Article de méthode
Le protocole pour détecter les cellules autoréactives T CD4 dans le cerveau et le cœur par coloration directe avec les grands complexes dextramers d'histocompatibilité de classe II a été décrite dans le présent rapport. Pour une analyse complète, une méthode fiable pour énumérer les fréquences de cellules T CD4 + spécifiques de l'antigène in situ est également conçu.
Ce rapport démontre l’utilisation de dextramères de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) pour la détection in situ de lymphocytes T CD4 autoréactifs dans l’encéphalomyélite auto-immune (EAE) expérimentale induite par la protéine protéolipide de myéline (PLP) 139-151 chez les souris SJL et la myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induite par la myosine lourde α (Myhc) 334-352 chez les souris A/J. Deux séries de cocktails de réactifs de dextramères ont été utilisées, où les cellules dextramères+ ont été analysées par microscope confocal à balayage laser (LSCM) : EAE, IAs/PLP 139-151 dextramères (spécifiques)/anti-CD4 et IAs/Theiler’s murine encéphalomyélite virus (TMEV) 70-86 dextramères (contrôle)/anti-CD4 ; et EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramères/anti-CD4 et IAk/ribonucléase bovine (RNase) 43-56 dextramères (témoin)/anti-CD4. L’analyse LSCM de coupes cérébrales obtenues chez des souris EAE a montré la présence de cellules positives pour les dextramères CD4 et PLP 139-151, mais pas pour les dextramères TMEV 70-86, suggérant que la coloration obtenue avec les dextramères PLP 139-151 était spécifique. De même, des coupes cardiaques préparées à partir de souris EAM ont également révélé la présence de cellules Myhc 334-352, mais pas de cellules RNase 43-56-dextramer+ comme prévu. De plus, une méthode complète a également été conçue pour analyser quantitativement les fréquences des lymphocytes T CD4 spécifiques de l’antigène dans les images en série « Z ».
L'utilisation de complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères pour la détection de cellules spécifiques de l'antigène T CD4 a été un défi 1-7. Pour améliorer la sensibilité de détection de tétramères CMH de classe II, l'équipe de recherche a créé des tétramères de la prochaine génération, désignés "dextramers" 8. Dextramers contiennent des squelettes de dextrane dans lequel de multiples fragments de streptavidine fluorophore sont conjugués, tels que plusieurs monomères du CMH biotinylés, des peptides attachés peuvent être attachés à une molécule de dextran 9. Ainsi, de grands agrégats de dextramer....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclaration d'éthique:
Toutes les procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec les lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par l'Université de Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE.
Une. Induction de l'EAE
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Dans ce rapport, la détection in situ de spécifiques de l'antigène, auto-réactifs cellules T CD4 par coloration directe avec dextramers CMH de classe II en est décrite. Sections cérébrales fraîchement coupées ont été obtenues à partir de souris EAE et colorées avec des cocktails contenant PLP 139-151 (spécifique) ou TMEV 70-86 (contrôle) dextramers et anti-CD4. Les panneaux supérieurs de la figure 1 montre l'analyse LSCM de sections cérébrales costained avec PLP 139-151 dextram.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Contrairement tétramères CMH de classe I, l'utilisation de tétramères CMH de classe II pour les applications de routine continue d'être difficile, surtout pour énumérer les fréquences de précurseurs de cellules T CD4 autoréactifs de faible affinité, en partie à cause de leur dépendance à l'égard d'activation 6,15-17. Récemment, ce problème a été contourné par la création de la prochaine génération de tétramères, appelé "dextramers," ce qui nous permet de détecter les cellules spécifi.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Aucun conflit d'intérêts n'a été déclaré.
Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association et de la Fondation cardiomyopathie des enfants (SDG2462390204001) et les Instituts nationaux de santé (de HL114669). CM est un bénéficiaire d'une subvention de bourse de recherche postdoctorale décerné par la Fondation myocardite, NJ.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Magasin au 4 ° ; C |
| MTB ; Extrait H37Rv ; | Difco Laboratories, Détroit, MI | 231141 | Store au 4 ° ; C |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Magasin au 4 ° ; C |
| 1x PBS ; | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Magasin au 4 ° ; C |
| Souris femelles A/J ; | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Souris femelles SJL/J | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok stérile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok stérile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Aiguille stérile, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Aiguille stérile, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| robinet d’arrêt à 3 voies ; | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Rouleaux de bandage de gaze Kerlix ; | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, point de fusion bas, qualité analytique | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Sérum de chèvre normal | Immunopure Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Magasin à -20 ° ; C |
| CD4 anti-souris conjugué avec le colorant PE | eBioscience, San Diego, CA ; | 12004185 | Magasin au 4 ° ; C |
| Paraformaldéhyde | Microscopie électronique Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Magasin au 4 ° ; C |
| Faramount Montage aqueux moyen | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Tube conique (15 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Tube conique (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| Plaques de culture tissulaire à fond plat 24 puits | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Pinceaux | aquarelle #2Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Lames de microscope simple, taille : 3 » x 1 » x 1,2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Verre de couverture premium, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Cassettes d’histologie jetables à moule à base profonde | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Lames de rasoir | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4 ° ; C | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Néopeptide, Cambridge, MA | Store au 4 ° ; C | |
| MHC classe II/IAs dextères PLP 139-151 ou TMEV 70-86 conjugués avec le colorant | Store à 4 ° ; C | ||
| MHC classe II/IAk Myhc 334-352 ou ; ou RNase 40-56 dextramères conjugués avec le colorant | Store à 4 ° ; C | ||
| Dextran conjugué SA-APC | Immundex, Copenhague, Demark | Store au 4 ° ; C | |
| Ciseaux chirurgicaux stériles et pinces | INOX tool Corporation | ||
| Micro four | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 ; Microscope confocal à balayage laser | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Microscope confocal Nikon A1-Eclipse 90i | Nikon Inc. Melville, NY |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation