Ce protocole vidéo démontre une méthode pour étudier les effets du liquide séminal chez les gastéropodes, en utilisant l’escargot hermaphrodite d’eau douce Lymnaea stagnalis.
Article de méthode
Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans la fertilisation interne animaux, le liquide séminal est habituellement ajouté aux spermatozoïdes, formant ensemble le sperme ou éjaculat. Outre l'activation de sperme et nourrissante, les composants dans le liquide séminal peut également influencer la physiologie féminine pour augmenter le succès de la fécondation du donneur de sperme. Alors que de nombreuses études ont rapporté ces effets chez les espèces à sexes séparés, peu d'études ont abordé cette chez les animaux hermaphrodites simultanément. Ce protocole vidéo présente une méthode pour étudier les effets de liquide séminal chez les gastéropodes, en utilisant un escargot d'eau douce en même temps hermaphrodite, le grand escargot étang Lymnaea stagnalis, comme organisme modèle. Alors que la procédure est représenté en utilisant des extraits complets de la glande de la prostate, les composants individuels (à savoir, des protéines, des peptides, et d'autres composés) du liquide séminal peuvent être testés de la même manière. Effets de la réception de composants éjaculer sur la ponte peuvent être quantifiés en termes de fréquence de ponte etestimations les plus subtiles de la performance de reproduction des femmes telles que les numéros d'oeuf dans chacune des masses d'œufs. Les résultats montrent que les protéines du liquide séminal affectent la reproduction des femmes dans ce hermaphrodite simultané, en soulignant leur importance pour la sélection sexuelle.
Introduction
Lors du transfert, les spermatozoïdes sont habituellement accompagné par le liquide séminal produit par les glandes accessoires mâles. Alors que certains composants éjaculat jouent un rôle dans l'activation de sperme nourrissante et 1, d'autres influencent la physiologie féminine en vue d'accroître le succès de la fécondation du donneur de sperme 2-4. Ces effets sont particulièrement choisis pour, par la sélection sexuelle, quand une espèce est très promiscuité et a de stockage de sperme et le sperme efficace digestion. Dans ces conditions, les donneurs de sperme concurrence fortement pour la fécondation des œufs 5. Bien qu'il existe des preuves abondantes de corrélation de l'importance des substances liquide séminal pour le succès de la fécondation mâle, la preuve directe est plus rare et peu d'études ont puisé dans les détails de la modification et / ou substances impliquées 6 physiologique.
Chez les espèces à sexes séparés (c'est à dire, hommes et femmes; gonochorists) il ya un peu modèle spéci bien étudiées quand il s'agit de la composition de fluide séminal et de leurs effets. Les exemples incluent la mouche des fruits, Drosophila melanogaster 6, le moustique vecteur du paludisme, Anopheles gambiae 7, et le coléoptère rouge de la farine, Tribolium castaneum 8. Ces études liquide séminal sont beaucoup plus rares quand il s'agit pour les espèces qui sont en même temps hermaphrodite (c'est à dire, les individus sont fonctionnellement mâles et femelles en même temps), même si ce mode de reproduction est courante dans le règne animal 9. L'exemple le plus notable hermaphrodite du transfert d'une substance de la glande accessoire est probablement la prise de vue de ce qu'on appelle l'amour-fléchettes dans les escargots terrestres 2,10, où la substance est transférée par le donneur de sperme par injection hypodermique 11,12, c'est-à-pas avec les spermatozoïdes. Mais il ya beaucoup hermaphrodites simultanés qui transfèrent mâles produits de la glande accessoire avec leur sperme,tels que les espèces modèles utilisés ici, le grand étang Lymnaea stagnalis. Des recherches antérieures ont déjà démontré que la réception du liquide séminal influe sur la capacité reproductrice femelle de cette espèce 13-15, et plusieurs des protéines du liquide séminal impliqués ont été identifiés 16,17.
