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Article de méthode

Détection in situ de autoréactifs T CD4 des cellules dans le cerveau et le cœur à l'aide majeur d'histocompatibilité Dextramers classe II

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DOI :

10.3791/51679

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1 août 2014

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1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska, Lincoln, 2Center for Biotechnology, University of Nebraska, Lincoln, 3Nebraska Center for Virology and School of Biological Sciences, University of Nebraska, Lincoln

Dans cet article

Résumé

Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d'histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène in situ est également conçu.

Résumé

Ce rapport démontre l’utilisation de dextramères de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) pour la détection in situ de lymphocytes T CD4 autoréactifs dans l’encéphalomyélite auto-immune (EAE) expérimentale induite par la protéine protéolipide de myéline (PLP) 139-151 chez les souris SJL et la myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induite par la myosine lourde α (Myhc) 334-352 chez les souris A/J. Deux séries de cocktails de réactifs de dextramères ont été utilisées, où les cellules dextramères+ ont été analysées par microscope confocal à balayage laser (LSCM) : EAE, IAs/PLP 139-151 dextramères (spécifiques)/anti-CD4 et IAs/Theiler’s murine encéphalomyélite virus (TMEV) 70-86 dextramères (contrôle)/anti-CD4 ; et EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramères/anti-CD4 et IAk/ribonucléase bovine (RNase) 43-56 dextramères (témoin)/anti-CD4. L’analyse LSCM de coupes cérébrales obtenues chez des souris EAE a montré la présence de cellules positives pour les dextramères CD4 et PLP 139-151, mais pas pour les dextramères TMEV 70-86, suggérant que la coloration obtenue avec les dextramères PLP 139-151 était spécifique. De même, des coupes cardiaques préparées à partir de souris EAM ont également révélé la présence de cellules Myhc 334-352, mais pas de cellules RNase 43-56-dextramer+ comme prévu. De plus, une méthode complète a également été conçue pour analyser quantitativement les fréquences des lymphocytes T CD4 spécifiques de l’antigène dans les images en série « Z ».

Introduction

L'utilisation de complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères pour la détection de cellules spécifiques de l'antigène T CD4 a été un défi 1-7. Pour améliorer la sensibilité de détection de tétramères CMH de classe II, l'équipe de recherche a créé des tétramères de la prochaine génération, désignés "dextramers" 8. Dextramers contiennent des squelettes de dextrane dans lequel de multiples fragments de streptavidine fluorophore sont conjugués, tels que plusieurs monomères du CMH biotinylés, des peptides attachés peuvent être attachés à une molécule de dextran 9. Ainsi, de grands agrégats de dextramers CMH qui contiennent plusieurs complexes CMH-peptide peut interagir avec plusieurs récepteurs de cellules T (TCR).

Ce groupe a récemment généré dextramers pour différents auto-antigènes et a démontré que la sensibilité de détection de dextramers était environ cinq fois plus que les tétramères 8. Les systèmes expérimentaux comprennent encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) induite par la protéine protéolipidique (PLP) 139-151 chez la souris SJL; EAE induite par la glycoprotéine de la myéline des oligodendrocytes (MOG) 35-55 dans C57BL / 6 souris; et la myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induite avec la myosine cardiaque chaîne lourde α-(MyHC) 334-352 chez des souris A / J. Cette étude démontre l'utilisation de PLP 139-151 - 334-352 dextramers MyHC et pour détecter les cellules spécifiques de l'antigène T CD4 in situ avec une spécificité en développant un protocole de coloration directe, éliminant ainsi la nécessité pour amplifier les signaux en utilisant des anticorps à partir de fluorophores, un approcher couramment employé à l'utilisation de tétramères. En outre, un procédé global de l'évaluation des tissus ont également été mis au point pour énumérer de manière fiable les fréquences des cellules T CD4 spécifiques de l'antigène in situ 10. La détection de cellules T spécifiques de l'antigène in situ permet la délimitation des événements provoqués par des stimuli antigéniques spécifiques de ceux causés par l'activation de l'observateur. De même, la technique in situ également PROVIDes possibilités pour suivre la cinétique d'infiltrations de cellules T spécifiques de l'antigène dans les organes cibles.

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Protocole

Déclaration d'éthique:

Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par l'Université de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.

Une. Induction de l'EAE

  1. Pour induire l'EAE, préparer l'émulsion de peptide / de l'adjuvant complet de Freund (CFA), comme décrit dans 11 avec les modifications suivantes: Etape 1.1:. Préparer PLP 139-151, à une concentration de 1 mg / ml dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) Étape 1.4:. utiliser 200 ul de FCA émulsion contenant 100 ug de PLP 139-151 par animal étape 1.4.1: pour immuniser des dix animaux, préparer 2 ml d'émulsion en mélangeant 1 ml de PLP 139-151 (1 mg / ml dans 1 x . PBS) et un volume égal de CFA étape 1.5: injecter 200 pi d'émulsion en doses fractionnées voie sous-cutanée dans les deux régions inguinales (~ 75 pi de chacun) et région sternale (~ 50 pi) de cinq à six semaines d'âge FEMAsouris le SJL / J. Les étapes 1.7 et 1.8 ne sont pas applicables pour l'induction de l'EAE.

2. Notation clinique des souris EAE et récolte de cerebrums

  1. Surveiller les animaux pour apparition des signes cliniques, et marquer la maladie gravité tous les jours de 9 jours après immunisation comme suit: 0 - sain; 1 - mou queue ou des membres postérieurs faiblesse, mais pas les deux; 2 - mou queue et des pattes postérieures faiblesse; 3 - paralysie partielle des membres postérieurs; 4 - la paralysie complète des membres postérieurs; 5 - morts ou moribonds 12.
  2. Euthanize la souris quand ils atteignent un score neurologique de 3 ou 4 à l'aide de CO 2. Pour euthanasier les souris, pré-remplir la chambre d'euthanasie d'abord avec le CO 2 en tournant le régulateur du réservoir de CO 2 ne dépassant pas 6 psi et permettre aux animaux de rester dans la chambre pendant environ 5 min pour atteindre l'asphyxie complète. Faire tremper les animaux euthanasiés dans 70% d'alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l'aide d'une paire de stérile pourcèpes et ciseaux exposent les cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs.
  3. Creuser le crâne en coupant le crâne de façon circulaire à l'aide d'une paire de ciseaux courbes, et soigneusement, retourner les os du crâne avec une pince. Récolter le cerveau par émousser la dissection et l'aide d'un scalpel propre, cerveau séparé du cervelet. Placez le cerveau dans un tube contenant froid 1x PBS et laisser le tube sur la glace jusqu'à ce que le traitement.

