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Évaluation de Cancer de l'ovaire Spheroid attachement et l'invasion des cellules mésothéliales en temps réel

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DOI :

10.3791/51655

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20 mai 2014

 , 
1Reproductive Development and Cancer Laboratory, MIMR-PHI Institute of Medical Research, 2Department of Developmental Biology and Anatomy, Monash University

Dans cet article

Résumé

L'invasion des cellules de cancer ovarien dans la garniture de mésothéliales du péritoine est un processus dynamique dans le temps. Utilisant un véritable analyseur de temps, la capacité d'invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire dans un modèle sphéroïde mésothélial co-culture de cellules peut être quantifié sur des périodes de temps prolongées, apportant des éclairages sur les facteurs régissant le processus métastatique.

Résumé

Cancers de l'ovaire métastasent en versant dans le liquide péritonéal et la dispersion des sites distaux dans le péritoine. Des cultures monocouches ne modélisent pas avec précision le comportement des cellules cancéreuses au sein d'un environnement non adhérentes, comme les cellules cancéreuses se rassemblent en soi dans les structures multicellulaires qui contribuent au processus métastatique et en attachant à envahir le péritoine pour former des tumeurs secondaires. Pour modéliser cette étape importante de métastases de cancer ovarien, agrégats multicellulaires, ou sphéroïdes, peut être généré à partir de lignées de cellules de cancer de l'ovaire établis maintenus dans des conditions non-adhérentes. Pour imiter le micro-péritonéale rencontrée par les cellules tumorales in vivo, un modèle de co-culture sphéroïde-mésothéliales a été créé en sphéroïdes préformés qui sont plaquées sur le dessus d'une monocouche de cellules mésothéliales humaines, formée par-dessus une barrière de matrice extracellulaire. Méthodes ont ensuite été développées en utilisant un analyseur de cellules en temps réel pour effectuer réel quantitativeLes mesures de temps de la capacité d'invasion des différentes lignées de cellules de cancer ovarien cultivées sous forme de sphéroïdes. Cette approche permet la mesure en continu de l'invasion sur de longues périodes de temps, ce qui présente plusieurs avantages sur les dosages de point final traditionnels et des analyses d'image plus laborieuse réel de microscopie temps. En bref, cette méthode permet une rapide, la détermination des facteurs qui régissent les interactions entre les cellules sphéroïdes de cancer ovarien invasion par mésothéliales et matrice des obstacles au fil du temps.

Introduction

Cancer de l'ovaire a le taux de mortalité le plus élevé de tous les cancers gynécologiques 1. Dans le monde, il ya ~ 230 000 cas et plus de 100 000 décès dus à la maladie chaque année 1. La plupart des patients (> 75%) sont diagnostiqués après le cancer a déjà métastasé, lorsque le traitement est encore compliquée par l'augmentation de la résistance à la chimiothérapie et le pronostic est médiocre 2. Les patients de stade III-IV maladie métastatique ont des taux de survie à 5 ans de seulement 30-40% 3. Ainsi, il ya un besoin urgent d'une meilleure compréhension des comportements cellulaires qui sous-tendent les métastases du cancer de l'ovaire afin de traiter efficacement la maladie avancée.

Le modèle actuel de la métastase de cancer de l'ovaire propose plusieurs étapes du processus métastatique, dont chacune a lieu dans un micro-environnement distinct qui a une incidence sur le comportement de la tumeur. Métastases de cellules cancéreuses de l'ovaire initialement tombent à partir du site de la tumeur primaire et de survivre dans un nonadherEtat ent au sein du liquide péritonéal forme de cellules isolées ou de structures multicellulaires tridimensionnels, dite agrégats ou des sphéroïdes multicellulaires 2,4,5. Les cellules qui ne forment pas des sphéroïdes en suspension sont plus sensibles à anoikis 2,4,5. Sphéroïdes présentent également une résistance à des agents chimiothérapeutiques ont augmenté, contribuant à la maladie résiduelle et la récurrence subséquente de la 2,4,5 de cancer. Une deuxième étape critique dans la métastase de cancer de l'ovaire est la transition d'agrégats de clusters libres flottant à des tumeurs secondaires établis dans la paroi péritonéale et épiploon 5,6. Interactions cellule-cellule et cellule-substrat ont été impliqués dans la formation d'agrégats, la survie et l'adhésion à la matrice extracellulaire (MEC) produite par la muqueuse mésothéliales du péritoine 4-11. Pour l'instant, ces processus sont encore mal compris.