L'objectif global de ce protocole, qui est une extension des méthodes présentées dans Koene et al 16, est de tester les effets des protéines du liquide séminal sur les différents paramètres de la ponte dans les mollusques gastéropodes. Ceci est accompli par la dissection de la glande de la prostate (par exemple, la glande accessoire mâle produire le liquide séminal) des escargots sexuellement isolé à partir d'une culture de laboratoire normalisé donateurs. Deuxièmement, le sperme du donneur est collecté à partir des vésicules séminales et des solutions de traitement différents sont faits. Par la suite, les escargots d'essai sont anesthésiés par voie intravaginale et injectés avec une solution d'essai (par exemple,extrait de glande prostate seul, extrait de glande prostate avec le sperme, le sperme seul, moyen de support seul). Ces escargots de test sont ensuite suivis pendant les jours suivants à quelques semaines, dans des conditions standard, pour enregistrer la ponte. Les masses d'œufs sont collectés, numériquement, pour compter et mesurer les différents paramètres, et ensuite mis dans des flacons individuels à couver. Après environ deux semaines, les nouveau-nés sont comptés et numériquement analysés. Toutes les analyses, de deux masses d'œufs et les nouveau-nés, sont ensuite analysées à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images librement disponibles.
Pour ce protocole la souche de laboratoire de la grande escargot étang, Lymnaea stagnalis, est utilisé, ce qui est élevé à l'Université VU d'Amsterdam. Cette espèce constitue un système modèle pour étudier des questions sur la sélection sexuelle et de la reproduction dans les hermaphrodites. Relativement grande taille de l'animal, il est expérimentalement très accessible. En outre, parce qu'il est utilisé comme espèce modèle dans de nombreux bdisciplines siologiques nous savons déjà beaucoup sur la biologie de base de ces animaux. Cette méthode permettra d'étudier les questions relatives aux processus de sélection sexuelle qui sont médiés par des protéines du liquide séminal en général. En outre, parce que ce sont hermaphrodites simultanés, il est possible d'indiquer si ces protéines agissent de manière similaire et / ou différentes comme c'est le cas dans les espèces où les sexes sont séparés 16,17.
Protocole
1. Elevage installation
- Obtenir des spécimens adultes d'(L.) de Lymnaea d'une culture de laboratoire comme celui de l'Université VU.
- Maintenir l'eau faible teneur en cuivre à 20 ° C dans la facilité de reproduction (de molluscarium) et bassins expérimentaux, qui ont l'échange continu de l'eau.
- Réglez le cycle lumière / obscurité à 12 h: 12 h.
- Pour l'élevage, nourrir les escargots adultes laitue ad libitum sans pesticides, nourrir les juvéniles avec TetraPhyll (nourriture des poissons) de flocons. Maintenir escargots dans des réservoirs séparés en fonction de leur âge, à partir de masses d'œufs qui sont prévues dans un délai de 24 heures.
- Une fois les escargots sont retirés des bassins d'élevage ne sont pas retournés, pour éviter les effets d'avoir été maintenus dans des conditions légèrement différentes ainsi que pour prévenir pseudoréplication.
2. Dissection
- Isoler les escargots pendant 1 semaine, et les nourrir ad libitum, d'assurer le that ils ont plein de sperme et le liquide séminal magasins.
- Préparer un microscope stéréo, une plaque de dissection avec des épingles, des petits ciseaux chirurgicaux, pinces fines et grossières, une seringue de 10 ml remplie d'un MgCl2 solution à 50 mM, aiguilles d'injection (0,3 mm x 13 mm) et des serviettes en papier.
- Euthanasier un escargot en injectant MgCl2 solution (généralement 3 ml ou plus pour les escargots adultes avec une longueur de coque de 31,6 ± 2,1 mm et un poids humide de 2,89 ± 0,55 g). Pénétrer dans le pied avec l'aiguille d'injection à un angle de 45 ° et injecter en appuyant légèrement en continu jusqu'à ce que l'escargot se détend et reste étendu (en quelques secondes). Retirez l'aiguille d'injection et vérifier si l'escargot est euthanasié (par exemple, en vérifiant si le réflexe de retrait de tentacule est absent).
- Retirez délicatement la coquille suivant sa courbure à l'aide des pinces grossières. A mi-chemin, détachez le muscle columellaire de la coquille en grattant avec la pince. Tourner doucement til escargot de sa coquille, suivant le sens d'enroulement de la coquille.
- Placez l'escargot sur la plaque de dissection et cerner l'extrémité arrière du pied. Ensuite, placez une épingle à travers la tête et mettre un peu de tension sur l'escargot pour faciliter la dissection.
- Localisez l'gonopore femelle, qui sera plus tard sur un point pour la dissection de référence.
- En utilisant les ciseaux chirurgicaux et des pinces fines, faire la première incision, juste sous le bord du manteau et couper vers le gonopore femelle. Lorsque l'un des lames de ciseaux est poussé les sous la paroi du corps, soulevez doucement pour s'assurer que seule la paroi du corps, et aucun des organes internes, est coupé. Continuer la coupe au-dessus du gonopore vers la tête et couper en ligne droite.
- Localiser la glande de la prostate (postérieure) et les vésicules séminales (antérieures). Disséquer les soigneusement et gardez-les sur de la glace. Les utiliser pour préparer les solutions d'essai contenant un fluide et / ou du sperme séminal. Utilisez physiologique sal Lymnaeaine (5,83 mmol / l de CaCl 2 · 2H 2 O, 3,76 mmol / L de MgCl 2 · 6H 2 O, 42,69 mmol / L de NaCl, 37,53 mmol / L KCl) en tant que milieu de support.
- Recueillir le liquide séminal qui est présent dans la lumière de la glande de la prostate ainsi que le sperme des vésicules séminales. Par la suite, suspendre la fois dans une solution saline dans des flacons séparés en exprimant doucement leur contenu et de retirer le tissu organique avec une pince. Garder sur la glace et utiliser le même jour. Plus tard, mélanger ces suspensions pour créer les différentes solutions de traitement.
3. Intravaginale injection
- Avant de commencer la procédure d'injection intravaginale, préparer une coquille moule en silicone (fait pour s'adapter à la pointe de la coque), 1 mm seringues, 10-12 tubes cm de silicium d'un diamètre de 1 mm, émoussé aiguilles d'injection (0,3 mm x 13 mm ), une pince grossiers et la même seringue de 10 ml rempli d'une solution mM MgCl 2 50 équipé d'une aiguille d'injection pointue.
- Recueillir le sperme, nécessaire pour ajouter de liquide séminal (ou protéines du liquide séminal individuels) dans certains traitements; une dose biologiquement pertinente est égale à 1/3 d'une glande de la prostate et des vésicules séminales par injection.
NOTE: Dans la section des résultats représentatifs (Figure 1) les résultats d'une expérience de trois traitements différents sont présentés: Contrôle (milieu de support, c'est à dire, une solution saline), Ovipostatin (une des protéines du liquide séminal identifiés) seul et Ovipostatin accompagné de sperme. En outre, pour estimer la dose biologiquement pertinente dans d'autres espèces, déterminer la différence de poids de la glande de la prostate de personnes qui ont récemment accouplées et les individus qui sont restés sexuellement isolés 16. - Préparer seringues de 1 ml de chacune des solutions d'essai préparées. Remplir chaque seringue d'une solution et s'assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air à l'intérieur.
- Monter une aiguille d'injection émoussée sur chaque seringue.
- Pour utiliser une injection 1tube de silicium mm de diamètre avec une longueur minimale de 10 cm.
- Faites glisser délicatement le tube de silicium sur l'aiguille d'injection, en veillant à ne pas percer le tube, et retirer l'air du tube en appuyant légèrement la pression sur la seringue.
- Anesthésier un escargot en suivant le même protocole que dans le point 2.3. Cette fois, assurez-vous de ne pas injecter plus de 2-3 ml de 50 mM MgCl 2.
- Poser l'escargot dans la coquille moule à garder dans une position stable.
- Localisez le gonopore femelle, qui est clairement visible, comme une tache blanche sur le côté droit de l'animal, avant à droite tentacule et gonopore mâle (cet endroit est également valable pour d'autres espèces d'escargots d'eau douce). Assurez-vous d'avoir un accès libre.
- Utiliser une pince pour maintenir l'extrémité du tube de silicium et insérer doucement environ 4.2 mm du tube de silicium dans le gonopore femelle.
- Appliquer soigneusement pression à la seringue et d'injecter 0,03 ml de la solution d'essai. Attendre une demi-minute pour permettre à la pression dans le tube de se propager dans le tube femelle avant de retirer le tube.
