De voxels à la connaissance: Un guide pratique de la segmentation du complexe microscopie électronique 3D-données

Wen-Ting Tsai; Ahmed Hassan; Purbasha Sarkar; Joaquin Correa; Zoltan Metlagel; Danielle M. Jorgens; Manfred Auer

doi:10.3791/51673

Method Article

De voxels à la connaissance: Un guide pratique de la segmentation du complexe microscopie électronique 3D-données

DOI:

10.3791/51673

⸱

August 13th, 2014

Wen-Ting Tsai¹ , Ahmed Hassan¹ , Purbasha Sarkar² , Joaquin Correa¹^,³ , Zoltan Metlagel¹ , Danielle M. Jorgens¹ , Manfred Auer¹^,²

¹Life Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, ²Joint Bioenergy Institute, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, ³National Energy Research Scientific Computing Center, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le goulot d'étranglement pour la microscopie électronique 3D cellulaire est l'extraction de caractéristiques (segmentation) dans des cartes très complexes de densité 3D. Nous avons développé un ensemble de critères, qui fournit des précisions sur l'approche de segmentation (manuel, semi-automatique ou automatique) est le mieux adapté pour différents types de données, fournissant ainsi un point de départ pour la segmentation efficace.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Méthodes de microscopie électronique 3D modernes ont récemment permis analyse sans précédent dans l'organisation ultrastructurale 3D de cellules et de tissus, ce qui permet la visualisation de grandes machines macromoléculaires, tels que les complexes d'adhérence, ainsi que les structures d'ordre supérieur, tels que le cytosquelette et des organites cellulaires dans leur cellule respective et le contexte tissulaire. Compte tenu de la complexité inhérente des volumes cellulaires, il est essentiel de d'abord extraire les caractéristiques d'intérêt afin de permettre la visualisation, la quantification, et donc la compréhension de leur organisation en 3D. Chaque jeu de données est définie par des caractéristiques distinctes, par exemple, le rapport signal-sur-bruit, netteté (netteté) des données, l'hétérogénéité de ses fonctions, entassement des caractéristiques, la présence ou l'absence de formes caractéristiques qui permettent d'identifier facilement, et le pourcentage de la totalité du volume qu'une région d'intérêt spécifique occupe. Toutes ces caractéristiques doivent être considéréesau moment de décider sur l'approche à adopter pour la segmentation.

Les six ensembles de données ultrastructurale 3D différents présentés ont été obtenus par imagerie en trois différentes approches: la tomographie électronique teinté intégré de résine, d'ions focalisé BEAM et la microscopie électronique à balayage face-bloc de série (FIB-SEM, SBF-SEM) des échantillons légèrement colorées et fortement colorées , respectivement. Pour ces ensembles de données, quatre approches de segmentation différentes ont été appliquées: (1) le renforcement entièrement manuel modèle suivi uniquement par la visualisation du modèle, (2) le traçage manuel segmentation des données suivies par la fonte de surface, (3) des approches semi-automatiques suivies par le rendu de surface, ou des algorithmes de segmentation conçu sur mesure (4) automatisés suivis par la fonte de surface et de l'analyse quantitative. En fonction de la combinaison de caractéristiques d'ensemble de données, il a été constaté que généralement l'une de ces quatre approches catégoriques surpasse les autres, mais en fonction de la séquence exacte de critères, more d'une approche peut être couronnée de succès. Sur la base de ces données, nous proposons un système de triage qui permet de classer les objectifs caractéristiques des ensembles de données et des critères subjectifs personnels pour l'analyse des différents ensembles de données.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionnellement, la microscopie électronique (EM) domaine a été divisé en 1) la branche de la biologie structurale à l'aide de haut et très haute résolution TEM, généralement combinées avec les données implicites ou explicites moyenne pour enquêter sur l'(3D) structure tridimensionnelle de complexes macromoléculaires avec une composition définie et généralement une taille relativement petite ^1-4, et 2) la branche d'imagerie cellulaire dans lequel paysages cellulaires entières sont visualisés ^1,5,6. Tandis que la branche structurelle de biologie a connu un développement spectaculaire au cours des quatre dernières décennies, la branche de la biologie cellulaire a été la plupart du temps limitée à deux dimensions, souvent sur des échantillons moins-que-optimale conservés. Seulement avec l'avènement de la tomographie électronique dans la dernière décennie a cellule biologique imagerie ultrastructurale élargi dans la troisième dimension ^5,7, où la moyenne ne peuvent généralement pas être effectué comme les paysages cellulaires, et donc les caractéristiques d'intérêt, sont généralement unique.

Bien que les scènes cellulaires visualisées sont souvent capte le regard, une extraction efficace des éléments d'intérêt et l'analyse quantitative ultérieure de ces volumes cellulaires très complexes sont à la traîne, en partie parce que la composition de protéines précis est généralement inconnue, rendant donc difficile de les interpréter cellulaire volume 3D. À ce jour, une grande expertise biologique est souvent nécessaire pour interpréter les tomographies complexes, ou même pour identifier les régions importantes et des éléments essentiels dans le volume 3D. Comme une complication supplémentaire, la visualisation de volumes 3D est remarquablement non-trivial. Volumes 3D peuvent être considérés et donc visualisées sous forme de piles d'images 2D. Inspection tranche par tranche d'images 2D séquentielles réduit la complexité, mais il limite également dotées extraction et l'analyse quantitative ainsi les deux dimensions. Cependant, pour la plupart des objets 3D, la représentation des volumes 3D comme un simple empilement de plans consécutifs conduit à une incomplètes uned perspective biaisée en 3D la nature d'un système particulier. Modes alternatifs de l'inspection visuelle nécessitent soit rendu de volume ou de la prestation de surface, qui, étant donné la nature souvent dense d'un cellulaire volume peut facilement conduire à une vue obstruée d'objets imbriqués ou écraser un utilisateur tout à fait, ce qui rend la segmentation manuelle interactive difficile.

Pour remédier à ces obstacles, une grande variété d'extraction de fonction automatisée (segmentation) approches ont été développées qui sont généralement soit densimètres ou ^8-10 base gradient. Cependant, ces méthodes ont tendance à segmenter le volume entier, quel que soit les zones ou caractéristiques présentent un intérêt pour l'expert, bien que certaines méthodes récentes peuvent cibler un élément spécifique d'intérêt tels que des filaments d'actine ^11. De plus, les programmes d'exécution de segmentation automatique peuvent parfois aboutir à la production d'un grand nombre de sous-volumes (par exemple, lors de l'application des bassins versants immersion segmentation) qui ont souvent besoin d'être fusionnés manuellement dans comprenant l'ensemble caractéristique d'intérêt ou être soumis à une nouvelle segmentation. Cela est vrai en particulier pour les ensembles de données complexes et bondés, ainsi algorithmes informatiques les plus rendu sont incapables d'extraire uniquement les éléments d'intérêt avec fidélité, et les efforts de curation substantielles par un expert sont souvent nécessaires pour produire un volume segmenté souhaitée.

En outre, des solutions personnalisées à un problème très spécifique sont souvent publiés sous forme d'un document de réunion scientifique, avec peu ou pas l'accent sur ce qui les rend large et des outils complets accessibles aux chercheurs qui n'ont pas une connaissance approfondie des domaines des mathématiques, de l'informatique et / ou infographie. Un environnement logiciel de programmation personnalisable, contenant une gamme de bibliothèques d'analyse d'image, peut être un ensemble d'outils puissants permettant aux utilisateurs d'écrire efficacement leurs propres modules de segmentation précise. Cependant, cette approche nécessite posteformation ensive et une formation en informatique afin de profiter de ses nombreuses fonctionnalités ou les capacités d'analyse d'image. On peut travailler dans un tel environnement logiciel polyvalent pour certains ensembles de données où les caractéristiques sont plus rares, par exemple, en utilisant des approches à base de forme-puissants qui reposent sur la géométrie unique de «modèles» pour séparer les objets d'intérêt de leur entourage ^12,13 .

Une foire variété de forfaits infographie de visualisation existent pour la segmentation manuel interactif et la construction de modèles. Certains paquets sont disponibles dans le commerce, tandis que d'autres sont d'origine académique et distribués gratuitement, tels que: l'Université de Californie à San Francisco Chimera ^14, Université du Colorado MID ^15, et de l'Université du Texas Austin VolumeRover ^16. Cependant, le large éventail et la complexité des fonctions et capacités de ces programmes possèdent plus raide de la courbe d'apprentissage pour each. Certains programmes de visualisation fournissent des modèles géométriques simples, tels que des billes et des bâtonnets de différentes tailles, qui peuvent être placés dans les cartes de densité afin de créer un modèle simplifié du volume 3D complexe. Ces modèles permettent alors des mesures géométriques et volumétriques simples et donc aller au-delà de l'image "jolie". Un tel suivi manuel des objets fonctionne bien pour les volumes où seul un petit nombre d'objets doivent être retrouvés et extrait. Cependant, le développement récent de grand volume imagerie ultrastructural 3D utilisant la microscopie électronique à balayage d'un faisceau d'ions focalisé (FIB-SEM) ^{de 17 à 20} ou la microscopie électronique à balayage de la face de bloc série (SBF-SEM) ²¹ présente la complication supplémentaire que la taille des données 3D ensembles peuvent aller de gigaoctets à des dizaines et des centaines de giga-octets, et même les téraoctets. Par conséquent, de tels volumes 3D sont pratiquement inaccessibles à l'extraction manuelle de fonction, et donc efficace feat semi-automatique guidé par l'utilisateurextraction ure sera l'un des goulots d'étranglement pour l'analyse efficace des volumes 3D dans un avenir prévisible.

Présenté voici quatre approches de segmentation différents qui sont couramment utilisés sur une large gamme de types d'images biologiques. Ces méthodes sont ensuite comparés pour leur efficacité pour différents types d'ensembles de données, ce qui permet une compilation en un guide pour aider les biologistes décident ce qui pourrait être la meilleure approche de segmentation pour l'extraction de caractéristiques efficace de leurs propres données. Comme les manuels d'utilisation détaillés sont disponibles pour la plupart des programmes décrits, le but n'est pas de rendre les utilisateurs potentiels connaissent l'un de ces paquets particuliers. Au lieu de cela, l'objectif est de démontrer les forces et les limites respectives de ces stratégies de segmentation différents en les appliquant à six par exemple des ensembles de données avec des caractéristiques différentes. Par cette comparaison, un ensemble de critères ont été développés qui sont soit basées sur les caractéristiques de l'image de l'objectifEnsembles de données 3D, tels que le contraste des données, la précision, cohue, et de la complexité, ou de la tige de considérations subjectives, comme l'objectif souhaité pour la segmentation, morphologie des fonctionnalités pour être segmentés, la densité de population des éléments d'intérêt, ce qui signifie la fraction de le volume occupé par la fonction d'intérêt, et la façon dont on procède de manière optimale avec des ressources limitées telles que le temps et la disponibilité du personnel. Ces différents ensembles de données d'exemple illustrent comment ces critères objectifs et subjectifs peuvent être appliqués de façon séquentielle dans une variété de combinaisons pour obtenir un appariement de certaines approches d'extraction de caractéristiques avec certains types d'ensembles de données. Les recommandations données, nous l'espérons aider les novices face à une grande variété d'options de segmentation choisir l'approche de segmentation plus efficace pour leur propre volume 3D.

Bien que l'accent de cet article est l'extraction de caractéristiques, attention à la collecte de données et prétraitement des données est cruciale pour s efficacesegmentation. Souvent la coloration des échantillons peut être inégale, et, par conséquent, des artefacts de coloration potentiels doivent être pris en considération dans la procédure de segmentation. Toutefois, les taches donne habituellement signal-bruit élevé, et nécessite donc moins de filtrage et autre traitement mathématique des volumes cellulaires, qui pourraient résulter également en artefacts. Les ensembles de données d'images brutes respectives doivent être acquises dans les réglages de contraste et de la caméra pixels corrects, alignés, et reconstruite dans un volume 3D. Pour les tomographies, les images reconstruites sont alignées en utilisant typiquement de rétroprojection pondérée, et ensuite l'ensemble de données est généralement soumis à des algorithmes de débruitage comme non linéaire anisotrope diffusion ^22, de filtrage ²³ bilatérale, ou médian récursif filtration ^24. Données d'imagerie FIB-SEM et SBF-SEM sont alignés par tranches consécutives corrélation croisée dans les programmes utilisant XY tels que ImageJ ^25. l'amélioration du contraste et de filtrage peuvent être appliqués pour augmenter les caractéristiques d'intérêt et donc de dé-bruit de la pile d'images. Le filtrage peut être effectué soit sur la totalité du volume de sous-volume avant ou sélection sur les sous-volumes sélectionnés, à l'approche de filtrage peuvent être coûteux en calcul. Sous-échantillonnage des données (binning), qui est parfois utilisé pour la réduction du bruit et / ou le fichier réduction de la taille, est seulement recommandé si les données ont été significativement sur-échantillonné par rapport à la résolution prévue.

Après la réduction du bruit, les images traitées peuvent ensuite être segmentés par diverses méthodes, et la mise au point dans cette étude est sur les quatre éléments suivants: (1) Manuel génération de modèle abstrait en créant un modèle de boule-et-bâton, (2) le traçage manuel des caractéristiques d'intérêt, (3) la densité en fonction de seuil automatique, et (4) la segmentation automatique sur mesure via un script pour projet segmentation spécifique. Segmentation limite de ⁸ et immersive segmentation des bassins versants ¹⁰ existe de meilleures alternatives à seuillage simple, mais they appartenir à la même catégorie et n'ont pas été inclus explicitement dans cette discussion.

Traçage manuel nécessite de densités présentant les caractéristiques d'intérêt, tranche par tranche, ce qui permet le maintien de la densité initiale des zones de sous-cellulaires respectifs. Cette approche permet un contrôle maximal du processus de segmentation, mais est un processus fastidieux et de main-d'œuvre.

Approches de segmentation de la densité (et lié) à seuil automatiques sont semi-automatiques, où un algorithme choisit pixels basé sur un ensemble de paramètres définis par l'utilisateur. Plusieurs (gratuit) paquets de visualisation d'enseignement, tels que l'UCSF Chimera, MID, Fidji ^26, et VolumeRover sont disponibles, ainsi que commercial (nécessitant licences payées) des paquets, et les deux types comprennent généralement un ou plusieurs de ces approches de segmentation. Les logiciels utilisés dans ce travail pour illustrer ces différentes méthodes comprennent à la fois des programmes commerciaux et s ouvertes académiquesource programmes pour générer manuellement un modèle théorique, ainsi que le manuel et automatisé de segmentation densité. Cependant, les logiciels open source peut parfois offrir des options plus avancées grâce à la possibilité de personnalisation.

Une comparaison de ces techniques à l'aide de différents types d'ensembles de données conduit à la présentation qui suit des règles et des conseils sur la façon d'aborder la segmentation des divers volumes 3D de données biologiques, qui à notre connaissance n'a pas encore été publiés. Ainsi, c'est la première comparaison systématique des différentes approches et leur utilité sur des ensembles de données possédant des caractéristiques variées pour les utilisateurs ayant des objectifs différents.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Manuel abstrait Modèle génération

Remarque: Les détails de la méthodologie décrits ci-dessous sont spécifiques à Chimera, mais d'autres logiciels peuvent être utilisés à la place. Utilisez cette méthode lorsque le seul objectif est de créer un modèle géométrique (par exemple, une balle et bâton modèle) afin d'effectuer des mesures géométriques, plutôt que d'afficher la forme de volume des objets.

Importez le volume de données dans un programme approprié pour le manuel génération de modèle abstrait.
1. Sélectionnez Fichier> Ouvrir la carte à tirer vers le haut la boîte de dialogue Ouvrir un fichier. Accédez à l'emplacement du fichier de la carte désirée.
2. Tirez le Volume Viewer (Outils> Données de volume> Volume Viewer) et sélectionnez Options> Style d'affichage pour afficher les données avec différents styles de rendu.
3. Réglez le seuil pour l'affichage en faisant glisser la barre verticale sur l'histogramme dans le Volume Viewerfenêtre.
Naviguez à travers le volume 3D (par exemple, tranche par tranche) pour sélectionner une zone d'intérêt pour la segmentation et recadrer un sous-volume plus petit si nécessaire.
1. Dans la boîte de dialogue Volume Viewer, cliquez sur Axe, puis sélectionnez X, Y, ou Z.
2. Dans la boîte de dialogue Volume Viewer, sélectionnez Options> Avions. Cliquez sur un de fixer Profondeur pour afficher le plan correspondant au numéro dans la case de gauche, et cliquez sur Tous pour afficher tous les plans.
3. Dans la boîte de dialogue Volume Viewer, sélectionnez Options> sélection de la sous-région.
  1. Cliquez et faites glisser pour créer une boîte rectangulaire autour de la région d'intérêt.
Placer des marqueurs le long de la caractéristique d'intérêt et les connecter avec des linkers le cas échéant (souvent faites automatiquement par le programme) jusqu'à ce que le modèle est complet.
1. Dans la barre de menu Volume Viewer, sélectionnez Outils>dialogue Tracer Volume pour ouvrir la boîte de dialogue Volume Tracer. Dans la boîte de dialogue Tracer de volume, sélectionnez Fichier> Nouveau marqueur Set.
2. Dans la boîte de dialogue Tracer Volume, vérifiez Souris> La place des marqueurs sur la qualité, la Place des marqueurs sur des plans de données, déplacer et redimensionner les marqueurs, lien nouveau marqueur marqueur sélectionné, et Link marqueurs consécutivement sélectionné.
3. Cliquez sur l'échantillon Couleur de marqueur, puis sélectionnez une couleur. Répétez cette étape pour la couleur du lien.
4. Entrez rayons pour les éléments de construction de modèle marqueurs et de liaison.
5. Dans la fenêtre de trace de volume, sélectionnez place des marqueurs en utilisant le bouton [droite] de la souris, et insérer les rayons des marqueurs et des liens.
6. Faites un clic droit sur les données de volume pour commencer fixant marqueurs. Marqueurs seront automatiquement connectés.
7. Dans la boîte de dialogue Tracer Volume, sélectionnez Fichier> Enregistrer ensemble de marqueurs en cours, puis Fichier> Fermer marqueur ensemble.
Ouvrez un nouveau jeu de marqueurs (étape 1.3.1) pour commencer à construire un modèle dans une deuxième caractéristique d'intérêt souhaité. Utiliser des couleurs entre les ensembles de marqueurs contraste pour souligner les différences dans les caractéristiques.

2 Manuel traçage des éléments d'intérêt

Remarque: Les détails de la méthodologie décrits ci-dessous sont spécifiques à Amira, mais d'autres logiciels peuvent être utilisés à la place. Utilisez cette méthode lorsque la densité de population est relativement faible et lorsque la précision de l'extraction de caractéristiques est primordiale, comme le traçage manuel est une approche de longue haleine.

données sur le volume des importations dans un programme de manuels options de trace. Logiciel avec cette capacité offrent généralement au moins un outil de pinceau de base.
1. Pour les grands volumes ou des tomographies (par exemple, 16 bits 2048 x 2048 ou plus .rec ou .mrc tomographies généré dans MID): Sélectionnez Open Data> clic droit sur filename.rec> Format ...> Sélectionner Raw comme LargeDiskData > OK> Charger. Sélectionnez Raw appropriée de paramètres de données à partir des informations d'en-tête> OK. Basculer et Enregistrer sous un nouveau filename.am fichier pour une utilisation dans les étapes suivantes.
2. Pour les fichiers plus petits d'image 3D de la pile (par exemple, .tif 3D ou .mrc ou .rec): Open Data> Sélectionner filename.tif ou filename.mrc. Basculer et Clic droit> Enregistrer sous filename.am . Si une erreur est générée ou le programme ne répond pas, le fichier peut être trop grande et peut être ouvert en suivant l'étape 2.1.1.
Naviguer à travers les tranches de sélectionner un sous-volume 3D pour la segmentation, et ensuite recadrer à ce domaine d'intérêt.
1. Dans la fenêtre 3D Viewer, sélectionnez Orthoslice d'ouvrir le fichier d'image. Utilisez le curseur en bas pour naviguer dans les tranches.
2. Pour recadrer données plus grands ouverts que LargeDiskData, bascule nom de fichier dans la fenêtre Piscine> clic droit> LatticeAccess. Enter la taille de la boîte désirée> Appliquer. Enregistrer le nouveau fichier.
Créer un fichier de segmentation.
1. Déplacez le fichier dans la fenêtre Bibliothèque> Clic droit> Étiquetage> LabelField. Un nouveau fichier sera créé et chargé automatiquement dans l'onglet Segmentation éditeur.
Tracer le cadre de la première caractéristique d'intérêt, puis remplissez la trace à la main ou à l'aide d'une commande spécifique au logiciel utilisé. Suivez la fonction d'intérêt par toutes les tranches et répéter le traçage segmentation manuelle. Utilisez les commandes suivantes lors de l'utilisation Amira:
1. Pour utiliser l'outil Pinceau, modifier la taille du pinceau comme vous le souhaitez, puis utilisez le pointeur de la souris pour tracer la frontière de la fonction d'intérêt.
2. Remplissez la zone tracée au raccourci "f". Ajouter la sélection en cliquant sur le bouton avec le symbole plus, ou le raccourci "a". Si nécessaire, appuyez sur "u" pour annuler, et "s" de soustraire ou effacer.
Générer un rendu de surface pour la visualisation et qualitative de base ou l'analyse quantitative par logiciel notice instruction.
1. Dans l'onglet de la piscine de l'objet, déplacez le fichier-labels.am dans la fenêtre Bibliothèque> clic droit> SurfaceGen.
2. Sélectionnez les propriétés de surface souhaitées> Appliquer. Une nouvelle filename.surf de fichier sera créé dans le Pool.
3. Pour visualiser le volume segmenté, bascule filename.surf dans la fenêtre Piscine> clic droit> SurfaceView.
4. Utilisez les outils dans la fenêtre 3DViewer à déplacer, faire pivoter, agrandir et le volume 3D.
Extraire les densités exactes et déterminer des mesures comme le volume ou la superficie. Exportation vers d'autres programmes pour l'affichage plus avancé, l'analyse et la simulation.
1. Dans la fenêtre 3DViewer, cliquez sur l'outil de mesure> Sélectionnez l'option appropriée (longueur 2D et 2D angle pour les mesures sur un plan 2D unique, longueur 3D et l'angle 3Dpour les mesures sur un volume 3D).
2. Cliquez sur la surface de maille pour mesurer la longueur désirée, la distance et les angles. Les valeurs seront listés dans la fenêtre Propriétés.

3 Segmentation base de la densité-automatique

Remarque: Les détails de la méthodologie décrits ci-dessous sont spécifiques à Amira, mais d'autres logiciels peuvent être utilisés à la place.

Utilisez cette méthode sur des ensembles de données avec n'importe quelle variété de contraste, netteté, ou cohue de retirer les densités d'intérêt.
données sur le volume des importations dans un programme équipé d'un seuil, baguette magique, ou d'autres outils à base de densité pour la segmentation automatique. Suivez les étapes décrites dans 2.1-2.1.2 dans les directions pour le traçage manuel.
Naviguez à travers les tranches et sélectionner la zone de segmentation. Si nécessaire, recadrer un sous-volume 3D plus petit pour la segmentation. Suivez les étapes décrites dans 2.2-2.2.2 dans les directions pour le traçage manuel.
Sélectionnez la densité deune fonction d'intérêt, généralement en cliquant ou en plaçant un point d'interrogation ou point d'ancrage sur la fonction. Si on le laisse dans le logiciel, entrez une plage de numéros englobant l'intensité de pixel de la fonction et régler cette tolérance comme vous le souhaitez. Densités appartenant à la fonction seront ramassés conformément à l'intensité de pixel ou de la tolérance de la valeur de l'ancre. Utilisez les commandes suivantes lors de l'utilisation Amira.
1. Utilisez la baguette magique pour les fonctions avec des marges distinctes.
  1. Cliquez sur la zone d'intérêt, puis d'ajuster les curseurs dans l'affichage et masquage de capturer gamme correcte de valeurs de sorte que la fonctionnalité est complètement mis en évidence. Ajouter la sélection de raccourci "a".
2. Utilisez l'outil de seuil pour les fonctions sans marges bien distinctes.
3. Sélectionnez l'icône du Seuil. Réglez la glissière pour régler la densité dans la plage souhaitable de sorte que seules les caractéristiques d'intérêt sont masqués. Cliquez sur le bouton Sélectionner, puis ajouter la sélection avec raccourci220; une ".
4. Pour tout le segment volume, sélectionnez Tous les tranches avant d'ajouter la sélection.
5. Pour supprimer le bruit, sélectionnez Segmentation> Supprimer îles et / ou segmentation> étiquettes lisses.
Génération d'une surface de visualisation et l'analyse qualitative de la manière décrite dans la section de traçage manuel 2.6-2.6.2. Si vous le souhaitez, l'exportation vers d'autres programmes pour l'affichage 3D adéquate, l'analyse quantitative et simulations.

4. personnalisé sur mesure automatisée de segmentation

Remarque: Utilisez cette méthode pour créer des scripts personnalisés pour la segmentation automatique, ce qui requiert de l'expérience de fond en informatique, mais permet la possibilité de créer un modèle de densité précis dans un grand volume.

Outils (exemple spécifique de la segmentation de Shape-supervisé dans MATLAB ²⁷⁾
1. Prétraitement d'images: Effectuer débruitage, suppression du fond et amélioration de l'imageen utilisant le pipeline suivantes:
  1. Charger l'image en utilisant la commande imread.
    1. Dans la ligne de commande, entrez: >> im = imread ($ image_path), où $ image_path est l'emplacement de l'image à analyser.
  2. De la boîte à outils de traitement d'image, appelez Wiener filtre en utilisant un ratio estimé ou connu bruit-puissance de signal (NSR).
  3. Sur l'image précédemment traitée, appeler la fonction image d'ouverture imopen pour estimer la couche de fond, puis affecter le résultat comme un masque différent.
    1. Dans la ligne de commande, entrez:. >> Background = imopen (im, strel ($ shape_string, $ taille)), dans cette méthode, $ shape_string est égal à 'dur' la variable $ taille est donnée par l'analyseur à savoir >> background = imopen (im, strel ('disque', 15)).
  4. Soustraire l'image filtrée avec le fond.
    1. Dans la ligne de commande, entrez: >> im2 = im -fond
  5. Selon la qualité des résultats, effectuez l'image normalisation avec ou sans la méthode de Otsu adaptatif ^28, qui peut être appelé en utilisant la fonction imadjust de l'Image Processing Toolbox.
    1. Dans la ligne de commande, entrez: >> im3 = imadjust (IM2)
  6. Préparer les caractéristiques d'intérêt pour la segmentation, ce qui limite les régions d'intérêt par recadrage de l'image normalisée.
    1. Utilisation de la commande imtool, explorer la région d'intérêt qui doit être recadrée et fournir les coordonnées de la commande: >> im3_crop = imcrop (im3, [x1 y1 x2 y2]), où le vecteur [x1 y1 x2 y2] correspond à la région carrée à recadrer.
2. La reconnaissance de forme / classification de forme supervisée: Former l'algorithme en fournissant des exemples spécifiques pour chaque catégorie d'objets (traces linéaires dans une image 2D à travers les éléments d'intérêt).
  1. Vérifiez que VLFEAT ²⁹ API est correctement installé et visitez le site Web de VLFEAT une documentation plus approfondie.
  2. Dans la ligne de commande, entrez: >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, K $, $ NLEAVES) où $ K est le nombre de cluster pour être utilisé ou le nombre de classes de l'observateur veut organiser les données dans, et NLEAVES $ est le nombre désiré de bouquets de feuilles à savoir >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100)
  3. Utiliser les fonctions segmentées manuellement l'entrée pour VLFeat.
    NOTE: Cette librairie open source basé C-va appliquer des rustines de pixels, le regroupement des parcelles et le positionnement du centre de l'amas en fonction du type de méthode choisie pour le mieux pour les jeux de données. Les options disponibles vont de regroupement k-moyenne basée sur texton à des approches ^30, et la sortie est un tableau numérique qui décrit les caractéristiques souhaitées basées sur les exemples donnés.
Segmentation: Utilisez cette fully automatisé, bien que coûteuse en ressources informatiques, l'approche à segments multiples classes d'objets simultanément, qui seront écrits comme des cartes séparées pour plus d'analyse et de visualisation.
1. Chargez le tableau numérique généré précédemment (modèle).
2. Appelez la fonction machine à vecteurs de support (SVM) dans VLFeat, en utilisant le modèle et l'image à segmenter comme une entrée.
  1. Dans la ligne de commande, entrez: >> [w, b] = vl_svmtrain (x, y, 0,1), où x est l'original image recadrée im2_crop et y est l'image objective, l'image qui a été segmenté manuellement. Utilisez >> ISEG = VL_IMSEG (I, LABELS) pour colorer les résultats en fonction des étiquettes générées par le regroupement.
    NOTE: Sur la base des caractéristiques du modèle, VLFeat classera l'image sur le nombre de classes (éléments d'intérêt) affectés depuis le début. Selon le degré de précision souhaitée, il est possible de combiner cette méthode avec d'autres approches ou estimation Clustparamètres de veuf tels que les centres de la coque et munitions. La sortie de l'algorithme de SVM est un modèle probabiliste et plusieurs masques binaires des classes désirées dans les nouveaux ensembles de données.
3. Enregistrer les résultats en entrant la commande: >> imwrite (im, $ format, $ filename) où $ format est "tiff" et $ filename est le chemin du fichier de sortie.
4. Pour visualiser les images, entrez la commande: >> imshow (im).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 1 montre un flux de production typique pour l'imagerie cellulaire par microscopie électronique 3D, y compris la tomographie électronique, FIB-SEM, et SBF-SEM. Le flux de production comprend la collecte de données brutes, l'alignement des données et la reconstruction en 3D d'un volume, la réduction de bruit par filtrage, et le cas échéant, de culture de la région d'intérêt afin de maximiser l'efficacité du logiciel de segmentation choisi. Ces données prétraité est alors prêt pour l'extraction de caractéristiques / segmentation.

La figure 2 illustre le flux de travail prévu dans la figure 1 avec quatre ensembles différents de données (qui seront présentés ci-après), dont deux sont des échantillons de résine enrobé enregistrées par tomographie électronique (figures 2A, 2B), avec les deux autres provenant de FIB -SEM et SBF-SEM, respectivement (figures 2C, 2D). Images de la figure 2 colonne 1 sont projectionvues (chiffres 2A1, 2B1) et des images de la surface de bloc (figures 2C1, 2D1), respectivement, qui, lors de l'alignement et de la reconstruction sont assemblés dans un volume 3D. La colonne 2 montre tranches par ces volumes en 3D, qui, après filtrage (colonne 3) montrent une réduction significative du bruit et donc apparaissent souvent plus nette. Après avoir sélectionné et le recadrage du grand volume 3D de la région d'intérêt (colonne 4), des rendus 3D de caractéristiques segmentées d'intérêt (colonne 5) peuvent être obtenus en plus inspectés, un code couleur et une analyse quantitative.

Un total de six ensembles de données 3D, chacun contenant une pile d'images obtenues soit par tomographie électronique (3 séries de données), FIB-SEM (2 Les ensembles de données), ou SBF-SEM (1 jeu de données) sont utilisés pour comparer la façon dont chacun des les quatre méthodes de segmentation réaliser (figure 3). Les ensembles de données proviennent d'une variété de différents projets de recherche en laboratoire et offrent ainsi areasonably ensemble diversifié d'ensembles de données expérimentales typiques. Tous les ensembles de données ont été examinés par quatre chercheurs indépendants, chacun d'entre eux sont les plus familiers avec une approche particulière, et ils ont été chargés de fournir le meilleur résultat possible pour chacun des six ensembles de données.

Les ensembles de données proviennent d'échantillons comme suit: 1 Les chiffres 3A1-3A5: haute pression congelé, gel-substitué et résine intégré poussin cheveux de l'oreille interne stéréocils des cellules ^31, 2. figures 3B1-3B5: haute pression congelées, lyophilisation substitué et la paroi cellulaire des plantes résine intégré (inédit), 3. figures 3C1-3C5: haute pression congelé, gel-substitué et intérieure kinocil des cellules ciliées de l'oreille de résine intégré (inédit), 4. figures 3D1-3D5: haute Pression- congelé, gel-substitué et blocs de mitochondries situées dans les cellules des glandes mammaires épithéliales humaines HMT-3522 S1 acini, qui ont été cultivées dans la laminine riche extracell résine intégréparti- matrice ^32,33, 5. figures 3E1-3E5: sans tache paillasse-transformés, les blocs d'un sulfate réducteur biofilms bactériens résine intégré (manuscrit en préparation), et 6 figures 3F1-3F5: limite membrane des cellules voisines de la HMT -3522 S1 acini.

Comme on peut le voir sur la figure 3, les différentes méthodes de segmentation peuvent conduire à des résultats essentiellement similaires pour certains types d'ensemble de données, mais des résultats totalement différents pour d'autres types de données. Par exemple, l'ensemble des données de stéréocils des cellules ciliées (figure 3A), on obtient des volumes de segmentation raisonnables avec les quatre approches, avec le modèle abstrait manuel généré par un utilisateur expert étant la plus claire à interpréter et à mesure. Dans ce cas, un tel modèle permet des mesures rapides de distances filament à filament, en comptant le nombre de liens trouvés entre les filaments allongés, ainsi que la détermination des parties manquantes de la carte de densité correspondantà des endroits où le spécimen a été endommagé lors de la préparation de l'échantillon ^34. Cette information est beaucoup plus difficile à acquérir à l'aide des trois autres approches de segmentation, bien que la segmentation automatique sur mesure fournit de meilleurs résultats que seuil purement basé sur la densité.

Pour la paroi cellulaire végétale (figure 3B), la génération de modèle manuel semble être la plus efficace pour transmettre un sens de l'ordre dans la paroi cellulaire, dont aucun des autres approches atteindre. Cependant, le modèle abstrait ne saisit pas la cohue des objets dans le jeu de données. Caractéristiques d'intérêt Tracer manuellement semble donner un meilleur résultat que les approches fondées sur la densité ou la forme supervisés. D'autre part, le suivi manuel est beaucoup de travail et l'identification des frontières des caractéristiques est quelque peu subjective. Par conséquent, les approches automatisées peuvent être préférés pour segmenter les grands volumes avec un arbitrage potentiel entre la précision etles ressources consacrées à la segmentation manuelle.

Pour l'ensemble de données de kinocil (figure 3C), manuel génération de modèle abstrait donne le résultat le plus propre et révèle une architecture inattendue de trois microtubules au centre de la kinocil, un détail qui est facilement visible dans les données cultivés, mais a perdu dans toutes les autres approches , probablement en raison de l'hétérogénéité tacher. Cependant, d'autres caractéristiques potentiellement cruciaux de la carte de densité sont manqués dans la génération manuelle d'un modèle abstrait. Cela est dû au fait que la nature subjective de la formation du modèle d'emploi conduit à une idéalisation abstraction et de la densité réelle observée, et donc à une interprétation subjective lors de la formation du modèle. Par conséquent, cet exemple démontre bien comment manuel génération de modèle abstrait permet de se concentrer sur un aspect spécifique du volume 3D. Cependant, la perception sélective et la simplification ne parvient pas à donner un compte rendu complet de tous les co protéinemplexes présents dans l'ensemble de données. Par conséquent, si l'objectif est de montrer la complexité des données, alors on est mieux servi avec l'un des trois autres approches.

Dans le cas de la matrice-culture 3D glande mammaire acini (figure 3D), les mitochondries de contraste élevé sont segmentés par les quatre approches avec facilité, avec le traçage manuel des fonctions ne rendant pas trop surprenant les meilleurs résultats avec le moins de contamination ( Figure 3D3). Toutefois, le suivi manuel est beaucoup de travail et est donc d'une utilité limitée pour les gros volumes. Tant seuil basé densité et la segmentation automatique de forme supervisée extraire les mitochondries très bien, et se traduirait par une segmentation presque parfait, si d'autres astuces pour le nettoyage sont utilisés (par exemple, en éliminant tous les objets ci-dessous un certain seuil de densité de voxel) que disponible dans des emballages différents. Dans ce cas, la construction du modèle abstrait manuel n'a donnédes résultats prometteurs, en partie parce que les mitochondries ne peuvent pas facilement être estimés avec des modèles de billes et de bras.

En ce qui concerne le sol bactérienne communauté / biofilm (Figure 3E), trois des quatre approches donnent des résultats raisonnables, avec la génération de modèle manuel pas de bons résultats en raison de la difficulté de représenter des objets biologiques, tels que les bactéries, par des formes géométriques. Appendices extracellulaires provenant de la bactérie peut être détectée dans les méthodes de segmentation automatique mais pas aussi bien dans la fonction traçage manuel. Forme supervisé segmentation automatique sur mesure peut en outre séparer les fonctions extracellulaires des bactéries en dépit de leurs densités similaires (données non présentées), permettant la quantification facile, même de très grands ensembles de données. Parce que c'est à l'origine un très grand ensemble de données, la segmentation automatique sur mesure clairement surpassés toutes les autres approches, mais peut-être bénéficié de la faible complexitéet la distribution relativement faible des objets d'intérêt (faible crowdedness).

Lors de l'examen de l'interface entre deux cellules eucaryotes dans un cadre analogue à un tissu (figure 3F), seul le traçage manuel des éléments d'intérêt a produit de bons résultats. Approches de segmentation fondé sur la densité automatisés ne parviennent pas à détecter la limite de la membrane entre les cellules adjacentes tout à fait, et même les approches sur mesure échoue, en partie parce que la forme d'une cellule n'est pas facilement approchée ou assimilé avec des formes, en dépit de son franc succès pour les bactéries dans le biofilm (figure 3E5).

L'observation de la figure 3 que les approches de segmentation font bien sur certains ensembles de données, mais pas sur d'autres a conduit à la question de ce qui caractérise chacun de ces ensembles de données, et s'il était possible de catégoriser les types de caractéristiques de données ou les objectifs personnels qui semblaient correspondent bien avec leur respectivapproche e. L'étude systématique de ce sujet n'a pas encore été réalisée, et donc comme une première étape, un établissement d'une liste empirique des caractéristiques de l'image et les objectifs personnels peut guider un débutant dans leur tentative de trouver la meilleure approche pour l'extraction de caractéristiques de leur jeu de données respectif.

Huit critères ont été identifiés comme significatifs sont présentés dans la figure 4, et ils peuvent être divisés en deux catégories principales: (1) les caractéristiques qui sont inhérentes à l'ensemble de données, et (2) objectifs personnels du chercheur et autres considérations qui sont un peu plus subjective, mais tout aussi important. Les exemples présentés sont principalement tirées des six ensembles de données à la figure 3, avec trois ensembles de données supplémentaires mises en place: l'une (figure 4A1) est un cryo-tomographie d'un cryo-section de la paroi cellulaire plante Arabidopsis thaliana, le deuxième (figures 4A2 , 4B1, 4D1 les figures 3F1-3F5 mais est encore plus marquée complexe, et le troisième (figures 4B2 , 4D2) est une résine section tomographie de la cellule intérieure stéréocils de cheveux de l'oreille en vue en coupe transversale, similaire à la teneur de l'échantillon représenté en vue longitudinale en Figuress 2A1-2A5 et 3A1-3A5.

Pour la catégorie des critères objectifs tels que les caractéristiques de l'image, quatre traits inhérents aux ensembles de données sont proposées pour être d'importance:

Le contraste de données peut être (1) faible (Figure 4A1) qui est typique pour les tomographies cryo-EM, (2) intermédiaire (Figure 4A2) comme dans les paysages cellulaires sans organite clair ou tout autre élément permanent de premier plan, ou (3) de haute (figure 4A3), comme c'est le cas pour la kinocitomographie auxi- ou stéréocils en coupe, en raison de l'alignement des éléments filamenteux nettement séparés dans la direction z.
Les données peuvent être floue (figure 4B1), avec pas de frontières claires entre visiblement deux objets étroitement positionnés, telles que les cellules dans un tissu, ou croquants (Figure 4B2), avec des limites bien définies. Ceci est en partie une fonction de la résolution de l'ensemble de données, qui est intrinsèquement plus élevée par un facteur d'environ 2 à 4 pour des tomographies d'électrons par rapport à FIB-SEM. Naturellement, les frontières plus nettes sont souhaitables à la fois manuel ainsi que des approches de segmentation automatique, mais essentiel pour la dernière approche.
Les cartes de densité peuvent être soit bondé (Figure 4C1) comme en témoigne les composants étroitement espacés de la paroi cellulaire des plantes, ou peu peuplée (Figure 4C2), comme le sont les bactéries dans une colonie, qui illustre la séparation qui rend automatique la segmentation d'images beaucoup plus facile.
cartes de densité peuvent être très complexes avec énormément des caractéristiques différentes, souvent avec des formes irrégulières, tels que les tissus de la strie autour d'un vaisseau sanguin (Figure 4D1) ou objets organelles comme bien définies avec une organisation similaire, tels que les stéréocils en coupe ( Figure 4D2).

A noter également les très différentes échelles dans les différents exemples, qui rend la comparaison un peu difficile.

Outre les critères plus objectifs tels que les caractéristiques de l'image, quatre critères très subjectifs qui guideront la sélection du chemin d'accès approprié sont également proposés:

Objectif souhaité: L'objectif peut être de visualiser les cheveux bundle stereocilium dans sa complexité et de déterminer et d'examiner la forme de l'objet (figure 4E1), ou pour créer une boule et bâton modèle simplifié et abstrait qui est intégré dans la carte de densité et permet un comptage rapide d'une mesure des objets géométriques (longueur du filament, la distance et le nombre de connexions) (Figure 4E2).
La fonction morphologie peut être très irrégulière et complexe comme les cellules, telles que les zones d'interaction cellule-cellule (figure 4F1), un peu de forme similaire, avec quelques variations, tels que les mitochondries (figure 4F2), ou la plupart de forme identique, comme les filaments d'actine et croix liens dans une touffe de cheveux en orientation longitudinale (Figure 4F3).
La proportion de la caractéristique d'intérêt (densité de population) est importante, car on peut vouloir secteur toutes les caractéristiques d'un ensemble de données 3D, comme c'est le cas pour les parois cellulaires de la plante (Figure 4G1), ou seulement une fraction minuscule du volume cellulaire comme c'est le cas des mitochondries dans une scène cellulaire hétérogène (Figure 4G2). Selon la taille de l'ensemble de données et le pourcentage de volume qui nécessite segmentation, il peut être plus efficace à utiliserapproches manuelles. Dans d'autres cas, comme lorsque l'on s'intéresse à une variété de fonctions, il est tout simplement pas d'alternative à l'utilisation d'approches semi-automatiques de segmentation.
Un autre critère subjectif clé est la quantité de ressources on est prêt à investir dans le processus de segmentation et le niveau de fidélité est nécessaire pour répondre à une question biologique. On peut vouloir et le besoin de quantifier les paramètres volumétriques d'un trait (tels que la taille, le volume, surface, longueur, distance des autres fonctionnalités, etc), dans ce cas, plus de soins peut être nécessaire d'obtenir des informations quantitatives précises (Figure 4H1), ou le but peut être pour enclencher simplement une photo de sa forme 3D (Figure 4H2). Dans un monde idéal où les ressources sont illimitées, on pourrait bien ne pas vouloir faire de compromis, mais plutôt opter pour le chemin le plus précis de l'extraction de caractéristiques manuelle assistée par l'utilisateur. Même si cela peut fonctionner pour beaucoup de jeux de données, dans un proche avenir volumes 3D wil l être de l'ordre de 10k par 10k par 10k ou plus, et la segmentation manuelle ne sera plus en mesure de jouer un rôle de premier plan dans la segmentation d'un tel espace énorme. En fonction de la complexité des données et d'autres caractéristiques de données, la segmentation semi-automatique peut devenir nécessaire.

Dans la figure 5, les points forts et les limites sont brièvement énumérés pour les quatre approches de segmentation. Les objectifs personnels et caractéristiques de l'image identifiées dans la figure 4 qui peuvent s'apparier avec chaque approche sont décrits ainsi. Dans la figure 6, les objectifs personnels et les caractéristiques de l'image des six ensembles de données illustrent comment trier les données et décider de la meilleure approche. Les deux figures 5 et 6 sont développés au cours du débat.

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Figure 1: Flux de travail pour la reconstruction de l'imagerie biologique et l'analyse. Ce tableau donne un aperçu des différentes mesures prises pour collecter et traiter les images recueillies par tomographie, faisceaux d'ions focalisés SEM, et le visage de bloc série SEM. Résultats bruts de collecte de données en 2D série d'inclinaison ou des coupes en série. Ces séries d'images en 2D et doivent être alignés en 3D reconstruit, puis filtré afin de réduire le bruit et augmenter le contraste des caractéristiques d'intérêt. Enfin, les données peuvent être ventilés et analysés, entraînant finalement dans un modèle 3D. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2.. Exemples de flux de travail pour les différents types de tomographie et FIB-SEM Chaque étape du processus après la collecte des données Les données sont affichées par quatre ensembles de données (lignes AD): résine embarqués tomographie teinté de stéréocils en coupe longitudinale, résine intégré tomographie teinté de la paroi cellulaire des plantes cellulose, FIB-SEM du sein cellules épithéliales mitochondries, et SBF-SEM de E. colibacilles. Une tranche 2D dans les données brutes sont présentées dans la colonne 1, et une image à partir des données après l'alignement et de la reconstruction 3D comprend la colonne 2 Les techniques de filtrage appliquées dans la colonne 3 sont les suivants: filtre médian (A3), filtre de diffusion non-anisotrope (B3), flou gaussien (C3), et le filtre à imadjust de MATLAB (D3). Un exemple de la meilleure segmentation pour chaque ensemble de la superficie cultivée d'intérêt (colonne 4) les données sont affichées comme un rendu 3D de la colonne 5. barres d'échelle: A1-A3 = 200 nm, A4 = 150 nm, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm, D4-D5 = 200 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 Application des quatre approches de segmentation exemple des ensembles de données Six exemple des ensembles de données ont été segmentées par les quatre approches:. Génération manuelle abstraite de modèle, traçage manuel, automatique segmentation basé sur la densité, et de segmentation automatique sur mesure. Manuel abstraite génération de modèle était efficace pour la résine intégré tomographie teinté de stéréocils (A), que le but était de créer un modèle à des fins quantitatives plutôt que d'extraire les densités. Pour la résine intégré tomographie teinté de la paroi cellulaire végétale (B), automatisé segmenta basé sur la densitétion était la méthode la plus efficace pour extraire rapidement la cellulose par de nombreuses tranches, alors que les méthodes manuelles ont eu beaucoup plus d'efforts que sur quelques tranches de données. Manuel abstraite génération de modèle généré le triplet de microtubules dans la tomographie teinté de kinocil (C) tandis que d'autres méthodes de segmentation fait pas, mais les deux approches automatisées extrait les densités plus rapidement et ont donc été préféré. En raison de la forme des mitochondries de FIB-SEM des cellules épithéliales mammaires (D), le traçage manuel fourni le résultat plus propre, et la faible densité de population combinée à l'utilisation de méthodes d'interpolation ont permis de segmentation rapide. Compte tenu de l'important volume qui doit être segmenté, taillé sur mesure segmentation automatique s'est avéré être le plus efficace pour segmenter les SBF-SEM bactéries données (E), mais les deux approches automatiques étaient comparables. Bien que beaucoup de temps, la seule méthode pour extraire le FIB-SEM de la membrane de cellules épithéliales du sein (F) a été suivi manuel des barres d'échelle.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, barres = 500 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

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Figure 4: caractéristiques de l'image de l'objectif et des objectifs personnels subjectifs pour le triage des ensembles de données. L'aide d'exemples de l'ensemble de données caractéristiques, critères sont proposés pour informer une décision quant à la segmentation approche à utiliser. En ce qui concerne les caractéristiques objectives, les données peuvent intrinsèquement un contraste qui est faible, moyen ou élevé (A1-A3), d'être floue ou nette (B1-B2), espacées ou bondé (C1-C2), et ont complexe ou tout simplement caractéristiques organisés (D1-D2). Objectifs personnels subjectifs comprennent la o souhaitée bjectif ciblant un modèle simplifié ou d'extraire les densités exactes (E1-E2), l'identification d'une feuille alambiquée, le volume alambiquée, ou la morphologie linéaire que la caractéristique d'intérêt (F1-F3), le choix d'une forte ou faible densité de population la fonction d'intérêt (G1-G2), et se prononcer sur le compromis entre haute fidélité et haute d'allocation des ressources pour une diminution du rendement des investissements tels que le temps (H1-H2) Les barres d'échelle:. A1 = 50 nm, A2 = 1500 nm , A3 = 100 nm, B1 = 1500 nm, B2 = 200 nm, C1 = 100 nm, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, E1 = 100 nm, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, F3 = 50 nm, G1 = 100 nm, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5 Tableau de comparaison des caractéristiques des données et vise subjective adapté aux différentes approches de segmentation. Ce tableau résume les points forts et les limites de chaque méthode de segmentation. Les critères de la figure 4 peuvent aider à identifier des ensembles de données qui sont appropriés pour la méthode de segmentation. Ces caractéristiques de l'image objectives et subjectives objectifs personnels ont été choisis pour une utilisation optimale de chaque approche, mais différentes combinaisons peuvent entraver ou faciliter l'efficacité de la segmentation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6 décision organigramme efficace tma- de segmentation des approches pour les jeux de données avec des caractéristiques différentes. Basé sur les caractéristiques mises en évidence dans la figure 4, ce schéma illustre qui quatre critères ont le plus contribué à la décision finale sur la meilleure approche de segmentation pour chaque ensemble de la figure 3 données. Chaque jeu de données est un code couleur à suivre rapidement les lignes en gras représentent le processus de prise de décision primaire, ainsi que les lignes pointillées qui reflètent un autre chemin qui peuvent ou peuvent ne pas conduire à la même approche. Les kinocil, les bactéries et les ensembles de données de la paroi cellulaire des plantes ont été mieux segmentés avec les deux approches automatisées. En revanche, les chemins de la membrane cellulaire et des mitochondries conduisent toujours au traçage manuel en raison de leurs caractéristiques difficiles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

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Des stratégies efficaces pour l'extraction de caractéristiques pertinentes de volumes 3D EM sont nécessaires de toute urgence pour faire face à la tsunami de données qui a récemment frappé l'imagerie biologique. Bien que les données peuvent être générés en heures ou en jours, il faut plusieurs mois pour analyser les volumes 3D en profondeur. Par conséquent, il est clair que l'analyse de l'image est devenue le goulot d'étranglement pour les découvertes scientifiques; sans solutions adéquates à ces problèmes, spécialistes de l'imagerie deviennent les victimes de leur propre succès. C'est en partie en raison de la grande complexité des données et aussi l'encombrement macromoléculaire l'on trouve généralement dans les cellules biologiques, où les protéines et complexes protéiques frontière un autre et essentiellement apparaissent comme un gradient continu de densité en niveaux de gris. Le problème est compliqué par la préparation d'échantillons et d'imagerie imperfections, et dans certains artefacts de reconstruction d'image des cas, conduisant à moins que parfait données volumétriques qui peuvent poser des défis pour l'approche entièrement automatiséees. Le plus important, cependant, est le fait que les experts dans la préparation des échantillons, l'imagerie et l'interprétation biologique sont rarement bien versés dans la science informatique, et donc besoin de conseils sur la façon d'aborder efficacement l'extraction et l'analyse fonctionnalité. Par conséquent, grâce à l'utilisation de divers exemples, le protocole explique comment préparer les données de segmentation, ainsi que les étapes de génération d'emploi abstraite de modèle et automatisé de segmentation basé sur la densité, le traçage manuel des éléments d'intérêt et la segmentation automatique sur mesure. Les approches manuelles et automatiques décrites dans la procédure peuvent être trouvés dans une grande variété de logiciels de segmentation, dont certains sont mentionnés ici, mais d'autres remplissent des fonctions similaires et sont également bien adapté.

Les résultats montrent que l'efficacité de chacune des méthodes de segmentation 3D varie pour chaque type d'ensembles de données différents. Même si les différentes approches produits qualitativement srendus 3D es mesures analogues que le produit final, la quantité de temps et les efforts consacrés à chaque cours du processus de segmentation varié de manière significative. Les recommandations pour les caractéristiques de l'image appropriés et objectifs personnels par approche de segmentation sont résumées dans la figure 5, qui est expliqué plus en détail dans les quatre sous-sections suivantes. Ces critères ont été appliqués pour les six ensembles de données, comme indiqué dans le tableau des flux de décision de la figure 6. Bien que les figures 5 et 6 sont simplement destinés à fournir une justification pour chaque ensemble de données et la façon dont chacun des critères ont été pondérés dans le processus de prise de décision, ils ne fournissent pas une orientation à toute épreuve, mais plutôt un point de départ. Il ya tout simplement trop de critères qui influencent le processus de prise de décision: certains sont des critères objectifs, tels que les caractéristiques des ensembles de données, tandis que d'autres sont des critères plus subjectifs, tels que l'objectif recherché. Il est sûr de dire que les ensembles de données qui affichent un haut nivel de contraste avec des limites nettes nettes, ont des caractéristiques qui sont bien séparées et relativement homogène (pas trop diverse), et sont traités avec l'objectif d'afficher un modèle de densité pour un grand nombre d'objets, des approches automatisées seront supérieurs, si ce n'est pour le fait que les approches manuelles seraient tout simplement des ressources (temps) -prohibitive. D'autre part, si le contraste est faible, les données est floue et nécessite des connaissances d'un expert, les objets sont bondés, et les caractéristiques montrent une grande diversité et sont donc hétérogène donc, on ne peut pas avoir d'autre choix que l'extraction manuelle de fonction / segmentation.

Manuel abstrait Modèle génération

Manuel abstraite modèle suivi est particulièrement efficace pour segmenter les éléments linéaires, la fourniture de semences points (balles) qui peuvent être connectés automatiquement (bâtons). Ces balles et bâtons-modèles peuvent être très puissants pour mesurer la longueur d'une orientation de ce modèle et de fournir un modèle abstrait de manière adéquate à la fois pour l'inspection qualitative et l'analyse quantitative. Manuel génération de modèle abstrait est couramment utilisé lors de la réduction des ressources consacrées à l'analyse est plus importante que la fidélité absolue à la forme des données d'origine. Il est plus efficace avec des fonctions linéaires et homogènes d'intérêt (par exemple, des filaments, des tubes). contraste des données, la précision, et crowdedness ne jouent pas un rôle majeur dans la détermination de la réussite de cette méthode, aussi longtemps que l'oeil humain peut reconnaître l'objet d'intérêt. Parfois, de tels modèles peuvent également être utilisés en tant que squelette pour le segment de la carte en 3D dans une zone autour du squelette. Bien que le modèle est abstrait plutôt que le reflet de densités exactes, il représente une version squelette de la densité de 3D et permet la visualisation sans encombrement et analyse qualitative ainsi. Des mesures quantitatives telles que la longueur peut également être déterminée à partir du modèle approximatif. Pour unexemple de logiciel avec manuel génération modèle abstrait, s'il vous plaît visitez mode d'emploi détaillé de Chimera en ligne à http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

Traçage manuel des éléments d'intérêt

Manuel pinceau traçage fonctionne bien avec presque toutes les caractéristiques des données, mais il est aussi le plus de temps méthode consommer. Parfois, il est la seule technique pour extraire une caractéristique d'intérêt à partir d'un ensemble d'images complexes contenant une grande variété de fonctions, telles que la membrane cellulaire fine et compliquée. Un outil utile disponible dans certains programmes permet l'interpolation entre des tranches segmenté de façon discontinue lorsque la fonction d'intérêt change en douceur. Traçage manuel peut être appliqué le plus efficacement si les données est croquante et moyennement à contraste élevé, mais il peut également être utilisépour les ensembles de données plus difficiles, aussi longtemps que l'utilisateur est familiarisé avec l'objet d'intérêt. La complexité des données peut varier à partir d'objets discrets à des ensembles de données complexes et surpeuplées, où les objets sont étroitement emballés. Dans ce dernier cas, la segmentation manuelle peut être le seul choix, que les approches automatiques ont souvent du mal à segmenter le volume désiré et extraire trop ou trop peu. Morphologies de longs difficiles, comme des feuilles ou des volumes alambiquées, peuvent également être extraites par cette méthode. Toutefois, l'utilisateur doit garder à l'esprit qu'un ensemble de données avec plusieurs caractéristiques difficiles ne peut être segmenté si la densité de population des éléments d'intérêt est faible, la segmentation de fortes densités de population des éléments d'intérêt devient temps prohibitif. Pour un exemple de logiciel de traçage manuel, s'il vous plaît visitez mode d'emploi détaillé de Amira ligne à http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

Segmentation en fonction de la densité automatisé

Contrairement aux techniques manuelles, les approches automatisées sont généralement moins de temps, ce qui est un facteur important à considérer lors de segmenter une grande pile d'images. Cependant, seuillage simple ne peut pas être aussi précis, et beaucoup plus de temps peut être dépensé sur le raffinement et la conservation du volume segmenté automatiquement. Segmentation de la densité automatique qui fonctionne le mieux sur des ensembles de données qui affichent un grand nombre de caractéristiques similaires d'intérêt qui nécessitent tous segmentation. Si les données sont plus complexes, ces techniques automatisées peuvent encore servir comme un premier pas, mais auront probablement besoin d'une intervention manuelle sur la ligne afin de spécifier un sous-volume contenant la caractéristique d'intérêt. Cette stratégie fonctionne généralement bien sur morphologies linéaires ou volumes alambiquées, mais il est rarement couronnée de succès avec de fines feuilles compliquées telles queles membranes cellulaires. Intervention minimale de l'utilisateur avec des approches automatisées permet la segmentation par de grands ou de petits volumes, tout en dépensant peu de ressources de l'utilisateur, tels que le temps de retour pour la haute fidélité. Pour un exemple de logiciel avec une segmentation en fonction de la densité automatique, s'il vous plaît visitez mode d'emploi détaillé de Amira ligne à http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

Taillés sur mesure automatisée de segmentation

Taillé sur mesure segmentation automatique permet la personnalisation de puissance des algorithmes pour un ensemble de données spécifique, mais il est souvent spécifique à l'ensemble de données ou le type de données, appropriées pour un nombre limité de caractéristiques de la forme, et ne peut être généralisé facilement. La procédure présenté ici diffère des approches de segmentation automatiques générales, telles que l'immersion des bassins versants et d'autres niveaux méthodes set, qui s'appuient sur une décision programmée de points de semences critiques, suivie par l'expansion de cube marche rapide de ces points de semences. Une variation sur ce thème est la segmentation frontière, où l'information de vecteur de gradient informe longs limites. En revanche, le script personnalisé utilisée ici repose sur une étape de formation dans laquelle l'utilisateur trace manuellement quelques exemples. Grâce à l'apprentissage de la machine, des algorithmes spécifiques permet de détecter et apprendre à reconnaître indépendamment des propriétés et caractéristiques des données régulièrement trouvés dans les traces. Un utilisateur expert peut recycler les algorithmes et améliorer la précision de la segmentation par exemple dont plus trace de fournir un ensemble plus large de critères de fonctionnalité. Dans l'ensemble, les approches de seuillage et approches connexes, ou même sur mesure peuvent ne pas être aussi utile pour extraire un seul élément d'intérêt d'une image de la diversité complexe des organites ou des formes, comme curation peut être tout aussi laborieux que le traçage manuel.

Stratégies de triage des données et choix d'une approche de segmentation

Compte tenu des critères subjectifs et objectifs présentés dans la figure 4 et un résumé des ensembles de données appropriés à la figure 5, le système de prise de décision représentée sur la figure 6 peut aider une évaluation efficace des stratégies d'extraction de caractéristiques pour une grande variété d'ensembles de données. Les ensembles de données sont triés en quatre décisions consécutives, dont chacune peut inclure l'une quelconque des quatre objectifs respectifs ainsi que les quatre critères subjectifs introduits dans la figure 4. À titre d'exemple, la figure 6 représente la logique de triage chacune des données six ensembles présentés dans la figure 3. Sans aucun doute, pour chaque ensemble de données, il n'est pas un seul chemin unique, mais plutôt différents chemins à travers cette matrice suivants différents critères de prise de décision qui peut conduire to identiques ou différents recommandation de segmentation de données. Bien que chaque ensemble de données aura son propre ensemble de propriétés qui ne peuvent pas être anticipés, six exemples sont donnés, chaque paire avec une explication de la raison d'être de l'approche d'extraction / de segmentation caractéristique préférée. La plupart comprennent également une proposition pour une décision itinéraire alternatif qui entraîne l'utilisation de la même ou une approche de segmentation différente (Figure 6).

Le kinocil est un ensemble avec des frontières clairement définies, ce qui rend les approches automatisées plus de chances de réussir données nettes. Tous les éléments d'intérêt sont bien séparés, favorisant encore une approche automatisée. En outre, les caractéristiques d'intérêt sont semblables les uns aux autres, ce qui en fait un ensemble relativement homogène de données idéal pour la segmentation sur mesure. Enfin, l'objectif était d'extraire la fonction entière, en privilégiant une approche semi-automatique. En conséquence, il a été conclu qu'un seuillage automatique (solide ligne verte) ainsi que d'un (par exemple, la forme de segmentation supervisée) approche conçue sur mesure (ligne pointillée verte) sont à la fois susceptibles de bien faire sur cet ensemble de données.

Des critères similaires, bien que placé dans un ordre différent dans le réseau de prise de décision, s'appliquent au cas de bactéries. Une approche sur mesure est recommandé en partie parce que cet ensemble de données était très grande; par conséquent, les ressources limitées interdisent manuel une approche d'intervention / de segmentation de la main-d'œuvre. Bien seuil aurait donné des résultats acceptables, l'approche sur-mesure a été en mesure d'exécuter des principaux objectifs de l'étude de séparer les formes bactériennes arrondies des gisements de métaux extracellulaires, situés soit en entre les bactéries ou juste à côté des bactéries, et donc la approche sur mesure a été préféré.

Pour les ensembles de données de stéréocils, la première considération était l'objectif recherché: l'objectif peut être soit de montrer toute la densitéou pour créer des modèles géométriques. Le volume d'intérêt est une zone très peuplée, et l'objectif était de segmenter un grand nombre d'objets comme des objets séparés afin d'exécuter la suite l'analyse volumétrique quantitative, y compris des longueurs, des chiffres, des distances, orientation, etc Il était utile que les objets de intérêt était essentiellement linéaire, et ce fait modèle géométrique tracer la méthode de choix. Toutefois, si, au lieu de l'objectif a été de montrer toute la densité, alors la fonction morphologie linéaire ainsi que relativement à contraste élevé avec des limites bien définies ferait un protocole de seuillage automatique possible.

Les membranes cellulaires et des cas de données de mitochondries sont difficiles pour les approches automatisées en raison de leurs catégories de fonction morphologie: feuilles et les volumes alambiquées, respectivement. L'objectif est de retracer la cellule ou les mitochondries contour avec précision, mais il ya des ressources ne finis pour le faire. En outre, les caractéristiques des interEst sont complexes et ne peut pas être facilement détecté automatiquement ou forme codée, bien que pour les données de mitochondries définit l'approche de script personnalisé prises pour que les bactéries peuvent éventuellement être appliqué avec davantage de personnalisation. Heureusement, la membrane et les mitochondries se ne représentent qu'une petite fraction de la totalité du volume et, par conséquent, le traçage manuel est une simple approche de temps bien. Traçage manuel est également la méthode de choix pour ces ensembles de données lorsque le contraste est assez faible et les limites sont assez floues. En conséquence, même si elles constituent une partie importante des ensembles de données, ces feuilles compliquées doivent être tracées à la main, tout simplement en raison de l'absence d'une meilleure alternative.

L'ensemble de données de l'installation pose ses propres défis parce que le but était de segmenter tous les objets, qui sont densément espacées et forment un paysage encombré. Affichage de la densité tel quel permettrait mesures concernant la forme et l'organisation des objets, mais barce segmenter manuellement chaque objet filamenteux est trop coûteux, seuillage automatique a été utilisé à la place.

Les étapes et les résultats correspondants dans la création d'un modèle 3D ont été affichées ici, mais plus important encore, les caractéristiques des données et des critères personnels jugées cruciales pour déterminer le meilleur chemin de segmentation ont également été élucidé. Les caractéristiques importantes des données d'image lui-même comprennent ce qui est décrit ici comme l'inverse, crowdedness, croustillant, et le nombre de formes différentes ou des caractéristiques (telles que des organelles, des filaments, des membranes). Critères subjectifs à considérer l'objectif souhaité de segmentation (mesure / comptage, la représentation squelette des données / afficher des volumes dans des rendus 3D), les caractéristiques morphologiques de la fonction d'intérêt (linéaire, allongé, en réseau, complexe, alambiquée), la densité de caractéristiques d'intérêt par rapport à la totalité du volume (la fraction des objets qui sontimportants et devront être extraites), et d'équilibrer les compromis de consacrer des ressources à la fidélité de la segmentation des données d'origine et le rendement décroissant de l'investissement a entraîné des améliorations supplémentaires pour l'allocation des ressources sensiblement plus élevé.

Le domaine de la segmentation d'image a considérablement évolué au cours des dernières années, mais il n'y a pas de solution miracle, pas d'algorithme ou un programme qui peut tout faire. ensemble de données de tailles ont augmenté de plusieurs centaines de mégaoctets de routine des dizaines de giga-octets, et ils sont maintenant de commencer à dépasser téraoctets, ce qui rend presque impossible la segmentation manuelle. Ainsi, davantage de ressources doivent être investies dans les approches d'extraction de caractéristiques intelligentes et temps-efficace qui imitent le processus de prise de décision humaine. Ces efforts devront être combiné avec (1) Système d'information géographique (SIG) à base de bases de données hiérarchiques sémantiques (similaire à Google Earth), (2) les techniques d'abstraction de données (c.-à-transitiond'un voxel de représentation géométrique / volumétrique) compatible avec conception assistée par ordinateur (CAO) afin de réduire considérablement la quantité de données et permettant ainsi l'affichage de plus grands volumes ^{de 35,} (3) les techniques de simulation, car ils sont fréquemment utilisés dans le disciplines de l'ingénierie, ainsi que (4) animation de pointe et la réalisation de films capacités, y compris des animations de survol par (semblables à ce qui est mis au point pour l'industrie du jeu).

De toute évidence, l'extraction de caractéristiques efficace et la segmentation est au cœur de cette révolution à venir dans cellulaire imagerie à haute résolution, et alors que de meilleures approches seront toujours nécessaires, les principes présentés ici, ainsi que les exemples de ce que l'approche a été prise pour différents types de données , fournira de précieuses informations pour prendre une décision sur l'approche à adopter.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

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Nous tenons à remercier Tom Goddard de l’Université de Californie à San Francisco pour son aide indéfectible avec Chimera, Joel Mancuso et Chris Booth de Gatan, Inc. pour leur aide dans la collecte de données SBF-SEM de l’ensemble de données sur les bactéries, Doug Wei chez Zeiss, Inc. pour son aide dans la collecte de données FIB-SEM de l’ensemble de données sur les cellules épithéliales, Kent McDonald du laboratoire de microscopie électronique de l’Université de Californie à Berkeley pour ses conseils sur la préparation des échantillons, l’imagerie TEM et la tomographie, Roseann Csencsits du Lawrence Berkeley National Laboratory pour son aide à la prise de l’image cryo-TEM, Elena Bosneaga pour la cryo-section de l’ensemble de données de la plante, Jocelyn Krey de l’Oregon Health and Science University pour la dissection du tissu utriculaire, David Skinner du National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) et Jitendra Malik de l’Université de California Berkeley pour leurs conseils en infrastructure logicielle, et Pablo Arbelaez de l’Université de Californie à Berkeley pour ses contributions aux codes du script sur mesure présenté dans cet article.

La recherche a été soutenue par le Département de l’énergie des États-Unis, Office of Science dans le cadre du contrat n°. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], ainsi que la subvention n° 100 des National Institutes of Health (NIH) des États-Unis. P01 GM051487 [M.A.] pour le projet de cellules ciliées de l’oreille interne et l’utilisation d’instruments de microscopie.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Comments
Amira	FEI Visualization Sciences Group	http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera	UCSF	http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ	National Institute of Health	http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD	Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells	http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop	Adobe	http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB	MathWorks	http://www.mathworks.com/
VLFeat	VLFeat	http://www.vlfeat.org/

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De voxels à la connaissance: Un guide pratique de la segmentation du complexe microscopie électronique 3D-données

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