3. In Situ coloration des sections cérébrales avec CMH de classe II (IA s) / PLP 139-151 Dextramers

  1. Préparer 4% PBS tamponnée d'agarose bas point de fusion, fondu par chauffage à 50 ° C et laisser dans un bain-marie à 40 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Placez le cerveau dans un moule de base profonde cassette histologie disponible conservés sur de la glace, et versez fondu (40 ° C) agarose. Immédiatement, appuyez doucement sur le cerveauavec une pince pour s'immerger le tissu. Laisser la cassette sur la glace pendant 15-20 min jusqu'à ce que la solidification est terminée.
  3. Remplir la baignoire vibratome avec réfrigéré 1x PBS. Remplir l'espace autour vibratome bain de glaçons pour maintenir la température de PBS entre 0 et 2 ° C. Fixer une lame de rasoir propre dans le vibratome et régler l'angle de la lame à 15 °.
  4. Placement de tissu dans vibratome. Coupez l'excédent agarose de tous les côtés du tissu intégré et légèrement exposer la surface ventrale du cerveau.
    1. Étaler vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d'agarose-intégré sur la surface collée en plaçant la face ventrale du cerveau exposé sur la colle pour le sectionnement transversal. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc.
    2. Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min.
  5. Dans le même temps, placez le cham de tissuBers un par puits d'une plaque de 24 puits. Remplir les puits contenant les chambres de tissu avec 1 ml de PBS froid 1x, et laisser la plaque sur la glace.
    1. Préparer les chambres de tissu en attachant un nylon mince filet à la coupe en bout d'une pipette 25 ml de polypropylène en utilisant de la colle super; après la coupe du treillis en excès autour de la pipette, la pipette à couper une longueur de 1 cm à partir de la maille.
  6. Abaisser la lame vibratome au niveau de la surface supérieure du tissu; régler la vitesse de vibratome à 0,22 mm / s et commencer la coupe avec un mouvement vers l'avant pour faire 200 um sections épaisses. Transférer une partie cérébrale par puits en utilisant une brosse douce d'aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d'une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu'à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation des tissus. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir un total, trois sections paires de trois régions différentes du cerveau dorsale à la face ventrale (figure 2). Une section dechaque paire (sur un total de trois sections) placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers spécifiques (s IA / PLP 139-151) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de trois sections qui sont placés dans trois chambres de tissu individuels sont désignés pour la coloration avec dextramers de commande (IA s / TMEV 70-86) et anti-CD4.
  7. Transférer les trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pl de cocktail contenant une allophycocyanine (APC) conjugués PLP 139-151 dextramers (2,5 ug / ml) et anti-CD4-phycoérythrine (PE; 5 pg / ml) dans une solution de blocage (PBS 1x avec 2% de sérum normal de chèvre) a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle.
  8. De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de contrôle dans trois puits dans une plaque de 24 puits avec une chambre pour nousll dans laquelle, à 300 pl d'un cocktail contenant TMEV APC conjugué 70-86 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle. Remarque: Reportez-vous à Massilamany et al, 8 pour la préparation de dextramers, et les molécules de dextran pour préparer dextramers ont été aimablement fournies par Immudex, Copenhague, Danemark..
  9. Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d'aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l'obscurité à la température ambiante.
  10. Après la période d'incubation, laver les coupes de tissus sur la plate-forme à bascule, en transférant les chambres de tissu pour un nouveau puits contenant 1 ml de PBS froid 1x, et éviter le dribble le contenu d'un bien dans l'autre. Répéter le lavage trois fois, ce qui permet au moins 10 min par lavage. Veiller à ce que les coupes de tissus ne sont pas séchés car ils peuvent coller aux parois de la chambre.
  11. Fixer les sections en transférant le cham de tissubres dans un nouveau puits en plaque de 24 puits contenant 1 ml de filtre 4% de paraformaldéhyde tampon PBS (pH 7,4) sur une plate-forme à bascule pendant 2 heures avec des rotations douces.
  12. Répétez trois fois le lavage comme décrit à l'étape 3.10.
  13. Placez les coupes colorées et fixes sur une lame de microscope propre à l'aide d'une brosse douce de l'aquarelle. Essuyez l'excès d'eau sans toucher la partie, et monter la section en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire.
  14. Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C.

4. L'induction de l'EAM et Collection de coeurs

  1. Induire EAM comme décrit dans la référence 11.
  2. Euthanasier les souris au jour 21 après immunisation utilisant chambre propre équipé CO 2 bouteille de gaz, et tremper les animaux dans 70% d'alcool. Immédiatement, placer les animaux sur un coussin absorbant et à l'aide d'une paire de pinces et des ciseaux exposer le cœurs en coupant à travers la cavité thoracique. Piquer les bonnes oreillettes et perfuser en injectant 10 ml de PBS froid 1x dans les ventricules gauches des coeurs. Recueillir les coeurs et les placer dans des tubes contenant de froid 1x PBS.