Pour définir les mécanismes impliqués dans la diffusion des cancers de l'ovaire, sphéroïdes peuvent être généralementATED à partir de lignées de cellules cancéreuses établies à l'aide de méthodes de culture non adhérentes, le maintien de cellules en suspension, soit en ajoutant de la méthylcellulose à des milieux de culture 12,13 ou par culture de cellules sur des plaques de fixation à faible 2,14. Lorsque cultivées de cette manière, les cellules de cancer ovarien s'assemblent en agrégats multicellulaires ou de sphéroïdes qui présentent des propriétés cellulaires, moléculaires, biochimiques et similaires à ceux des agrégats de la tumeur in vivo trouvé 2,14. Après formation, les sphéroïdes peuvent être ensuite récoltés à partir du milieu non adhérent et à nouveau ensemencées sur une variété de surfaces solides pour des études fonctionnelles. Ceci représente un progrès par rapport à des dosages en culture monocouche, qui ne sont pas de modéliser avec précision le comportement des cellules de cancer ovarien métastases au sein d'un environnement non-adhérent tel que le fluide par voie intrapéritonéale.

La capacité d'invasion des sphéroïdes de cancer peut être évaluée dans des essais finaux traditionnels dans Boyden chambres 2 , mais cette approche peut être trompeur, comme l'invasion des cellules de cancer de l'ovaire est un processus dynamique au fil du temps. Une méthode en temps réel récente a été conçu en utilisant time-lapse vidéo-microscopie de la clairance de cellules mésothéliales en envahissant sphéroïdes de cancer de l'ovaire 15,16; Cependant, l'analyse des données laps de temps prend du temps et peut être subjective. Ici, un procédé rapide, quantitatif pour évaluer les comportements invasifs de sphéroïdes de cancer ovarien en temps réel est décrit. Tout d'abord, un modèle de cellules mésothéliales-ellipsoïde a été établi, qui représente la phase de la métastase de cancer de l'ovaire lors de sphéroïdes multicellulaires fixent à et envahissent le péritoine pour former des tumeurs secondaires. Ensuite, la méthodologie pour un analyseur en temps réel portable (RTCA, voir le tableau des matériaux pour les détails de la société) a été adapté pour mener de véritables mesures quantitatives de temps de la capacité invasive de différentes lignées cellulaires de cancer de l'ovaire cultivées sous forme de sphéroïdes et testées dans ce modèle.

Dans le RTCAinstrument, les réponses cellulaires sont contrôlées en permanence au cours d'un dosage, sans la nécessité d'étiquettes exogènes, en mesurant les variations de l'impédance électrique. Des plaques de culture spécialement conçus ont microélectrodes d'or revêtues situées en dessous d'une membrane microporeuse à l'interface entre les chambres supérieure et inférieure d'un puits 2 chambrés (plaques "ICM"). L'emplacement des électrodes dans la chambre inférieure permet de mesurer des variations de l'impédance électrique en tant que cellules envahissent à travers un ou ECM ECM / barrière cellulaire. L'interface de la membrane entre les deux chambres de chaque plaque ainsi CIM est tout d'abord revêtu avec le composant ECM d'intérêt. Dans le système de modèle de cellule sphéroïde-mésothéliales, l'interface est revêtue d'une couche de Matrigel (voir la table des matières pour les détails de l'entreprise), de mimer l'ECM complexe qui sous-tend la doublure mésothéliales du péritoine, suivie d'une monocouche confluente de mésothéliales humaines ' «cellules cibles. Enfin, sphéroïdes de cancer de l'ovaire préformés sont added. Les cellules de cancer ovarien sphéroïdes doivent envahir activement à travers la couche de cellules cibles et de la matrice pour accéder à la chambre inférieure et de modifier les lectures d'impédance électrique. Les cellules cibles sur leurs propres sont également évalués pour s'assurer qu'ils ne sont pas envahir à travers la couche de matrice et peuvent être utilisés dans ce dosage.

Protocole

1. Préparation de cellules, des médias et réactifs

  1. Préparation du milieu contenant de la méthylcellulose,
    1. Dissoudre 1,5 g de méthyl dans 100 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco stérile (DMEM) (a aucune additifs) dans un ballon de 250 ml.
    2. Chauffer la solution à basse au micro-ondes pendant 5 minutes; prendre soin d'éviter de déborder.
    3. Une fois la poudre de méthylcellulose est semi-dissous, ajouter un agitateur magnétique propre et médias à prendre le volume à 125 ml.
    4. Mélanger, inverser, et agiter à température ambiante pendant 1,5 h, puis on a agité à 4 ° C pendant une nuit.
    5. Diviser la solution également dans quatre tubes de 50 ml et centrifuger pendant 1,5 heure à 2300 x g.
    6. Recueillir le surnageant clair, très visqueux (environ 90-95% du stock), aliquote en tubes de 50 ml stériles et conserver à 4 ° C pendant 3 mois.
  2. Culture et d'étiquetage des cellules
    1. Maintenir les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire en monocouche dans un tissu incubateur de culture à 37 ° C, 5% CO2 dans un milieu de croissance approprié (DMEM pour les cellules KGN 17 et MCBD110: M199 pour les lignées cellulaires OVCA429 et OVCA433 18) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L -glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine.
    2. Maintenir les cellules mésothéliales humaines LP9 dans M199: Jambons milieu F12 contenant 15% de FBS, 10 ng / ml facteur de croissance épidermique (EGF) et 400 ng / ml d'hydrocortisone, dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2.
    3. cellules de semences dans la taille de flacon désiré et poussent à environ 75% de confluence. Récupération des cellules par traitement à la trypsine en utilisant 0,05% de trypsine / EDTA, rotation à 186 g pendant 5 min, et laver culot cellulaire deux fois avec PBS.
    4. Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
  3. Fluorescent Moyens portable d'étiquetage
    1. cellules de cancer du Remettre en suspension à une concentration finale de 1 x 10 6 cellules / ml dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA préchauffé.
    2. Ajouter 2 ul de 5 mM cellules Trsolution de SCDF as (ou un autre marqueur cellulaire préférée qui est retenu à long terme) à des cellules à une concentration finale de 10 uM et incuber à 37 ° C pendant 10 à 15 min dans un bain-marie.
    3. Stopper la réaction avec 1 ml de glace milieu froid contenant 10% de FBS et re-granulés par centrifugation. Remettre en suspension dans 10 ml du milieu de culture préchauffé approprié (voir l'étape 1.2.1).
    4. cellules de semences dans un flacon de 75 cm2 et culture filtre plafonné à 37 ° C, 5% de CO 2.
    5. Voir les cellules sous un microscope à fluorescence pour vérifier que le niveau de marquage par fluorescence est suffisante pour la détection. Une fois les cellules atteignent environ 75% de confluence, la récolte et comptent comme dans les étapes 1.2.3 et 1.2.4 ci-dessus.

2. Génération de Sphéroïdes en méthylcellulose

  1. Calculer le volume des cellules cancéreuses de l'ovaire de la section 1 nécessaires pour la production sphéroïde (un total de 300 000 cellules sont nécessaires pour chaque expérience complète de la plaque de 96 puits). Aucunte: si vous utilisez différentes lignées cellulaires que présenté ici, les densités cellulaires pour la production de sphéroïde uniforme peuvent avoir besoin d'être optimisé pour chaque ligne.
  2. Pour le calcul de la dilution des cellules dans un milieu de méthylcellulose, soustraire une part le volume de la cellule souhaitée (étape 2.1) à partir de 15 ml.
  3. Ajouter 3 ml de solution mère de la méthylcellulose (pour faire 20% de méthylcellulose final) pour un volume de milieu de culture approprié pour chaque lignée cellulaire, égale à 15 ml moins le volume de la cellule et bien mélanger par inversion douce.
  4. Ajouter 300.000 cellules au moyen de méthylcellulose contenant et soigneusement mélangé par inversion douce.
  5. Introduire à la pipette 150 ul de la combinaison cellule / support / méthylcellulose (pour un total de 3.000 cellules / puits) dans chaque puits d'une plaque de culture 96 puits à fond concave et la culture à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 1-4 jours ou jusqu'à sphéroïdes uniformes forment (1 sphéroïde / puits est généralement observé).

3. RTCA invasion cellulaire dosages

NOTE: lectures d'impédance sont exprimés en indice cellulaire (CI), un paramètre sans dimension qui est un changement par rapport à l'impédance de la cellule de mesure représentant l'état de la cellule. Pour l'analyse, importer des données dans un tableur, comme Microsoft Excel.

  1. Préparation de la plaque
    1. En groupes de 4 puits à la fois, ajouter 50 matrice de pi (dilué à 1:10 dans du milieu de culture sans sérum) à chaque puits de la chambre supérieure d'une plaque de 16 puits RTCA CIM pour garantir que la surface totale est recouverte . Retirer 30 pl de la matrice immédiatement, mais lentement, de se débarrasser de tout excès de liquide.
    2. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 4 heures avant de l'utiliser dans un incubateur de culture tissulaire.
    3. Ajouter 30 ul de milieu sans sérum (SFM) appropriés pour chaque ligne de cellules de cancer de la chambre supérieure et 160 pi de milieu avec ou sans sérum (selon votre conception expérimentale) à la chambre basse.
    4. Assembler la plaque CIM en cliquant sur la chambre basse dans la chambre supérieure et equilibrmangé dans un incubateur à 37 ° pendant 1 h dans un incubateur de culture tissulaire.
  2. Programmation de l'instrument RTCA
    1. Ouvrez le programme RTCA et sélectionnez l'onglet «Mise en page». Mettez en surbrillance tous les puits expérimentaux.
    2. Faites un clic droit sur les puits et sélectionnez «Activer le puits»; puis remplir dans des conditions expérimentales et les noms de cellules comme vous le souhaitez.
    3. Pour ajouter des étapes ou sous-étapes au programme, sélectionnez l'onglet "Calendrier" et un clic droit sur «Ajouter une étape. La première étape est un fond balayage préprogrammé, qui est automatiquement intégré dans le programme une fois 'ajouter une étape' est choisi.
    4. Entrez les détails du programme souhaités pour l'étape 2 du programme RTCA, qui va enregistrer des lectures lors de l'établissement de la monocouche LP9. Ajouter les intervalles de temps entre les lectures d'impédance en sélectionnant l'onglet «Interval» et entrer dans '15 minutes '. Ajouter durée expérimentale en sélectionnant la 'Durée' onglet und entrer dans un temps compris entre 12-24 heures.
    5. Pour ajouter des étapes suivantes, cliquez sur l'onglet "Calendrier" et un clic droit sur «Ajouter une étape 'et entrez les détails des mesures supplémentaires, comme ci-dessus. Étape 3 du programme RTCA dirigera l'instrument pour prendre des lectures lors de l'invasion sphéroïde; entrer '5 min »sous le« Interval »onglet et '48 h 'sous l'onglet' Durée '.
    6. Sélectionnez «Plate» sur la barre de menu et enregistrer.
  3. Génération de LP9 monocouche et évaluation de sphéroïde Invasion
    1. Placer la plaque dans CIM instrument RTCA et programme ouvert à l'étape 3.2 ci-dessus. Avant d'ajouter des cellules, sélectionnez «Exécuter» dans la barre de menus, puis sur «Démarrer». Un balayage de fond sera automatiquement effectuée (étape 1 dans les instructions du logiciel RTCA).
    2. Retirer la plaque CIM de l'instrument suivant le balayage de fond et le placer dans une hotte de culture de tissus.
    3. Plaque 50,000 LP9 cellules en suspension dans 160 ul GDF dans la chambre supérieure de chaque plaque CIM bien.
    4. Placer la plaque dans l'instrument RTCA et prendre des lectures toutes les 15 minutes alors que la monocouche LP9 établit nuit (étape 2 du programme RTCA).
    5. Sphéroïdes de cancer de récolte générés à l'étape 2 «Génération de sphéroïdes méthylcellulose», ci-dessus.
      1. Aseptique, couper 1 mm sur le dessus d'une pointe de pipette de 1 ml et utiliser pour récupérer doucement le contenu de chaque puits. Transférer dans un tube stérile.
      2. Centrifugeuse sphéroïdes à 120 g pendant 8 min, puis retirez la méthylcellulose contenant du milieu par aspiration douce.
      3. Laver deux fois plus sphéroïdes avec du PBS, une centrifugation à 120 g pendant 8 min pour sédimenter les sphéroïdes après chaque lavage.
      4. Pour chaque puits expérimental, remettre en suspension un total de 10 sphéroïdes à 160 ul de milieu sans SVF.
      5. Pause de l'expérience RTCA en sélectionnant 'Exécuter' dans la barre de menu et de vérifier et# 8216; Pause. Retirer la plaque CIM de l'instrument, et le placer dans une hotte de culture de tissus. Aspirer les médias de chaque puits et les remplacer par les médias sphéroïde contenant (10 sphères 160 pi) ou du milieu frais pour les puits de contrôle LP9 seule.
    6. Retour de la plaque à l'instrument RTCA. Sélectionnez «Exécuter» dans la barre de menu et cocher "Abandonner étape. Le programme se déplace à l'étape suivante automatiquement. Pour reprendre l'expérience, sélectionnez «Exécuter» dans la barre de menu et cochez "Démarrer / Continuer». Étape 3 dans le programme RTCA lancera.
  4. Analyse des données
    1. Pour déterminer le niveau de l'invasivité de cellules sphéroïde, soustraire les valeurs obtenues pour la monocouche de LP9 seulement d'après les valeurs obtenues pour les différentes lignées de cellules ovariennes de cancer à chaque point de temps.
    2. Pour tracer 'invasion sphéroïde », normaliser toutes les valeurs au point au cours de laquelle les sphéroïdes ont été ajoutés à la plaque de temps, en sise ce point de temps à '0 '.

