée.
  3. Enduire les puits avec 10 pi de souris purifié anticorps de capture d'IFN-γ d'anti-humaine diluée dans 1 x PBS à une concentration finale de 10 pg / ml. Couvrir les plaques avec une pellicule de plastique ordinaire et incuber une nuit à 4 ° C.

2. Plaques de blocage

  1. Vider les puits, en tapant les sécher et laver les plaques 5 fois avec 200 pi de PBS 1x.
  2. Remplir les puits avec 200 pi de milieu RPMI 1640 complet et incuber les plaques pendant 2 heures à 37 ° C (étape de blocage).
  3. Laver les plaques 5x avec 200 pi de PBS 1x et gardent les puits plein de 1x PBS jusqu'à ce que les cellules sont prêtes à être plaqué.

3. Cellule de placage et de stimulation

  1. Préparer peripheral cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir d'échantillons de sang veineux humain par centrifugation sur des gradients de Ficoll-Paque à l'aide de procédures standard. Sinon, en utilisant des méthodes standards, décongeler aliquotes de PBMC congelés dans l'azote liquide. Après centrifugation, les derniers, remettre les cellules à une concentration finale de 2 x 10 6 cellules / ml et incuber une nuit à 37 ° C sous une atmosphère de CO2 à 5% dans un incubateur à chemise d'eau.
  2. Retirer les PBMC de l'incubateur et de les remettre en suspension dans un volume final de 5 ml de milieu RPMI 1640 complet.
  3. Incuber les PBMC en présence de 10 ul de l'endonucléase de génie génétique à partir de Serratia marcescens pendant 5 min à température ambiante.
  4. Supprimer une aliquote de 50 ul de PBMC et mélanger avec 50 pi de colorant bleu trypan. Compter les cellules et estimer% de viabilité en utilisant un hématimètre et l'examen microscopique (méthode d'exclusion de colorant). Divers procédés automatisés pour le comptage des cellules et l'évaluation de la viabilité des cellules can aldonc être utilisé. PBMC doit être> 95% viable. Jeter l'échantillon lorsque la viabilité est inférieure à 95%.
  5. Centrifugeuse PBMC à 700 xg pendant 5 minutes, jeter le surnageant et remettre les cellules dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) de sérum humain inactivé (HIS) à une concentration finale de 2 x 10 6 cellules / ml. Maintenir à 37 ° C jusqu'à ce que des mélanges de stimulation sont ajoutés à la plaque.
  6. Ajouter dans les puits, une goutte à la fois, 100 ul du mélange de stimulation approprié. Trois mélanges de stimulation doivent être utilisées comme décrit ci-dessous:
    1. Utilisez milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) de sérum humain inactivé (IHS) de contrôle négatif.
    2. Utilisation d'anticorps monoclonal anti-CD3 (OKT3 clone) dilué dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) IHS à une concentration finale de 0,5 ug / ml comme contrôle positif).
    3. Utilisez antigène VZV, sous la forme soit de γ-irradiés (10000 Gy; 30 min d'exposition) vaccin vivant atténué VZV (unités formant plaque 1350 [UFP] / ml) de dilutionted 1:200 dans du milieu AIM-V supplémenté avec 2% (v / v) IHS) ou 1 ug d'un mélange équimolaire de 67 peptides (15 résidus d'acides aminés) synthétisé sur la base de la séquence du VZV immédiatement précoce (IE63) phosphoprotéine . Contrôler l'irradiation efficacité en surveillant l'absence de signes visibles d'effets cytopathiques après 4 jours dans les cultures de CMSP.
    4. Préparer tous les puits en double.
  7. Ajouter dans les puits, une goutte à la fois, à 100 ul de cellules préparées à l'étape 5.4 dans les puits appropriés. Deux puits devraient être laissés sans cellules (contrôle négatif). Incuber pendant 20 heures à 37 ° C sous une atmosphère de CO2 à 5% dans un incubateur à chemise d'eau. Ne secouez pas, déplacer ou empiler les plaques l'une sur l'autre pendant l'incubation.