5. In Situ coloration de coeur sections avec CMH de classe II (IA k) / MyHC 334-352 Dextramers

  1. Préparer 4% tampon PBS bas point de fusion d'agarose, faire fondre par chauffage à 50 ° C et le laisser dans un 40   ° C bain d'eau jusqu'à son utilisation.
  2. Placez le coeur dans une profonde cassette histologie de moule de base jetable conservé dans la glace, et versez fondu à 40 ° C jusqu'à ce que les tissus agarose sont complètement submergés, comme décrit dans l'étape 3.2.
  3. Suivez l'étape 3.3.
  4. Enlever l'excès d'agarose à partir de tous les côtés du tissu enrobé et légèrement exposer la base du cœur. Enduire vibratome bloc de tissu avec de la colle super et transférer le tissu d'agarose-intégré collé sur la surface en plaçant la surface exposée de l'coeur sur la colle. Ne déplacez pas le tissu, une fois que le tissu est placé sur le bloc.
    1. Placez le bloc de vibratome contenant le tissu agarose embarqué sur la glace, et laisser la colle sécher pendant 15 min.
  5. Suivez les étapes 3.5 et 3.6.
  6. Transférer les sections de coeur avec une brosse douce d'aquarelle dans les chambres de tissus placés dans les puits d'une plaque de 24 puits. Conservez la plaque sur la glace jusqu'à ce que le sectionnement est complet pour prévenir la dégradation du tissu. Remarque: Suivez ces étapes pour obtenir au total, huit sections paires du sommet à la base du cœur (Figure 2). Placez toutes les sections de chambres de tissu, affecter jusqu'à 3 sections par chambre. Une section de chaque paire (sur un total de huit sections) est désignée pour la coloration avec dextramers spécifiques (IA k / MyHC 334-352) et anti-CD4. De même, un autre ensemble de huit sections est désigné pour la coloration avec dextramers de commande (IA k / RNase 43-56) et des anti-CD4.
  7. Transférer letrois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers spécifiques en trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d'un cocktail contenant des conjugués APC-MyHC 334-352 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle.
    1. De même, le transfert des trois chambres de tissu contenant les sections désignées pour la coloration avec dextramers de commande dans trois puits dans une plaque à 24 puits avec une chambre par puits dans lequel, à 300 pi d'un cocktail contenant RNase APC conjugué 43-56 dextramers (2,5 pg / ml) et anti-CD4-PE (5 ug / ml) dans une solution de blocage a été précédemment ajouté. Couvrir les puits avec un couvercle.
  8. Étiqueter les puits, et envelopper la plaque avec une feuille d'aluminium et placer la plaque sur une plate-forme à bascule fixé à des rotations douces pendant 1,5 heure dans l'obscurité à la température ambiante.
  9. Suivez les étapes, 3.10 à 3.11
  10. Répétez laver thrglace comme décrit à l'étape 3.10.
  11. Placez les coupes colorées et fixes (jusqu'à trois sections / diapositives) sur une lame de microscope propre à l'aide d'une brosse douce de l'aquarelle. Essuyez l'excès d'eau sans toucher les sections, et monter les sections en utilisant un milieu de montage. Couvrir avec une lamelle microscopique et laisser les lames sécher à température ambiante O / N dans la chambre noire.
  12. Stocker les lames dans une boîte de rangement à glissière étanche à la lumière à 4 ° C.

6. Analyse des Dextramer + (dext +) cellules T CD4 + par microscopie confocale à balayage laser Microscope (LSCM) (communs à l'cerveau et le cœur articles)