Résultats

Sphéroïdes du cancer des ovaires peuvent être générés à partir de nombreux types de lignées cellulaires en les cultivant en suspension ou en récoltant les cellules tumorales primaires à partir de l'ascite maligne 2,14. Ici deux lignes épithéliaux de l'ovaire de cellules cancéreuses, et OVCA433 OVCA429, et une lignée tumorale de cellules de la granulosa de l'ovaire, KGN, ont été utilisées pour générer des sphéroïdes (Figure 1A). Dans cette méthode, les cellules sont cultivées dans des puits à fond en U pendant la suspension dans des milieux qui ont été faites visqueuse par l'addition de méthylcellulose. Dans ces conditions, de nombreuses cellules cancéreuses de l'ovaire présentent une capacité inhérente à s'agréger pour former des sphéroïdes 13. Après une nuit de culture en suspension dans de la méthylcellulose / médias, les trois lignées de cellules formées structures sphéroïdes compacts d'environ 400-500 m de diamètre (figure 1A). Pendant ce temps, la plaque RTCA CIM est préparé, tout d'abord par revêtement de l'interface de la membrane poreuse avec la matrice, puis une monocouche confluente de mes humainescellules othelial (figure 1B). Une fois formées, les sphéroïdes sont ensuite transférées à la plaque CIM préparé. Sphéroïdes cancéreuses récoltés sont plaquées sur le dessus de la monocouche LP9 et évalués comme décrit ci-dessous. Images sous microscopie de phase standard (ou sous microscopie à fluorescence, si l'étape de marquage des cellules en option) a été suivie de cultures parallèles sont prises périodiquement pour aider à l'interprétation des données RTCA (figure 1C).

