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Article de méthode

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

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DOI :

10.3791/51647

⸱

19 août 2014

 ,  , 
1Department of Genetics and Biochemistry, Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center

Dans cet article

Résumé

La dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains est difficile à étudier par les techniques traditionnelles de biologie cellulaire telles que la microscopie électronique et la microscopie à fluorescence. Comme moyen d’observer le comportement dynamique des organites, un système rapporteur d’organites fluorescents a été utilisé en conjonction avec la cytométrie en flux pour surveiller la dynamique des glycosomes en temps réel chez les parasites vivants.

Résumé

Trypanosoma brucei est un parasite qui provoque kinétoplastide la trypanosomiase humaine africaine (THA) ou maladie du sommeil, et une maladie débilitante, nagana, chez les bovins 1. Les parasite alterne entre la circulation sanguine de l'hôte mammifère et le vecteur de mouche tsé-tsé. La composition de nombreux organites cellulaires change en réponse à ces différentes conditions extracellulaires 5.2.

Glycosomes sont peroxysomes hautement spécialisées dans laquelle beaucoup des enzymes impliquées dans la glycolyse sont compartimentés. Changements dans la composition glycosome d'une manière intellectuelle et ICPE 4-11. Actuellement, les techniques les plus couramment utilisées pour étudier la dynamique glycosome sont la microscopie électronique et fluorescence; techniques qui coûtent cher, de temps et de main-d'œuvre, et pas facilement adapté à l'analyse à haut débit.

Pour surmonter ces limitations, un système rapporteur fluorescent dans glycosomece qui a renforcé la protéine fluorescente jaune (EYFP) est fusionnée à une séquence de ciblage de peroxysome (PTS2), qui dirige la protéine de fusion à glycosomes 12, a été établi. Lors de l'importation de la protéine de fusion PTS2eYFP, glycosomes deviennent fluorescentes. la dégradation des organites et le recyclage entraîne la perte de la fluorescence qui peut être mesuré par cytométrie de flux. Un grand nombre de cellules (5000 cellules / sec) peuvent être analysées en temps réel avec une préparation de l'échantillon tel que la fixation et le montage. Ce procédé offre un moyen rapide de détection de changements dans la composition d'un organite, en réponse aux fluctuations des conditions ambiantes.

Introduction

Trypanosoma brucei cause la maladie du sommeil en Afrique chez les humains et une maladie débilitante, nagana, chez les bovins. Médicaments utilisés dans le traitement de ces maladies sont vétustes et très toxique, les vaccins ne sont pas disponibles, et le potentiel pour le développement de la résistance aux médicaments nécessitent la recherche de nouvelles cibles de médicaments 1.

Au cours de son cycle de vie, T. brucei, alterne entre un insecte vecteur et hôte mammifère; deux hôtes qui présentent des environnements très différents dans lesquels le parasite doit survivre. Un certain nombre de changements métaboliques et morphologiques se produisent comme le parasite est exposé à des conditions environnementales différentes. Certains des changements les plus importants sont observés dans microbodies spécifiques parasites seule membrane délimitée, appelé glycosomes 13.

Les niveaux de glucose sont relativement élevés (~ 5 mM) dans le sang et la circulation sanguine des parasites (BSF) génèrent ATP exclusivement par wh de la glycolysemétabolisme mitochondrial ile est réprimée 14. Contrairement à d'autres eucaryotes dans laquelle se produit la glycolyse dans le cytoplasme, T. brucei compartimente la plupart des enzymes de la glycolyse dans glycosomes 14,15. Les parasites sont prises par la mouche tsé-tsé au cours d'un repas de sang et connaissent une baisse de la glycémie, qui tombe à des niveaux indétectables dans les 15 minutes d'être ingéré par la mouche. Le métabolisme de l'insecte, de la forme procyclique (PCF), parasites est plus souple et de glucose, ainsi que des acides aminés tels que la proline, peuvent être utilisés dans la synthèse de l'ATP de 16 à 18. Études protéomiques comparatives révèlent les changements du cycle de vie dépendent en glycosomale et protéines mitochondriales avec des protéines glycolytiques augmentation dans la circulation sanguine des parasites et des protéines mitochondriales impliquées dans le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire 13,19. Alors que de nombreuses études ont porté sur les différences entre BSF et glycosomes PCF, on sait peu sur les changements dans glycosomes PCF qui se produisent en réponse à envchangements ironmental.

Dans le gros intestin de la mouche, les niveaux de glucose sont faibles à des augmentations transitoires au cours d'une alimentation 20. Dans la plupart des études in vitro, les parasites PCF sont cultivées dans des milieux contenant du glucose. Cependant, des études récentes ont démontré que les changements du métabolisme PCF significativement en réponse au glucose disponibilité 17. En l'absence de glucose, la proline et la proline absorption augmentation de l'activité déshydrogénase 18. Ce changement dans le métabolisme mitochondrial est probablement accompagnée par un changement de la composition et de la morphologie de glycosome, cependant, ceci n'a pas été directement évalué.

Microscopie électronique et de fluorescence sont des techniques courantes utilisées pour étudier la dynamique de glycosome en T. brucei 2,21-24. Ces protocoles sont le temps et de main-d'œuvre, coûteux et difficiles à adapter aux études en temps réel et des protocoles à haut débit. Pour surmonter cette limitation, un système rapporteur fluorescent u-organitesed pour étudier organites dans les systèmes de mammifères et de levure a été modifié pour une utilisation dans T. brucei 12.

Systèmes rapporteurs fluorescents-organelles ont été largement utilisés dans des eucaryotes supérieurs tels que des levures, des plantes, des cellules de mammifères et de 25 à 27. Dans de tels systèmes, une protéine fluorescente est fusionnée à une séquence d'acides aminés qui cible la protéine à des organites spécifiques. La dégradation ou la synthèse des protéines cibles est mesurée par fluorescence et des changements dans la composition des organites sont reflétés par des changements dans la fluorescence de la cellule.

Lorsque le cadre du renforcement de la protéine fluorescente jaune (EYFP) de lecture ouvert est fusionnée à une séquence de type II de ciblage des peroxysomes (PTS2) 12, la protéine PTS2eYFP est importé dans glycosomes matures, importation compétent et de la fluorescence peut être contrôlé par cytométrie de flux. Les variations de composition glycosome se traduisent par des changements dans la fluorescence cellulaire. Ce système peut aider à résolVing les mécanismes qui régulent les changements induits par l'environnement dans glycosome composition.

Ce manuscrit décrit la génération d'un système glycosome rapporteur dans parasites PCF en collaboration avec la cytométrie de flux pour suivre la dynamique de glycosome en temps réel à des parasites vivants et fournit un exemple de la façon dont il a été utilisé pour suivre l'évolution de glycosome composition en réponse à des environnements différents. En résumé, glycosome composition est influencée par les concentrations de glucose extracellulaire et le passage des cultures en phase logarithmique dans un milieu frais déclenche des changements dans glycosome composition. Ce système peut être modifié pour étudier le comportement dynamique des autres organites dans les trypanosomes et les autres parasites.

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Protocole

1. général trypanosomes élevage

  1. Peser les solides pour la préparation de milieux SDM79 (tableau 1).
  2. Conserver à 4 ° C dans 50 ml conique ou un sac Ziploc. REMARQUE: Les réactifs sont stables pendant au moins 6 mois.
  3. Dégel du sérum de veau fœtal (FBS) dans un bain-marie à 37 °, et mélanger périodiquement par inversion. REMARQUE: FBS est reçue par le fournisseur comme une solution stérile. Filtre stérilisant FBS réduit sa capacité à soutenir la croissance du parasite.
  4. Une fois que la totalité du flacon est décongelé, la chaleur inactiver le sérum pendant 30 min dans un bain-marie à 56 ° C, en mélangeant périodiquement afin de minimiser la précipitation des composants du sérum.
  5. Pénicilline dégel / solution de streptomycine (stylo / angine), hémine (2 mg / ml dans du NaOH 50 mM), et la solution aigle de vitamine milieu de base à la température ambiante.
  6. Pour 1.000 ml graduée, ajouter 20,2 g de matières solides SDM79 (tableau 1) aux composants liquides (tableau 2) et bien mélanger sur une plaque d'agitation.
  7. Ajuster le pH à 7,35, et porter le volume à 850 ml avec de l'eau.
  8. Stériliser par filtration support par la fixation d'un tuyau d'aspiration sur le fond d'une bouteille de filtre. Appliquer le vide jusqu'à ce que la solution est filtrée.
  9. Retirer la partie supérieure du filtre dans l'enceinte de sécurité biologique et ajouter 150 ml d'inactivé par la chaleur de FBS. Enlevez le couvercle de plastique du bouchon stérile et une bouteille de médias d'étanchéité.
  10. Préparer SDM80 support de la même manière que SDM79 avec les exceptions suivantes; ne pas ajouter de glucose ou de la glucosamine et utiliser MEM sans glutamine. A la place de 150 ml de FBS inactivé par la chaleur, ajouter 135 ml de dialyse, de la chaleur de FBS inactivé, et 15 ml de FBS inactivé par la chaleur.
  11. Culture parasites PCF en flacon de 25 cm2 avec 10 ml de milieu approprié à 27 ° C et 5% de CO 2. NOTE: Les cellules doivent être comptabilisés quotidiennement en utilisant un hématimètre ou un cytomètre de flux (voir la section 6) et cultures doivent être maintenues à des densités entre 1 x 10 5 et 5 x 10 6 cellules / ml.

2 Transfection de PCF parasites avec la construction de rapporteur fluorescent

NOTE: Pour suivre glycosome dynamique, une protéine rapporteur contenant la séquence de ciblage des peroxysomes (PTS2) de aldolase fusionnée à la protéine fluorescente jaune améliorée est exprimée dans les parasites. La séquence codant pour la protéine de fusion est clone dans pXS2bla 12, qui contient le promoteur de procycline et les régions intergéniques tubuline, qui recombinaison homologue dans le génome directe et le gène de résistance à la blasticidine de sélection. Lignées cellulaires hébergeant procyclique les gènes codant pour la polymerase T7 et répresseur tetracycline (PF29-13) sont transformées avec la construction de ciblage, pXS2: PTS2eYFP.

  1. Préparer CYTOMIX en mélangeant les composants répertoriés dans le tableau 3. Filtre stériliser et conserver à la température ambiante.
  2. Linéarisation de l'ADN de plasmide avec Mlul par pipetage de 10 ul de l'ADN (1 ug / ul), le tampon d'enzyme de restriction de 5 pi, 33 pi d'eau, et 2 μ; L de MluI enzyme dans un tube à centrifuger. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
  3. Purifier la digestion de restriction en ajoutant 1 volume de tampon de liaison à l'enzyme de digestion de restriction. Mélanger tampon de liaison et l'ADN digéré par vortex. Centrifuger brièvement pour collecter l'échantillon au fond du tube.
  4. Insérer une colonne dans un tube de liaison 2 ml de collecte d'ADN, et le transfert de l'ADN digéré / solution tampon de liaison à la colonne.
  5. Centrifuger 10 000 g pendant 1 min. Après centrifugation, éliminer le filtrat de tube de collecte et de retour à la colonne du tube de collecte.
  6. Ajouter 700 ul de tampon de lavage SPW et centrifuger à 10 000 g pendant 1 min.
  7. Jeter le filtrat à partir de tube de collecte, de retour à la colonne du tube de collecte et répéter SPW étape de lavage et centrifugation.
  8. Filtrat Jeter, colonne de retour au tube de collecte, et centrifugeuse colonne vide pendant 3 min à 10 000 xg pour éliminer l'éthanol résiduel.
  9. Dans une enceinte de sécurité biologique, jeter coltube de collecte et lieu colonne dans un tube à centrifuger stérile.
  10. Pour éluer l'ADN, ajouter 25 ul d'eau stérile à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 10 000 g pendant 1 min.
  11. Ajouter un autre 25 pi d'eau stérile dans la hotte de biosécurité à la colonne et incuber à température ambiante pendant 2 min.
  12. Centrifuger à 10000 vitesse de g pendant 1 min.
  13. Dans une enceinte de biosécurité transférer tout le volume de l'ADN à un nouveau tube stérile. REMARQUE: Cette étape empêche la contamination par le couvercle ouvert pendant la centrifugation.
  14. Ajouter l', purifié, de l'ADN linéarisé stérile (10 mg) à 400 ul de CYTOMIX stérilisée par filtration.
  15. Compter les cellules comme décrit dans l'article 6 et récolter 5 x10 7 -10 8 cellules par centrifugation à 800 g pendant 15 min à température ambiante.
  16. Décanter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 450 pi d'ADN + CYTOMIX utilisant une pipette sérologique de 1 ml.
  17. la solution de transfert contenant CE lls, ADN, et CYTOMIX à un écart de 4 mm cuvette et le lieu cuvette stérile dans la chambre d'électroporation.
  18. Sélectionnez «Décroissance exponentielle" et entrer manuellement les paramètres suivants: tension: 1,5 kV, Capacité: 25 mF, Résistance: Ω, et de la Cuvette: 4 mm. impulsion de presse. Une fois que l'impulsion est terminée, retirez la cuvette de la chambre d'électroporation et revenir à l'enceinte de sécurité biologique.
  19. Dans un nouveau flacon stérile, une pipette 10 ml de SDM79. Transférer les cellules transformées dans le ballon avec 10 ml de SDM79.
  20. Incuber sans sélection de médicaments pendant 24 heures à 27 ° C, 5% CO 2. Après 24 heures, ajouter du G418 (15 ug / ml), l'hygromycine (50 mg / ml), et de la blasticidine (10 ug / ml). Passez 1 ml de cellules transformées avec le médicament dans 9 ml de SDM79 avec la drogue.
  21. Analyser les cellules quotidienne comme décrit dans les sections 6 et 7 Lorsque les cellules sont fluorescentes, et ont atteint une densité cellulaire de 1 x 10 7 / ml, faire stabilats pour le stockage à long terme (3.1-3.3).
ve_title "> 3. Faire stabilats

  1. Pour faire des milieux de congélation, ajouter un volume égal à 100% de glycérol à CYTOMIX et filtre stériliser.
  2. Ajouter 200 ul de milieu de congélation de 800 pi de cellules (1 x 10 7) dans un tube cryogénique, mélanger doucement par inversion et entre deux supports en polystyrène et congeler à -80 ° C.
  3. Une fois congelés (~ 24 h), les cellules de transfert à l'azote liquide. NOTE: Il est important de déplacer des cellules dans LN 2 après 24 h, comme plus de stockage à -80 ° C conduit à une diminution de la viabilité cellulaire.

4. stocks dégel congelés

  1. Retirer flacon congelé entre -80 ° C et décongélation à température ambiante pendant environ 10 min.
  2. Pipette 9 ml de SDM79 avec la drogue dans un nouveau flacon stérile. Ajouter cellules décongelées à ce flacon. Faire passer les cellules 01 heures 10 en ajoutant 1 ml de cette culture à 9 ml de SDM79 dans un nouveau flacon (concentration finale de 1 x 10 5 / ml).
  3. Avant que les cellules atteignent une densité de 10 7 / ml, commencer cytomètre mettreet des dosages de dilution.

