Nous décrivons ici la méthode d’imagerie basée sur la microscopie confocale à fluorescence fibreuse (FCFM), qui fournit un mode innovant pour comprendre les phénomènes physiologiques aux niveaux cellulaire et subcellulaire chez les sujets animaux.
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Article de méthode
Induits par la chimiothérapie vasculaire Toxicité - en temps réel
Dans cet article
Résumé
Résumé
Certaines classes de chimiothérapies peuvent exercer changements vasculaires aiguës qui peuvent évoluer dans des conditions à long terme qui peuvent prédisposer le patient à un risque accru de morbidité vasculaire. Pourtant, bien que les preuves cliniques de montage, il ya un manque d'études claires de toxicité vasculaire et donc l'étiologie d'un groupe hétérogène de vasculaires / troubles cardiovasculaires reste à élucider. En outre, le mécanisme qui peut expliquer la toxicité vasculaire peut différer complètement les principes de la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie, qui est liée à une lésion directe des myocytes. Nous avons établi un temps réel, in vivo plate-forme d'imagerie moléculaire pour évaluer la toxicité vasculaire aigu potentiel des thérapies anti-cancéreuses.
Nous avons mis en place une plate-forme d'in vivo, l'imagerie moléculaire à haute résolution chez la souris, adapté pour visualiser la vascularisation au sein des organes confinés et blo de référenceod navires dans les mêmes individus, alors que chaque individu servent de son propre contrôle. les parois des vaisseaux sanguins ont été altérées après l'administration de la doxorubicine, représentant un mécanisme unique de toxicité vasculaire qui peut être le cas au début de blessures des organes cibles. Ici, la méthode de microscopie confocale à fluorescence (FCFM) imagerie basée fibrée est décrite, qui fournit un mode innovant de comprendre les phénomènes physiologiques aux niveaux cellulaire et sub-cellulaire dans les matières animales.
Introduction
Les données cliniques indiquent que plusieurs classes de chimiothérapies provoquent une variété de pathologies vasculaires qui se manifestent par un phénomène de Raynaud, l'hypertension, myocardialinfarction, attaque vasculaire cérébrale et hépatique veino-occlusivedisease 1,2. «Médicaments anti-angiogéniques 'accidentelle'" est un terme relativement nouveau, qui décrit des agents chimiothérapeutiques classiques qui agissent comme inhibiteurs de l'angiogenèse possibles, même si elles pas à l'origine développé à cet effet 3-5 mais conçus pour éliminer les cellules tumorales en imposant aussi peu "garantie dommages "pour les cellules normales que possible trois. Plusieurs chimiothérapies ont été implicite que vasculo-toxiques comme observé dans les études cliniques utilisant des biomarqueurs sériques. Parmi ceux-ci sont des agents (tels que le cyclophosphamide), les composés du platine tels que le cisplatine () et anthracyclines 1,2,5-7 alkylation.
Complications cardiovasculaires aiguës peuvent se produire en result de la toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie. Ils peuvent évoluer vers des affections chroniques comme l'athérosclérose et considération pour le risque accru de morbidité vasculaire tard. Pourtant, en dépit des preuves cliniques de montage, il ya un manque d'études désignés soulignant le mécanisme de toxicité vasculaire et par conséquent, de plus amples éclaircissements de la pathogénie exacte qu'ils infligent est justifiée.
Un défi majeur dans révélant le mécanisme de toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie découle de la complexité de l'enquête la fonction vasculaire in vivo. Nous décrivons ici une plate-forme de haute résolution en imagerie moléculaire in vivo chez la souris qui permet de capturer le flux sanguin et des caractéristiques de navires. Cette plate-forme facilite la détection des effets directs induits par le traitement vasculaires: en temps réel, ainsi que de les suivre sur une période de temps dans les mêmes individus.
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Protocole
Déclaration éthique: Toutes les expériences ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. les soins des animaux était selon les directives institutionnelles. Souris ICR femelle (7 - 8 semaines; 25-30 g) ont été logés dans la climatisation, l'éclairage contrôlé les animaleries de la Faculté de médecine Sackler de l'Université de Tel-Aviv. À terme, les animaux ont été euthanasiés à un surdosage anesthésie.
1. fibré confocale microscopie de fluorescence (FCFM) Calibration
- Allumer l'appareil.
- Connectez le microsonde (mini0 / 30).
- Calibrer l'appareil selon les instructions du fabricant.
2. Préparation souris for Imaging
- Anesthetize par une injection sous-cutanée de deux Ketaset (100 mg / kg) et XYL-M2 (6 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée par l'absence de réponse aux pieds-pincement.