Il est instructif d'évaluer à la fois le niveau de base de l'invasion d'une lignée de cellules de cancer, ainsi que d'invasion induite chimioattractant. Typiquement, l'invasivité basal est mesuré par l'addition de SFM à la fois les chambres supérieure et inférieure. Milieu complet (FBS à 10%), qui contient de nombreux agents chimio-attractifs potentiels, est utilisé dans le présent exemple pour examiner invasion 'induite chimioattractant-' (Figure 2). Des études parallèles de cellules mésothéliales LP9 seuls ont confirmé que ces cellules sont très peu eninvasives plus de 2 jours dans une ou l'autre base ou «chemoattractant« conditions induites et donc étaient un bon type de cellules à utiliser dans des essais de co-culture avec des cellules de cancer de l'ovaire (Figures 2A et 2B). Par contraste, les sphéroïdes de cancer ovarien générés en utilisant n'importe lequel des trois lignées cellulaires ont montré la capacité d'envahir vers un agent chimio-attractif (FBS) (Figures 2A-2C). L'avantage majeur de l'utilisation des instruments en temps réel RTCA sur les essais finaux traditionnels est que les changements dans le comportement cellulaire / sphéroïde peuvent être quantifiés dans le temps. Au cours de l'essai de deux jours, les lignées cellulaires OVCA433 KGN, OVCA429, et tous ont présenté la capacité à envahir vers un agent chimio-attractif (indiqué par l'augmentation des indices de cellule), mais de faibles niveaux de base de l'invasion (figure 2C). Les lignées cellulaires présentaient des taux similaires d'invasion, comme indiqué par les pentes des courbes parallèles (Figure 2C); Cependant, la courbe OVCA429 présentait une asymptote supérieure plus élevée,qui ont indiqué un niveau maximal plus élevé de l'invasion par rapport aux autres lignées cellulaires. En outre, les lignées cellulaires présentaient des différences dans leurs temps d'apparition de l'invasion, aux cellules KGN envahir rapidement les barrières cellulaires et de la matrice et la OVCA433 OVCA429 cellules et en prenant 3 à 5 fois plus d'envahir, respectivement (figure 2D). Surtout, leurs comportements à l'apparition d'invasion n'étaient pas prédictive de leur capacité globale de l'invasion (figures 2C et 2D). Ceci suggère différentes capacités inhérentes des lignées cellulaires de cancer, mais aussi peut indiquer que différents facteurs peuvent réguler les comportements invasifs précoces et tardifs de sphéroïdes.

figure-results-1
Figure 1 génération sphéroïde et le modèle de expérimental mis en place A:.. Images sous microscope à contraste de phase de sphéroïdes formant dans la méthylcellulose / médias (en haut) et de la ligne de cellule d'adaptation grandi comme une monocouche (bas) B:. Schéma montrant la RTCA 2 chambré plaque CIM bien mis en place, dans lequel préformé cancer de l'ovaire sphéroïdes sont plaquées sur le dessus d'une monocouche d'une couche mésothéliale LP9 / matrice barrière dans la chambre supérieure et des médias ± FBS comme un agent chimio-attractif est ajouté à la chambre inférieure. Électrodes en dessous de l'interface de la mesure 2 chambres de plus en plus l'impédance électrique de plusieurs cellules envahissent les barrières à la chambre inférieure C:. Images de sphéroïdes KGN sur le dessus de la monocouche LP9 au microscope à contraste de phase (à gauche) ou la microscopie à fluorescence (à droite). Barres d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure-results-2
.. Figure 2 des données d'invasion de sphéroïde cancer de l'ovaire en temps réel A - B: Les résultats représentatifs de l'invasion essai RTCA menée avec et sans FBS dans la chambre inférieure d'une plaque CIM bien. L'invasion des cellules KGN est comparée à des cellules mésothéliales LP9. Les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type Indice Cellulaire à partir de puits en triple à l'heure timepoint 24 (A) et sur ​​une période d'essai de deux jours, l'ensemble de (B) C - D:. Une comparaison de la capacité d'invasion des KGN, OVCA429, et cellule OVCA433 lignes représentées sur une période de 24 heures (C) et de façon plus détaillée sur une période de temps de 2,5 h (D).