  1. Utilisez Nikon A1-Eclipse système de microscope confocal 90i pour la numérisation de routine et d'acquisition d'images. Pour commencer Cliquez ouvert, le logiciel NIS Elements AR (version 4.13).
    1. Choisissez "TRITC" et chaînes "Cy5" du panneau. Les excitation / émission des longueurs d'onde respectivement pour les canaux TRITC et Cy5, 561,5 nm / 553-618 nm et 640,7 nm / 663-738 nm apparaissent par défaut.
    2. Attribuer la pseudocouleurs "vert" et "rouge" pour la TRITC (CD4-PE) et Cy5 (dextramer-APC) canaux, respectivement.
    3. Placer la lame d'être examiné sur la scène microscopique et mise au point manuellement sous un grossissement de 100X. Réglez le "HV" à 110 et le décalage de "0". Cliquez sur "Focus" et régler la «tension» pour optimiser les lasers.
    4. Cliquez sur "Focus"; numériser la section de haut en bas, et définir le niveau «Z» pour l'acquisition de l'image. Cliquez sur "série CH" et d'acquérir l'image séquentielle. Identifiez dext + cellules T CD4 + apparaissant cellules ponctuées comme jaunes sur la base de la co-localisation des signaux générés à la fois du rouge (dextramers) et vert (CD4) canaux.
  2. Utilisez Olympus FV500-BX60 microscope confocal pour l'énumération quantitative facile des cellules T CD4 + + DEXT. Pour commencercliquez ouverte, le logiciel de FluoView (version 4.3).
    1. Sélectionnez le colorants "Cy3» et «Cy5" dans le menu déroulant, puis cliquez sur "Appliquer" pour charger les lasers respectifs. Remarque: les longueurs d'onde d'excitation / émission pour Cy3 (543 nm / pseudocolored "vert"; CD4-PE), les canaux et Cy5 (dextramer-APC 633 nm / pseudocolored "rouge").
    2. Placer la lame d'être examiné sur la lame de microscope, et de se concentrer manuellement à faible grossissement (4X ou 10X). Cliquez sur "Focus" tandis que le laser Cy3 est sur, et de se concentrer le foyer inflammatoire.
    3. Modifier l'objectif à grossissement de 100X. Définissez la taille du fichier à "512/512" dans le menu déroulant. Cliquez sur "Focus" et ajuster les valeurs pour "PMT", "gain" et "Offset" paramètres pour optimiser les lasers séparément pour Cy3 et Cy5.
    4. Cliquez sur "étape de Z" puis cliquez sur "Focus" alors que les deux lasers sont sur. Setl'épaisseur de la "scène de Z" en cliquant sur le "haut" et "bas" flèches. Définissez l'intervalle "Z" à 2 pm.
    5. Cliquez sur "Stop", et choisissez "Seq123". Ensuite, cliquez sur "XYZ" et commencer à acquérir des images de la série "Z" pour la zone sélectionnée dans le foyer inflammatoire. Enregistrez les images "Z" de série dans un fichier AVI. Pour enregistrer des fichiers image, sélectionnez l'image de l '«image de série Z", puis enregistrer au format "tiff".
  3. Examiner trois sections appariées du cerveau où un ensemble de trois sections a été colorée avec / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 IA et l'autre ensemble de trois sections avec / TMEV 70-86 dextramers/anti-CD4 IA pour effectuer analyse quantitative.
    1. De même, analyser huit sections appariées pour le coeur, dans lequel, un ensemble de huit sections a été colorée avec IA k / MyHC 334-352 dextramers/anti-CD4 et un autre soit de huit sections avec RNase 43-56 dextramers/anti-CD4.
  4. Examiner 10 à 15 foyers inflammatoires par section cerveau, et dans chaque foyer, d'acquérir un ensemble de 15 à 25 images en série séquentielle.
    1. Examiner un total de 20 foyers inflammatoires de toutes les huit sections de coeur et de chaque foyer acquérir 10 à 15 images en série séquentielle. Prenez les 'Z' images série en balayant les diapositives dans un mouvement «horizontal-vertical-vous-horizontal-vertical vers le bas» de sorte que la répétition de la série «Z» dans le même foyer est évitée.
    2. Une fois les images en série 'Z' sont capturés, nommer les fichiers en identifiant les numéros de diapositives, le nom des sections, et le nombre de 'Z' images prises en série.
      1. Utilisez le logiciel «ImageJ» pour compter les cellules T CD4 + + DEXT par rapport au nombre total de cellules T CD4 +. Sélectionnez le 'type de compteur »dans« ImageJ, consultez &# 8216; montrer tous »et commencer à compter en cliquant sur le centre de chaque cellule et continuer à compter dans différents 'Z' images en série à l'aide de flèches latérales. Après avoir compté toutes les cellules T CD4, choisir un autre type de compteur et le nombre de CD4 + dext + cellules T. Cliquez sur l'onglet des résultats pour obtenir le nombre total de cellules comptées avec les deux compteurs différents.
      2. Obtenir le nombre total, ajouter le nombre de cellules dans l'ensemble des images en série 'Z' représentent tous les trois sections cérébraux ou toutes les sections huit cardiaques.

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Résultats

Dans ce rapport, la détection in situ de spécifiques de l'antigène, auto-réactifs cellules T CD4 par coloration directe avec dextramers CMH de classe II en est décrite. Sections cérébrales fraîchement coupées ont été obtenues à partir de souris EAE et colorées avec des cocktails contenant PLP 139-151 (spécifique) ou TMEV 70-86 (contrôle) dextramers et anti-CD4. Les panneaux supérieurs de la figure 1 montre l'analyse LSCM de sections cérébrales costained avec PLP 139-151 dextram...