4. Spot de développement et de détection

  1. Jeter les cellules et laver les plaques 10x avec 1x PBS additionné de 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 permet que les cellules ont adhéré au PVDF me détacherMbrane après incubation pendant la nuit.
  2. En utilisant une pipette multicanaux, ajouter 100 ul de 0,5 mg / ml de biotine conjugué à un anticorps monoclonal anti-IFN-γ (4S.B3 clone) dilué dans 1 x PBS contenant 0,5% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA). Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante.
  3. Laver les puits 6x avec du PBST et ajouter dans chaque puits 100 pi de streptavidine conjugatd avec la phosphatase alcaline dilué 1:1000 dans 1x PBS contenant 0,5% (p / v) de BSA. Couvrir et incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante.
  4. Laver les plaques 3 fois avec PBST et 3x avec PBS 1x. Ajouter 100 ul d'un phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP) / nitro bleu de tétrazolium chlorure (NBT) Solution de substrat et incuber 5 minutes à température ambiante.
  5. Laver les plaques sous l'eau distillée. Retirer la partie inférieure de la plaque ELISpot et laver les deux côtés de la membrane avec de l'eau distillée. Air sécher les plaques.
  6. Examiner les puits et énumérer les points à l'aide d'un d stéréoscopiquemicroscope issection ou scanner les plaques à l'aide d'un compteur de point automatique. Garder les assiettes abri de la lumière si elles ne peuvent pas être examinés le même jour.
    1. Calculer la moyenne des nombres de points comptés dans les puits en double correspondantes et soustraire le nombre de spots comptés dans les puits témoins négatifs (pas de cellules) à partir du nombre de points comptés dans les puits de test.
    2. Exprimer la production d'IFN-γ en tant que le nombre d'unités formant des taches (SFU) pour 10 6 CMSP.
    3. Considérez que les échantillons d'essai sont positifs si le nombre de SFU est> 50 10 6 PBMC et 2 déviations standard (SD) au-dessus du contrôle négatif (cellules + milieu AIM-V complété avec 2% (v / v) IHS).
    4. Utilisez une valeur de 400 SFU par puits lorsque les taches sont trop nombreux pour être comptés.
  7. Tester si les données ELISpot sont normalement distribués ou non à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov. Lorsque les données sont distribuées normalement, effectuer des comparaisons statistiques en utilisant les T-tes de l'étudiantt (2 groupes) ou analyse de la variance et le post-test de Bonferroni (de comparaisons multiples). Si les données ne sont pas distribuées normalement, utiliser le test de Mann-Whitney (2 groupes) ou le test de Kruskal-Wallis et post-test de Dunn (comparaisons multiples).

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Résultats

Le protocole ELISPOT IFN-γ détaillé ci-dessus a été développé et optimisé dans notre laboratoire pour mesurer l'ampleur et la qualité des réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigées contre le VZV 4. Diverses sources d'antigène VZV peuvent être utilisés pour l'étape de stimulation. Il s'agit notamment: a) disponible dans le commerce détergents extraits inactivés du VZV infectés cellules Vero 18; b) les piscines de chevauchement des peptides synthétiques de protéines codées ...

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Discussion

Modifications et dépannage: essais IFN-γ ELISpot ont été utilisées pour examiner les réponses immunitaires à médiation cellulaire dirigée contre une variété de pathogènes microbiens, y compris le type de virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) 24,25, virus de l'hépatite C (VHC) 26, 27, et Mycobacterium tuberculosis 28,29, pour n'en nommer que quelques-uns. Ici, nous avons décrit le développement d'un test ELISPOT IFN-γ pour mesurer l'immunité cellulaire...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les participants de l'étude et de leurs parents. Nous tenons également à remercier le Dr Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montréal, Canada) pour l'accès à son lecteur ELISpot, le Dr Lubo Alexandrov pour l'analyse statistique, et Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois et Martine Caty pour expert technique assistance. Pris en charge par des subventions du Fonds d'opération le Pour Les Projets de recherche clinique et D'évalutation des technologies (CHU Sainte-Justine) à HS et PO, par la Fondation Centre de cancérologie Charles-Bruneau, et par la Leukemia & Lymphoma Society de Canada. ISF a été soutenu par des bourses de la Fondation CHU Sainte-Justine et le Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS). AJG a été le récipiendaire de bourses du Département de microbiologie, infectiologie et d'immunologie de l'Université de Montréal (Bourse Gabriel-Marquis), FRQS, et les Instituts de la santé Recherche du Canada (IRSC). NM a été soutenu par la Fondation CHU Sainte-Justine, la Fondation Cole, et FRQS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de leucocepsVWR89048-936/89048-932Des tubes de 12 ml ou 50 ml peuvent être utilisés en fonction du volume de sang.
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Protéger de la lumière.
Benzonase nucléaseNovagen70746-3Conserver à -20 ° ;C.
MultiScreenHTS-IP Plaque filtranteMilliporeMSIPS4W10stérile avec une taille de pores de 0,45 &m.
Anticorps anti-capture IFN-&gamma ; de sourisBD Biosciences551221clone de NIB42.
Pepmix VZV IE63° ;JPT Peptide TechnologiesPM-VZV-IE63Dissoudre le contenu d’un flacon dans 40 μ ; l du DMSO. Utilisation dans les 6 mois.
Anticorps monoclonal anti-IFN-&gamma conjugué à la biotineBD Biosciences5545504SB3.
Streptavidine conjuguée à la phosphatase alcaline  ;Bio-Rad Life Science170-3554Diluer pour une utilisation le même jour.
BCIP/NBTBio-Rad Life Science170-6432Protéger de la lumière.

Références

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