L’extraction de l’ADN à partir de la salive peut fournir une source facilement disponible d’ADN de haut poids moléculaire, avec peu ou pas de dégradation/fragmentation. Ce protocole fournit des paramètres optimisés pour la collecte/le stockage de la salive et l’extraction de l’ADN afin qu’ils soient de qualité et en quantité suffisantes pour les tests d’ADN en aval avec des exigences de qualité élevées.
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Article de méthode
Collecte et d'extraction de l'ADN de la salive pour le séquençage de prochaine génération
Dans cet article
Résumé
Résumé
La source d’ADN préférée dans la recherche en génétique humaine est le sang, ou les lignées cellulaires dérivées du sang, car ces sources produisent de grandes quantités d’ADN de haute qualité. Cependant, l’extraction d’ADN à partir de salive peut produire un ADN de haute qualité avec peu ou pas de dégradation/fragmentation qui convient à une variété de tests d’ADN sans les frais d’un phlébotomiste et peut même être acquis par la poste. Cependant, à l’heure actuelle, aucun protocole de collecte/extraction d’ADN salivaire pour le séquençage de nouvelle génération n’a été présenté dans la littérature. Ce protocole optimise les paramètres de collecte/stockage de la salive et d’extraction de l’ADN pour qu’ils soient de qualité et de quantité suffisantes pour les tests d’ADN selon les normes les plus élevées, y compris le génotypage des microréseaux et le séquençage de nouvelle génération.
Introduction
L'obtention de l'ADN de haute qualité pour des études génétiques humaines est essentielle dans le processus de découverte de gènes de maladies. Le sang, bien que nécessitant une intervention invasive et étant également plus cher que le prélèvement de salive, est favorisée par la création de lignées de cellules immortalisées comme une source inépuisable de l'ADN, ou iPSCs pour des études fonctionnelles, et parfois de l'ADN sanguin est utilisé lorsque des lignées cellulaires ne sont pas disponibles. Toutefois, l'obtention de sang exige un préleveur qualifié et le sang a une demi-vie plus courte que la salive 1. ADN de la salive est moins cher et plus facile à obtenir, car il peut être collecté et envoyé par la poste, sans la nécessité d'un préleveur, augmentant ainsi gisements potentiels de sujets bien au-delà de la zone de chalandise des hôpitaux et des laboratoires 2. inscription de l'étude peut être améliorée lorsque les sujets ont la possibilité de donner un échantillon de salive au lieu de sang 3, 4. préoccupations au sujet de la quantité et de la qualité de l'ADN de la salive peuvent avoir limité sa nous généraliséee en dépit de nombreuses études récentes études ont montré la pertinence de la salive totale, avec une moyenne de 4,3 x 10 5 cellules par millilitre, pour des tests ADN sur les prélèvements dans la bouche des méthodes plus anciennes qui n'ont pas obtenu d'importantes quantités de salive 2, 3, 4, 5, 6. Bien que la littérature existe modeste montrant la pertinence d'ADN dérivé de la salive totale pour les applications de génotypage y compris les méthodes à base de microréseaux 8, 9, le séquençage de prochaine génération 10, aucune étude n'a examiné (NGS). L'objectif pour l'optimisation de l'ensemble de ce protocole d'extraction d'ADN de la salive était de maximiser la quantité et de la qualité pour les applications de la génétique d'une manière rentable qui est facilement mis en œuvre dans les laboratoires avec des réactifs et consommables communs.
l'extraction d'ADN à partir de la salive nécessite plusieurs interventions: 1) la collecte et le stockage, 2) la lyse des cellules, 3) un traitement à la RNase, 4) la précipitation des protéines, 5) précipitation par l'éthanol, 6) l'ADN de la réhydratation. La solution de stabilisation tampon ADN, décrit2 précédemment, sans modification des fonctions de manière adéquate. Aucune tentative pour optimiser le traitement de la RNase et les étapes de réhydratation de l'ADN a été effectué. Pour chaque étape restante, plusieurs variables qui pourraient affecter les rendements ont été identifiés. Chaque variable a été manipulée individuellement et l'amélioration du rendement et de la qualité a été évaluée statistiquement. Pour les variables qui ont été montrées pour améliorer le rendement et / ou la qualité de l'ADN, les valeurs optimales ont été inclus dans le protocole final.
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Protocole
REMARQUE: Avant de fournir des échantillons de salive tous les sujets ont donné leur autorisation conforme aux lignes directrices pour le traitement de sujets humains à l'Hôpital pour enfants de Nationwide informé.
1 prélèvement de salive et de stockage
- Avant la collecte de salive, veiller à ce que la bouche du sujet est libre de nourriture ou d'autres substances étrangères en ayant l'objet rincer la bouche avec de l'eau et d'éviter de manger ou de boire pendant 30 min avant de prélever l'échantillon.
- Ouvrez un tube de centrifugeuse de 15 ml avec 2,5 ml d'ADN stabilisation tampon 2 en veillant à ne pas toucher l'intérieur de la capsule ou le tube, et ont fait l'objet cracher 2,5 ml de salive dans la solution tampon. Remarque: La collecte de plus de 2,5 ml de salive peut conduire à une dégradation de l'échantillon à partir d'un rapport insuffisante de l'échantillon de tampon de stabilisation de l'ADN. Collecte trop peu de salive va réduire les rendements attendus du protocole. Pour évaluer les volumes de collecte, utilisez les gradients numérotés sur le côté du til tube.
- Remettre le bouchon et mélanger par inversion jusqu'à ce que le mélange est homogénéisé. Une agitation vigoureuse n'est pas nécessaire. Conserver les échantillons à température ambiante pour le stockage à court terme ou à 4 ° C pour le stockage à long terme (> 3 mois).
2. Préparations initiales et de lyse cellulaire
- Avant de commencer l'extraction, faire chauffer un bain d'eau à 37 ° C, et de préparer un seau à glace. Trois 15 ml tubes de centrifugation coniques seront nécessaires pour chaque échantillon extrait. Les trois tubes sont utilisés pour maintenir les cellules et les protéines culot, le dernier extrait d'ADNg, et les surnageants d'isopropanol et d'éthanol.
- Récupérer des échantillons de stockage, et des échantillons inverses plusieurs fois alors vortex à vitesse moyenne pendant 15 sec.
- Distribuer 2,5 ml d'échantillon dans un tube de 15 ml à centrifuger propre, et ajouter 5 ml de solution de lyse cellulaire. Mélanger l'échantillon 50 fois par inversion, et incuber à température ambiante pendant 30 min.
3. ARN enlèvement
- Ajouter 40 ul de RNase A Solution à 100 mg / ml, et incuber à 37 ° C pendant 15 min.
- Retirer l'échantillon du bain-marie à 37 ° et refroidir sur glace pendant 3 min.
- Après l'incubation de la RNase A, d'augmenter la température du bain d'eau à 65 ° C pour l'étape de réhydratation de l'ADN du protocole.
4. protéines et lipides enlèvement
- Ajouter 50 l de protéinase K Solution à 20 mg / ml, mélanger à plusieurs reprises par inversion, et incuber à température ambiante pendant un minimum de 30 minutes. Note: Ceci est un point de pause possible pour le protocole. Après l'addition de la solution de protéinase K, l'échantillon peut être stocké à 4 ° C jusqu'à ce que l'extraction peut être réalisée. Stockage à 4 ° C pendant 24 heures n'a pas été montré pour avoir un effet significatif sur les rendements d'extraction ou de la qualité de l'ADN. Stockage à long terme, à ce stade n'a pas été évaluée.
- Ajouter 1,7 ml de solution de précipitation des protéines, vortex vigoureusement pendant 20 secondes à grande vitesse, et le placer sur la glace pendant 10 min.
- Une fois les échantillons sont refroidis sur la glace pendant 10 min, centrifuger pendant 10 min à 3000 xg et 4 ° C. Les protéines précipitées doivent former un culot serré pour continuer. Si la pastille n'est pas étanche ou la solution est encore trouble, les échantillons peuvent être refroidis sur la glace pendant 5 min et centrifugation plus répétées. Les échantillons doivent être conservés dans la glace pour assurer une pastille serré.
