Article de méthode

Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus)

DOI :

10.3791/51648

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6 juin 2014

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1Department of Fisheries & Wildlife, Michigan State University, 2Hammond Bay Biological Station, Great Lakes Science Center, U.S. Geological Survey

Dans cet article

Résumé

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La lamproie marine perdre la vésicule biliaire et des voies biliaires au cours de la métamorphose, un processus similaire à l'atrésie biliaire humaine. Une nouvelle méthode de fixation et de clarification (CLARITY) a été modifié pour visualiser l'ensemble de l'arbre biliaire en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dégénérescence biliaire.

Résumé

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Atrésie des voies biliaires est une maladie rare de l'enfance, avec une fréquence d'environ 1 à 15 000 dans le sud-est des États-Unis, mais plus fréquente dans les pays en Asie de l'Est, avec une fréquence déclarée de 1 à 5000 à Taiwan. Bien que beaucoup est connu au sujet de la gestion de l'atrésie des voies biliaires, sa pathogénie est encore insaisissable. La lamproie marine (Petromyzon marinus) offre une occasion unique d'examiner le mécanisme et la progression de la dégénérescence des voies biliaires. La lamproie marine développer à travers trois étapes de la vie distincts: larves, parasites, et adultes. Lors du passage de larves à des mineurs parasite, la lamproie marine subir la métamorphose de la réorganisation dramatique et le remodelage de la morphologie externe et les organes internes. Dans le foie, l'ensemble du système biliaire est perdu, y compris la vésicule biliaire et des voies biliaires. Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» a été modifié pour clarifier l'ensemble du foie et la jonction avec l'intestin dans métamorphique lamproie marine. Laprocessus de dégénérescence biliaire a été visualisée et discerné lors de la lamproie marine métamorphose en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier atrésie des voies biliaires dans un modèle animal unique.

Introduction

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La lamproie marine se développer à travers trois étapes distinctes vie 1,2. Larvaire lamproie (L) passent plus de temps dans des terriers comme filtreurs benthiques. Après avoir traversé sept étapes métamorphiques de changements dramatiques dans la morphologie externe et la réorganisation des organes internes 3, les mineurs résultant (JV) entrent dans un stade parasitaire au cours de laquelle ils se nourrissent de sang et les liquides tissulaires de poisson hôte, l'augmentation de la masse corporelle de plus de 100 fois . Après 1.0 à 1,5 ans d'alimentation sur le poisson hôte dans l'océan ou les grands lacs, les adultes cessent de s'alimenter au début du printemps et migrent dans les rivières pour frayer et mourir 1,2.

Au cours de métamorphose, le foie de la lamproie marine perd la vésicule biliaire et l'ensemble de l'arbre biliaire, un phénotype mutant évolutif qui imite la maladie infantile humaine atrésie des voies biliaires. Atrésie des voies biliaires infantile est une maladie du foie pédiatrique rare avec de graves complications médicales 4,5,6,7, 8,9,10, mais la pathogénie et l'étiologie de l'atrésie des voies biliaires sont en grande partie inconnus 4. Les patients présentant une atrésie des voies biliaires meurent dans les deux ans après la naissance, sauf si une intervention chirurgicale (procédure Kasai) est effectuée 5. Par la suite, ces patients ont besoin d'une vaste prise en charge clinique et souvent une transplantation du foie 6. De nombreuses théories de l'atrésie des voies biliaires étiopathogenèse ont été proposées, telles que l'infection virale, une malformation congénitale, maladie auto-immune, et insulte toxique. Toutefois, la contribution de chacun à l'élaboration d'atrésie des voies biliaires restent peu concluantes 7,8,9,10.

Contrairement nourrissons qui souffrent atrésie des voies biliaires pathologique, la lamproie marine subir de développement programmé atrésie des voies biliaires sans necroinflammation vaste, fibrose ou de cirrhose 10. Les animaux peuvent souffrir cholestase transitoire pendant ce processus 10, mais s'adapter à cet état ​​de développementpar l'intermédiaire de la synthèse de novo et de la sécrétion de sels biliaires dans l'intestin après l'atrésie biliaire développementale, en plus des mécanismes connus tels que la réduction de la synthèse des sels biliaires dans le foie 11. Ce processus de développement dans la grande lamproie marine fournit la seule occasion connue pour examiner la progression de l'atrésie des voies biliaires.

Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» permet imagerie à haute résolution dans les systèmes nerveux des mammifères complexes en transformant tissu intact dans un hydrogel nanoporeux optiquement transparent 12. Utilisation de la lamproie marine foie et un protocole de CLARITY modifié, l'imagerie des tissus intacts de la dégénérescence biliaire peut être documentée tout au long de la métamorphose du foie.

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Protocole

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Une. Préparation Solution

  1. Faire une L 10x 0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4): Peser 26,2 g de phosphate de sodium (monobasique), 115 g de phosphate de sodium (dibasique), et 87,66 g de NaCl. Dissoudre dans environ 800 ml de H 2 O distillée, ajuster le pH, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
    1. Faire une solution saline L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4): Prendre 100 ml 10x PBS et ajouter 900 ml de H 2 O. distillée
    2. Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate salin (pH 7,4) avec 0,1% de Triton X-100: Prendre 100 ml 10x PBS, ajouter 1 ml de Triton X-100, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
  2. Assurez 1 L 10x 0,1 M tampon phosphate (PB, pH 7,4): Peser 26,2 g de phosphate de sodium (monobasique) et 115 g de phosphate de sodium (dibasique). Dissoudre dans environ 800 ml de H 2 O distillée, ajuster le pH, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
    1. Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4): Prendre 100 ml 10x PB,et ajouter 900 ml d'eau distillée H 2 O.
    2. Assurez 1 L 0,1 M de tampon phosphate (pH 7,4) avec 0,1% de Triton X-100: Prendre 100 ml 10x PB, ajouter 1 ml de Triton X-100, et porter le volume à 1 L avec de l'eau distillée 2 O.
  3. Ajoutez la solution de monomère d'hydrogel de 400 ml (4% d'acrylamide, 0,25% de bis-acrylamide, du paraformaldéhyde 4%, 0,0075% de persulfate d'ammonium, 0,0005% de saponine dans du PBS 0,1 M): Peser 0,3 g de persulfate d'ammonium et 0,2 g de saponine. Ajouter 210 ml de H 2 O distillée, 40 ml 40% d'acrylamide, 10 ml 2% de bis-acrylamide, 40 ml 10x PBS (pH 7,4), 100 ml 16% de paraformaldéhyde, et bien mélanger.
  4. Préparer une solution de compensation de 4 L (4% de SDS dans 0,2 M d'acide borique): Peser 49,464 g d'acide borique et 160 g de SDS. Dissoudre dans environ 3,5 L H 2 O distillée, ajuster le pH à 8,5 avec NaOH, et porter le volume à 4 L.
  5. Assurez 1 L solution de glycérol à 80%: Mesurer 800 ml de glycérol, ajouter 200 ml de H 2 O distillée, et bien mélanger.

2. Préparation des tissus

  1. Préparer la solution de monomère d'hydrogel et aliquote de 10 ml de chaque tube de centrifugation de 15 ml.
  2. On dissèque le tissu et fixer l'ensemble dans l'hydrogel pendant 2 jours à 4 ° C. Assurez-vous que la solution d'hydrogel est d'au moins 10 fois le volume du tissu.
  3. Amener le tissu fixé d'hydrogel (dans le tube de centrifugation de 15 ml) à une hotte de laboratoire.
  4. Polymériser l'hydrogel tissu fixé en ajoutant 5 pi de TEMED, bien mélanger et laisser reposer dans la hotte à température ambiante pendant 2-3 heures.
  5. Retirer soigneusement le gel excès. Remarque: gel supplémentaire sera entraver le processus de compensation et de la pénétration d'anticorps pendant la coloration.
  6. Incuber le tissu fixé dans 10 ml de solution de compensation dans un shaker incubateur réglé à 70 tours par minute et 50 ° C pendant plusieurs jours jusqu'à ce que le tissu devient transparent. Changer solution de compensation au moins une fois par jour et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution de compensation.
  7. Rincer le tissu dans 10 ml de 0,1 M de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rh et à 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon.
  8. Faire incuber le tissu clarifié dans la solution d'anticorps primaire dans PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant 2 jours. Remarque: solution suffisamment d'anticorps primaire pour submerger les tissus.
  9. Rincer le tissu dans 10 ml de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon.
  10. Effectuez les étapes suivantes dans une pièce sombre ou en faible lumière. Couvrir les échantillons de papier d'aluminium pour éviter photoblanchiment.
  11. Faire incuber le tissu avec la solution clarifiée fluorescent de l'anticorps secondaire en PB avec 0,1% de Triton X-100 et le sérum de blocage 70 tours par minute et à 37 ° C pendant 1 jour.
  12. Rincer le tissu dans 10 ml de PB avec 0,1% de Triton X-100 à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répétez cette étape 3 fois et enlever le gel excès felon le tissu lors du changement de la solution tampon.
  13. Rincer le tissu dans 10 ml de PBS à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit. Répéter cette étape trois fois, et enlever le gel en excès du tissu lors du changement de la solution tampon.
  14. Faire incuber le tissu clarifié dans 80% de glycerol à 70 rpm et 37 ° C pendant une nuit.
  15. Stocker le tissu teinté fluorescente à 4 ° C avant la microscopie confocale.

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Résultats

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Plusieurs événements importants se produisent dans le développement du système hépatobiliaire au cours de la lamproie marine métamorphose. La voie biliaire et de la vésicule biliaire et subissent une apoptose dégénérée (Figure 1). La combinaison de la méthode de clarification modifié et coloration au foie marqueur de cellules cytokératine 19 (CK19, présents dans les deux cholangiocytes et les hépatocytes avant et après la métamorphose 13) et Bcl2 marqueur anti-apoptotiques en utilisant la mic...

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Discussion

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Ce protocole est modifié à partir d'une nouvelle méthode appelée «clarté» 12, qui réticule tissu intact avec polyacrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis supprime le membrane plasmique des tissus pour assurer la transparence optique et la perméabilité macromoléculaire. «Clarté» permet l'imagerie des tissus intacts de projection à long terme et le câblage du circuit local dans le système nerveux. Cette nouvelle méthode peut être utilisée pour visualiser l'ensemble du système biliaire dan...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

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Les auteurs reconnaissent la contribution de la Station biologique de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Nous remercions également le Dr Melinda cadre au Centre de microscopie avancée à l'Université d'État du Michigan pour son soutien technique à balayage laser microscopie confocale. Cette étude est financée par des subventions de la Commission des pêcheries des Grands Lacs à YWCD et WML.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
40 % d’acrylamide  ;Bio-Rad161-0140
2 % bis-acrylamide  ;Bio-Rad161-0142
TEMEDBio-Rad161-0800
persulfate d’ammonium  ;SigmaA3678-25G
acide boriqueSigmaB7901-1KG
saponine  ;Sigma47036
dodécylsulfate de sodium  ;SigmaL337-500G
phosphate de sodium (monobasique)Sigma04269-1KG
phosphate de sodium (dibasique)SigmaS5136-1KG
Triton X-100SigmaX100-500ML
glycérol  ;SigmaG9012-500ML
16 % paraformaldéhyde  ;Microscopie électronique Sciences15710-S
pastilles de NaOH  ;EMDSX0590-3
15 ml Tubes à centrifugerToute marque
Outils de dissection  ;N’importe quelle marque

Références

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  1. Applegate, V. C. Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan. US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).
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Mots-clés

CLARITY MethodLaser Scanning Confocal MicroscopyImmunofluorescent StainingTissue ClearingHydrogel PolymerizationCytokeratin 19BCL TwoMetamorphic Stages

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