5. configuration du cytomètre

  1. Allumez le cytomètre en flux et ouvrir programme cflow Plus. REMARQUE: Avant d'effectuer des échantillons, la fluidique devraient être rincé et rincés selon les étapes 5.2 à 5.7.
  2. Remplacer le tube d'eau nanopure dans lequel la gorgée est enregistrée avec un tube vide.
  3. Sélectionnez le bouton "backflush".
  4. Une fois backflush est terminée, retirez tube de l'gorgée et défausse.
  5. Placez un nouveau tube contenant 1 ml d'eau nouvelle nanopure sur la gorgée.
  6. Sélectionnez un nouveau puits dans le programme cflow. Sous la rubrique «Limites Run" régler le temps pendant 2 min. Sous la rubrique «fluidique», sélectionnez «rapide» et «Run».
  7. Une fois le délai de 2 min est terminée, cliquez sur le bouton "Supprimer des exemples de données".

6 Comptage des cellules en utilisant le cytomètre de flux

  1. Remplacer l'eau par l'échantillon à être compté. Set "Limites Exécuter "pour 30 secondes," Fluidics "à" rapide "puis sélectionnez" Exécuter ".
  2. Après le délai de 30 secondes est terminée, cflow ainsi fournira les événements / ul sous "Last Run." Répétez comptage pour chaque culture. REMARQUE: Avant de cellules atteignent 1 x 10 7 cellules / ml, procéder à essai de dilution. Les cellules doivent être interrompues après un essai de dilution est terminée. Les cellules en culture pendant de plus longues périodes perdent leur capacité à répondre à des conditions environnementales.

7. fluorescence de mesure utilisant le cytomètre de flux

  1. Pour évaluer la fluorescence, réglez «Limites Run" à 10.000 événements, et «fluidique» à «ralentir». Sélectionnez «seuil Set". Sous "Seuil primaire", sélectionnez "éliminer de manière permanente les événements sur», «FSC-H" (dans menu déroulant) et entrez moins de 30.000. Cliquez sur "Appliquer", puis "close".
  2. Sélectionnez l'220; "dans une des nouvelles fenêtres de tracé et sélectionnez" histogramme FSC-A "De la liste déroulante, sélectionnez" FL1-A ". REMARQUE: mesures FL1-A fluorescence dans la longueur d'onde de 530 nm.
  3. Sélectionnez "Exécuter" et répétez l'opération pour toutes les cultures.
  4. Exécuter solution de nettoyage à travers la ligne fluidique pendant 2 min et de l'eau pendant 2 min.

8. dilution dosages

  1. Passez cellules à une densité de 1 x 10 5 cellules / ml dans 3 ml de SDM79 en 25 cm ballon de 2 culture et de mesurer floraison immédiatement après le passage, puis à 3 h et 24 h.

Analyse 9. données

  1. Sélectionnez "Analyser" onglet sur cflow Plus.
  2. Cliquez sur le bouton "Histogramme" sous "Faire une nouvelle parcelle." Sélectionner "FSC-A" et une liste de menu déroulant apparaîtra. Sélectionnez le canal "FL1-A."
  3. Mettez en surbrillance un puits à analyser. Sélectionnez le bouton "Gate", et d'en tirer manuellement une vannepour la population d'intérêt.
  4. Flow Plus fournira cellule "comte" dans cette porte et "% de ce complot".

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Résultats

Dans ce système, un changement dépendant du glucose dans glycosome composition a été observée. Lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux contenant du glucose, deux populations sont observés; un brillant et un faible (figure 2A). Cellules sombres abritent glycosomes immatures, qui ne sont pas importés du PTS2eYFP tandis que les cellules lumineuses abritent un mélange de glycosomes matures et immatures 12. Lorsque le glucose est présent dans les médias, mauvaise localisation des prot...

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Discussion

Glycosomes sont des organites essentiels, dynamiques, spécifiques du parasite. Les processus qui régissent la biogenèse, la maintenance, la prolifération et le remodelage de ces organites sont probablement des cibles de médicaments qui pourraient être exploitées à des fins thérapeutiques. Malgré potentiellement forte abondance de ces cibles de médicaments, le domaine de la glycosome biogenèse a pris du retard l'étude des processus similaires dans d'autres organismes, principalement en raison de l'absence d&#...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le Creative Inquiry Program for Undergraduate Research et le Calhoun Honors College de l’Université de Clemson.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AdénosineAvocado Research Chemicals LtdA10781SDM79 Ingrédient
L-AlanineAvocado Research Chemicals LtdA15804SDM79 Ingrédient
L-ArginineCalBiochem1820SDM79 Ingrédient
Acide p-aminobenzoïqueICN Biomedicals102569SDM79 Ingrédient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)SigmaB6891SDM79 Ingrédient
BiotinFisherBP232-1SDM79 Ingrédient
Chlorure de calciumVWRBDH0224Cytomix
EDTAFisherS311-100Ingrédient
Cytomix EZNA Gel Kit d’extractionOmega BiotekD2500-01Purification de l’ADN
SérumFisherde qualité recherche03-600-511SDM79 Ingrédient
Acide foliqueICN Biomedicals101725SDM79 Ingrédient
Glucosamine HClICN Biomedicals194671SDM79 Ingrédient
GlucoseGIBCO15023-021SDM79 Ingrédient
L-GlutamineCalBiochem3520SDM79 Ingrédient
GlycérolAcros OrganicsAc15892-0010Média de congélation
Graces insecte cell media poudreGIBCO11300-043SDM79 Ingrédient
HeminMP Biomedicals194025SDM79 Ingrédient
GuanosineAvocado Research Chemicals LtdA11328SDM79 Ingrédient
HEPESMP Biomedicals194025SDM79
Ingrédient Chlorurede magnésiumFisherBP214-500Cytomix Ingrédient
L-MéthionineFisherBP388-100SDM79 Ingrédient
MEM Acides aminés (50x)Cellgro25-030-CISDM79 Ingrédient
NEAA Mixture (100x)Lonza13-114ESDM79 Ingrédient
Minimal Essential Medium (1x) avec L-glutamineCellgro10-010-CMSDM79 Ingrédient
MOPSFisherBP308-500SDM79 Ingrédient
Biocarbonate de sodiumFisherS233-500SDM79 Ingrédient
Pénicilline-streptomycine SolutionCellgro30-002-CISDM79 Ingrédient
L-PhénylalanineICN Biomedicals102623SDM79 Ingrédient
Chlorure de potassiumFisherP217-500Cytomix
Ingrédient Phosphate de potassium dibasique anhydreFisheerP290-212Ingrédient du cytomix
L-ProlineFisherBP392-100SDM79 Ingrédient
L-SerineAcros Organics56-45-1SDM79 Ingrédient
Acide pyruvique, sel de sodiumAcros Organics113-24-6SDM79 Ingrédient
L-TaurineTCI AmericaA0295SDM79 Ingrédient
L-ThréonineAcros Organics72-19-5SDM79 Ingrédient
L-TyrosineICN Biomedicals103183SDM79 Ingrédient
E.Z.N.A. Cycle Pure kitOmega BiotekD6492-02Purification de l’ADN
Tampon de liaisonOmega BiotekPDR041
Tampon de lavage SPWOmega BiotekPDR045Purification de l’ADN
Gene Pulser XcellBiorad165-2660 Transformation dutrypanosome
4 mm Cuvettes d’électroporationVWRTransformation du trypanosome
pour la purification de l’ADN

Références

  1. Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
  2. Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
  3. Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
  4. Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
  5. Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
  6. Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
  7. Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
  8. Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
  9. Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
  10. Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
  11. Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
  12. Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
  13. Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
  14. Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
  15. Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
  16. Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
  17. Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
  18. Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
  19. Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
  20. Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
  21. Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
  22. Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
  23. Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
  24. Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
  25. Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
  26. Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
  27. Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
  28. Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).

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