5 Isolement et purification de l'ADNg
- 15 ml dans un tube à centrifuger propre, la pipette 5 ml d'isopropanol et 8 pi de solution de glycogène pur à 20 mg / ml.
- Verser le surnageant contenant l'ADNg de l'étape 4.3 dans le tube contenant la solution de glycogène et de l'isopropanol, en laissant le culot de protéine précipitée. Une fois le surnageant a été ajouté, mélanger délicatement l'échantillon 50 fois par inversion et centrifuger pendant 30 min à 3000 xg et 4 ° C.
- Verser le surnageant dans un tube lentement de 15 ml propre. Après élimination du surnageant, ajouter 1 ml d'éthanol à 70%laver le culot en basculant lentement et se déplaçant doucement de l'éthanol sur le culot précipité plusieurs fois. Conserver la éthanol dans le tube.
- Après le lavage initial, centrifuger l'échantillon pendant 1 min à 2000 xg et 20 ° C. Cette étape de centrifugation peut être effectuée à 4 ° C ou 20 ° C. Aucun effet significatif de la température a été montré pour cette étape.
- Après le lavage et la centrifugation initiale de la pastille, verser lentement le lavage à l'éthanol à partir du tube et le jeter, puis effectuer un deuxième lavage en répétant les étapes 5.3 et 5.4.
- Après l'élimination du surnageant à partir de la deuxième lavage, le culot de permettre à l'air sec pendant 15 minutes.
- Si l'échantillon n'est pas complètement séché, séché à l'air pendant 15 min.
6. réhydratation des ADNg
- Une fois que l'échantillon est sec, ajouter 300 pi de Tris-EDTA pour réhydrater le culot séché ADNg.
- Vortex de l'échantillon pendant 5 secondes à la vitesse moyenne et le placer dans un65 ° C bain d'eau chaude pendant 1 heure.
- Retirer les échantillons du bain d'eau et incuber O / N à la température ambiante.
REMARQUE: Tous les produits et les réactifs utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux, ainsi que le tableau 4.
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Résultats
Pour déterminer les paramètres optimaux pour l'extraction de l'ADN d'une série d'extractions d'ADN appariés a été effectuée. Un échantillon de salive, seule a été divisé et chaque partie a testé avec l'une des deux valeurs possibles d'une variable donnée. Au moins huit répétitions de chaque test apparié ont été réalisées (par exemple, un seul échantillon de salive a été aliquote de tester l'extraction à la fois avec et sans participation initiale de 50 ° C incubation). Optimisati...
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Discussion
La présente procédure est un protocole d'extraction de l'ADN optimisé qui a considérablement amélioré le rendement de l'ADN de poids moléculaire élevé par rapport à des procédés classiques, sans compromettre la qualité de l'ADN. L'étape critique avec le plus grand effet sur le rendement le plus, c'est l'étape 5.2, qui comprend une étape de centrifugation plus longue au cours de précipitation à l'éthanol que n'importe quel protocole publié examiné ici, sauf une qui n'a pas été la...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été financé par un R01 des National Institutes of Health (DC009453 soutien à CWB).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 15 ml Tubes à centrifuger | Fisher | 12-565-268 | |
| Solution de lyse cellulaire | Qiagen | 158908 | |
| Proteinase K | Sigma | P6556 | |
| Solution de précipitation de protéines | Qiagen | 158912 | |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 | |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 | |
| Éthanol à 70 % | Fisher | 04-355-305 | |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 | |
| NaCl | Fisher | AC194090010 | |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 | |
| EDTA (0,5 m) Solution | Fisher | 03-500-506 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Fisher | BP166-100 ; | |
| Mélangeur Vortex Analogique | Fisher | 02-215-365 | |
| Centrifugeuse 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
Références
- Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies. Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).
- Min, J. L., et al. High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes. Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).
- Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy. Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).
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Réimpressions et autorisations