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Discussion

Contrairement tétramères CMH de classe I, l'utilisation de tétramères CMH de classe II pour les applications de routine continue d'être difficile, surtout pour énumérer les fréquences de précurseurs de cellules T CD4 autoréactifs de faible affinité, en partie à cause de leur dépendance à l'égard d'activation 6,15-17. Récemment, ce problème a été contourné par la création de la prochaine génération de tétramères, appelé "dextramers," ce qui nous permet de détecter les cellules spécifi...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association et de la Fondation cardiomyopathie des enfants (SDG2462390204001) et les Instituts nationaux de santé (de HL114669). CM est un bénéficiaire d'une subvention de bourse de recherche postdoctorale décerné par la Fondation myocardite, NJ.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CFASigma Aldrich, St Louis, MO5881Magasin au 4 ° ; C
MTB  ; Extrait H37Rv  ;Difco Laboratories, Détroit, MI231141Store au 4 ° ; C
PTList Biologicals Laboratories, Campbell, CA181Magasin au 4 ° ; C
1x PBS  ;Corning, Manassas, VA21-040-CVMagasin au 4 ° ; C
Souris femelles A/J  ;Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME646
Souris femelles SJL/JJackson Laboratories, Bar Harbor, ME686
Leur-lok stérile 1 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309628
Leur-lok stérile 3 ml syrringeBD, Franklin Lakes, NJ309657
Aiguille stérile, 18 GBD, Franklin Lakes, NJ305195
Aiguille stérile, 27 1/2 GBD, Franklin Lakes, NJ305109
robinet d’arrêt à 3 voies  ;Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OHMX5311L
Rouleaux de bandage de gaze Kerlix  ;Covidien, Mansfield, MA6720
KimwipesKimberly-Clark Professional, Roswell, GA34155
Agarose, point de fusion bas, qualité analytiquePromega corporation, Madison, WIV2111
Sérum de chèvre normalImmunopure Thermo Scientific, Waltham, MA31873Magasin à -20 ° ; C
CD4 anti-souris conjugué avec le colorant PEeBioscience, San Diego, CA  ;12004185Magasin au 4 ° ; C
ParaformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences, Hatfield, PA19202Magasin au 4 ° ; C
Faramount Montage aqueux moyenDako, Carpinteria, CA10073021
Tube conique (15 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352099
Tube conique (50 ml)BD Biosciences, San Jose, CA352070
Plaques de culture tissulaire à fond plat 24 puitsBD Biosciences, San Jose, CA356775
Pinceauxaquarelle #2Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY73502
Lames de microscope simple, taille : 3 » x 1 » x 1,2 mmFisher Scientific, Pittsburgh, PA1255010
Verre de couverture premium, 22 x 22-1Fisher Scientific, Pittsburgh, PA12548B
Cassettes d’histologie jetables à moule à base profondeLaboratory prodcust, Rochester, NYM-475-10
Loctite Super glueHenkel Corporation, Westlake, OH1471879
Lames de rasoirGillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)Neopeptide, Cambridge, MAStore at 4 ° ; C
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)Néopeptide, Cambridge, MAStore au 4 ° ; C
MHC classe II/IAs dextères PLP 139-151 ou TMEV 70-86 conjugués avec le colorantStore à 4 ° ; C
MHC classe II/IAk Myhc 334-352 ou  ; ou RNase 40-56 dextramères conjugués avec le colorantStore à 4 ° ; C
Dextran conjugué SA-APCImmundex, Copenhague, DemarkStore au 4 ° ; C
Ciseaux chirurgicaux stériles et pincesINOX tool Corporation
Micro fourGE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 VibratomeLeica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  ; Microscope confocal à balayage laserOlympus America, Inc. Center Valley, PA
Microscope confocal Nikon A1-Eclipse 90iNikon Inc. Melville, NY
APC APC

Références

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare,, Dellabona, S., P,, Casorati, G. Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
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