- Inciser la peau en dessous de l'aine pour révéler les vaisseaux artériels fémoraux. Gardez le site d'incision humide avec une solution saline suivante incision.
- Chauffer la queue en utilisant un sac (ou un gant) rempli d'eau tiède (pas trop chaude au toucher) pendant environ 30 secondes. Préparer une administration intraveineuse (IV) de dérivation pour l'administration de FITC dextran (agent de contraste) et de sérum physiologique ou un agent chimiothérapeutique, en insérant une aiguille (30 G, 1/2 de pouce) dans la veine caudale et la fixation d'une seringue de 1 ml de ce . Vérifiez la veine est ouverte en injectant une solution saline.
REMARQUE: Une administration intraveineuse de FITC dextran (poids moléculaire élevé; 100 ul; 10 mg / ml; 2,000 kDa) facilite la visualisation de la microvascularisation fémoral par FCFM. La doxorubicine (100 ul; 8 mg / kg, l'adriamycine) ou une solution saline sont également plus tard administrés IV dans la veine caudale préchauffé. - Placez la souris passivement sur une scène de polystyrène. Fixez la souris pour le patin et maintenir la position à l'aide de ruban adhésif chirurgical.
NOTE: Le microscope confocale fibrée utilisée dans cette étude se compose de deux unités: (1) la microsonde (mini0 / 30). (2) unité de balayage laser (LSU-488; longueur d'onde 488 nm).
- Effectuer tous les fuseaux-tours analyses utilisant la longueur d'onde laser nm 488 LSU.
NOTE: Le détecteur de l'unité principale détecte la filtré (500-650 nm) fluorescence émise. Les images acquises sont ensuite reconstruits et affichées à un rythme de 12 images / sec. - Débranchez soigneusement la seringue de l'aiguille et de joindre une nouvelle seringue contenant FITC dextran. Administrer (IV) 100 pi de FITC dextran.
- Mettre la microsonde (mini0 / 30) à un champ de vue approprié et il fixer, après l'ajustement de l'axe z, afin d'obtenir l'image correspondante. Attendez que le signal initial à se estomper jusqu'à ce qu'un signal clair et ciblé est visible.
- Enregistrer un flux sanguin de référence pour une période de stabilisation court (~ 30 sec). Puis connecter à l'aiguille une autre seringue, contenant soit doxorubicine ou une solution saline. IV administrer 100 pi doxorubicine ou une solution saline.
- Surveiller le flux injecté de FITC-dextrane en continu pendant 20 min. Sur le logiciel de FCFM-associé, utilisez le bouton de diamètre sur la règle supérieure afin de mesurer les vaisseaux sanguins et les classer comme faible (<15 um) ou grande (> 15 um).
- Euthanasier l'animal à un surdosage d'anesthésie.
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Résultats
En imagerie continue vivo au temps réel
Appareil de formation d'image utilisée ici est une haute définition, microscope confocal fibrée, équipé d'une sonde qui permet la visualisation de la vascularisation et de sa réponse à divers stimuli comme la chimiothérapie. Cette méthode est peu invasive depuis bien qu'il puisse faciliter l'imagerie des vaisseaux ou organes profonds, il nécessite une petite incision de la sonde. Les faisceaux de sonde sont constitués de ...
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Discussion
Évaluation de la toxicité vasculaire induite par la chimiothérapie est difficile en raison de la difficulté à visualiser la dynamique de la vascularisation en réponse à un stimuli en temps réel. De nombreuses études cliniques ont mis en cause que plusieurs chimiothérapies causent lésion vasculaire directe, mais le mécanisme et les caractéristiques de cette toxicité reste à élucider. Nous avons établi un temps réel, in vivo plate-forme d'imagerie moléculaire pour évaluer la toxicité potentielle de chimiothér...
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| anesthésie générale | Fort Dodge Animal Health, IA, États-Unis et Biove Laboratories, France | 100 mg/kg de ketaset et 6 mg/kg de crème dépilatoire XYL-M2 | |
| (Veet) | ReckittBenckiser, Bristol, Royaume-Uni | ||
| 30 g, aiguille de 1/2 pouce attachée à une seringue | |||
| FITC dextran (10 mg/ml ; MW 2 000 kDa) | Sigma | FD2000S | 100 &mu ; l volume |
| de doxorubicine | Teva, Israël | 8 mg/kg, Adriamycin | |
| paclitaxel | Taro, Israël | 1,2 mg/kg, | |
| solution saline |
Références
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Réimpressions et autorisations