Discussion

Invasion des cellules cancéreuses de l'ovaire interagissent avec une variété de types de cellules à la surface du péritoine, y compris des fibroblastes, des adipocytes et des cellules mésothéliales, et une communication bidirectionnelle entre les cellules cancéreuses et les cellules peritoneales sont supposés jouer un rôle clé dans la conduite du processus métastatique 2. Une fois maîtrisé, le protocole décrit ci-après est facilement adaptable à l'étude de ces interactions à l'intérieur de la micro-péritonéale, par exemple, par l'addition de cytokines exogènes, facteurs de croissance, ou des inhibiteurs spécifiques aux chambres supérieure ou inférieure de la plaque CIM puits ou d'une manipulation génétique du cancer ou des lignées de cellules péritonéales. En outre, cette méthode peut être utilisée avec des cellules tumorales ovariennes primaires fraîchement récoltées à partir d'ascites malignes et / ou des cellules primaires du péritoine pour mieux comprendre directe dans les signaux de régulation et les interactions cellulaires qui gouvernent la création d'une lésion métastatique à l'intérieur de la cavité péritonéale 2.

L'utilisation de l'instrument RTCA pour mesurer la capacité d'invasion des cellules ou des sphéroïdes simples offre plusieurs avantages par rapport aux tests finaux simples classiques et analyse d'image temps-lapse. L'instrument mesure la RTCA invasion cellulaire à des intervalles définis de façon continue au cours d'un dosage, ce qui peut prendre des heures ou des jours. Cela permet la détermination des changements dans le taux d'invasion dans le temps, qui surmonte les limitations des essais de point de terminaison unique. Par exemple, l'examen des données de l'invasion des différentes lignées cellulaires de cancer à un seul critère (figure 2), par exemple, 3 heures, aurait pu conduire à la conclusion erronée que KGN et OVCA433 cellules étaient beaucoup plus invasive que OVCA429 cellules. Un autre avantage de cette technologie est que l'instrument RTCA mesure les variations de l'impédance électrique. Cela signifie que les tests peuvent être exécutés sans marquage des cellules avec un agent exogène, ce qui pourrait avoir des effets inattendus sur phen cellulaireOTYPE ou fonction. Cela devient particulièrement important lorsque l'on étudie les cellules cancéreuses ovariennes primaires dérivés de l'ascite maligne, avec lesquels il est impératif de garder les manipulations au minimum afin d'éviter l'introduction de changements moléculaires et phénotypiques qui ne sont pas le reflet de leur nature in vivo 2. En outre, l'utilisation de l'instrument RTCA permet la collecte de données quantitatives en temps réel, ce qui, non seulement évite la fastidieuse analyses associées à la microscopie time-lapse mais également permet la détermination rapide de fenêtres expérimentales clés pour l'optimisation du dosage. Ceci est particulièrement utile lorsque l'on compare les effets d'une série de facteurs sur l'invasion sphéroïde, comme différents facteurs peuvent exercer leurs effets maximaux à différents points dans le temps ou avec beaucoup profils différents au fil du temps.

Bien que ce protocole est susceptible de modifications (par exemple, l'utilisation de différents matrice ECM, différentes lignées cellulaires de cancer, ou différents cel ciblels), si une telle mesure, il est important de noter que les diverses conditions expérimentales doivent d'abord être optimisés. Par exemple, avant de commencer les études d'invasion sphéroïde, le nombre optimal de cellules cancéreuses / plaque CIM puits doit tout d'abord être déterminée par dosage du nombre de cellules dans les titrages culture monocouche. Le nombre optimal de sphéroïdes à utiliser par puits est alors basé sur cette analyse. Par exemple, dans le procédé actuel, sphéroïdes comprennent environ 3000 cellules lorsque chaque première généré. Si initiales titrages nombre de cellules indiquent que 30 000 cellules monocouche sont optimales pour la détection dans l'invasion des analyses, puis 10 sphéroïdes sont ajoutés par plaque de CIM bien. En outre, lorsque la conduite d'expériences de co-culture, il est important d'étudier les comportements de la monocouche de cellule «cible» séparément afin de déterminer si ces cellules sont par nature invasive, ce qui pourrait brouiller les résultats. Dans l'exemple montré, les sphéroïdes de cancer sont plaquées sur le dessus d'une cellule Monola LP9yer, avec et sans FBS ajouté au bas ainsi qu'un chemoattractant. En parallèle, les cellules sont cultivées LP9 seul, dans chaque condition de traitement.

De même, lorsque l'on étudie la capacité d'invasion des cellules et des sphéroïdes, il est également important d'examiner leurs capacités migratoires ainsi afin de distinguer les deux comportements (c.-à-invasion nécessite la digestion protéolytique d'une barrière ECM alors que la migration ne fonctionne pas). Pour ce faire, omettre la barrière de l'ECM (3.1.1 - 3.1.3) et effectuer le test en parallèle avec la barrière de l'ECM en place. Cette dernière mesure «d'invasion» peut être corrigée à l'ancienne mesure de «migration», si désiré. Enfin, il est important de noter que les informations obtenues à partir de mesures de l'impédance électrique d'une portée limitée: une fois que les cellules ont envahi dans la chambre inférieure, les variations de leur fixation, la propagation, la prolifération et sur la face inférieure de la membrane peuvent contribuer aux changements de impédance reabosses. Par conséquent, cette méthode est la plus informative lorsqu'il est utilisé conjointement avec d'autres tests de viabilité sphéroïde cellulaire, l'adhérence, la migration et la morphologie afin d'évaluer globalement les comportements cellulaires sphéroïde. Par exemple, dans l'idéal, afin de bien comprendre les interactions sphéroïde mésothéliales, co-cultures distinctes devraient également être visualisés périodiquement en microscopie de phase standard, de sorte que les évaluations qualitatives des sphéroïde morphologie et de la santé peuvent être faites en parallèle avec les tests RTCA quantitatives de l'invasion. Si l'étape de marquage facultatif est effectué, puis les comportements des cellules cancéreuses individuelles peuvent être déterminées par microscopie fluorescente ils ventilent de la sphéroïde et interagissent avec les cellules mésothéliales non étiquetés. Un avantage supplémentaire de marquage par fluorescence les cellules cancéreuses lors de la co-culture avec un second type de cellule est qu'il est alors possible de confirmer que seules les cellules cancéreuses ont envahi à travers les barrières cellulaires et ECM.

En résumé, cette méthode représente une analyse quantitative à haut débit de l'ovaire invasion sphéroïde de cancer de mésothéliales et ECM obstacles. Grâce à l'addition de cytokines exogènes, facteurs de croissance, ou des inhibiteurs spécifiques aux cavités supérieures ou inférieures de la plaque de CIM ainsi, ce procédé permet un rapide, la détermination des facteurs qui régulent les interactions entre les cellules sphéroïdes de cancer de l'ovaire invasion à travers mésothéliales et les barrières de matrice au-dessus de temps.

Déclarations de divulgation

Frais d’accès ouvert payés par ACEA Biosciences, Inc. et l’Institut de recherche médicale MIMR-PHI.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une fondation CASS sciences et de médecine de subvention; (MB); une Santé et médecine du Conseil national de recherches du projet Australie Grant (KLS, 338516); et par Programme opérationnel d'appui aux infrastructures du gouvernement du Victoria (Australie).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
xCELLigence RTCA DP AnalyseurACEA biosciencesRTCA DP
xCELLigence CIM plates  ;ACEA biosciences5665817001
Cell TraceTM CFSE  ;Sondes moléculairesC34554
Méthylcellulose (4 000 centipose)SigmaM0512
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Life Technologies  ;11966-025
Moyen 199  ;Technologies de la vie  ;
Ham F-12 Nutrientmix Life Technologies  ;
Facteur de croissance épidermique (EGF)PeproTech  ;100-15
Hydrocortisone  ;SigmaH4001
Trypsine EDTAGibco-Invitrogen15400-054
Plaque de culture concave à 96 puits  ;Grenier Bio-One650185
LP9 Lignée cellulaire mésothéliale humaineInstitut Coriell de recherche médicale.
Matrice matrigel à facteur de croissance réduitBD Biosciences  ;Référence 354230
1115006711765062AG07086

Références

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