- Retour de l'escargot traité à son conteneur d'isolement, où il peut être surveillé, et lui permettre de se remettre de la sédation dans le réservoir expérimental.
4. D'essais biologiques
- Étiqueter chaque escargot pour l'identification et mesurer sa longueur de coque. Ce dernier est un bon indicateur de la taille, ce qui est pertinent pour quantifier la reproduction.
- Gardez chaque escargot isolé dans un ml contenant 460 qui est perforé pour permettre l'échange de l'eau dans le réservoir expérimental. Il est important de placer tous les conteneurs dans la bonne orientation, avec des perforations dans la direction de l'écoulement de l'eau, pour permettre l'échange efficace de l'eau.
- Au cours de l'essai biologique, nourrir les escargots régulièrement avec une quantité standardisée de laitue. Utilisez un tour, perforateur en métal pour couper la laitue. Dans ce protocole, les disques de laitue de 19,6 cm 2 sont utilisés, qui se rapproche de l'uneils peuvent monter au maximum manger en une seule journée.
- Recueillir une masse d'œufs avec le côté plat d'une spatule et racler la masse d'oeufs de la paroi du récipient. Utilisez le côté de la cuillère pour recueillir la masse d'oeufs.
NOTE: les masses d'œufs opaques qui viennent d'être fixées ne peuvent être utilisés pour la numérisation (ils deviennent transparents en quelques heures après la pose). Pour les espèces modèles de ce protocole, Lymnaea stagnalis, vérifier des masses d'œufs tous les jours, car ils produisent 2-3 masses d'œufs par semaine. Cela peut varier dans d'autres espèces. - Balayez les masses d'œufs collectés numériquement à l'aide d'un (ordinateur portable) ordinateur contenant le pilote du scanner, un scanner à plat, une échelle millimétrique standard, une spatule, transférer plaques et carreaux de verre.
- Placez chaque masse d'œufs sur les plaques de transfert et répéter jusqu'à ce que les plaques sont pleins. Par la suite, tamponnez les masses d'œufs sécher sur une serviette en papier et de les transférer sur les carreaux de verre dans le même ordre que sur les plaques de transfert.
- Tournez chaque carreau à l'envers (l'masses d'œufs collent à la tuile de verre) et placer soigneusement sur le scanner à plat, un peu moins de l'échelle millimétrique. Appliquer un peu de pression pour aplatir les masses d'œufs, qui distribue les œufs uniformément de sorte qu'ils sont tous visibles dans le même plan de mise au point. Monter les carreaux avec une quantité standardisée de ruban autour de deux bords pour assurer que tous les oeufs sont aplaties aussi.
- Réglez les paramètres du scanner. Il est important de régler la résolution à son maximum, faire un scan de prévisualisation, recadrer la zone de travail, et de régler la luminosité et le contraste. Balayez les masses d'œufs.
- Placez chaque masse d'oeufs dans sa propre étiquette flacon de 20 ml en verre pour le développement et l'éclosion.
- Rafraîchir l'eau dans des flacons d'incubation tous les jours pour garder correctement oxygéné. Pour ce faire, selon le nombre de nouveau-nés et la taille dans l'ordre suivant: décantation / décanter (pas de nouveau-nés), débordant (début de l'éclosion), et l'extraction hors de l'eau avec une pipette (de nombreux nouveau-nés).
5. Mesure et de comptage des oeufs
- Installez le ImageJ logiciel d'analyse d'image librement disponible (NIH, USA) et le compteur de cellules plugin.
- Ouvrir ImageJ ainsi que d'un tableur pour transférer les données. Ensuite, ouvrez une image scannée de masses d'œufs dans ImageJ.
- Réglez l'échelle à l'aide de l'outil de zoom pour naviguer à l'échelle millimétrique. Zoomer et ajuster la fenêtre de 1 mm pour remplir l'écran. Tracez une ligne en utilisant l'outil de ligne de démarcation entre les deux lignes qui indiquent 1 mm. Accédez à analyser, et Set échelle. Dans le menu pop-up de l'option de mesure de longueur devient visible, ajuster la distance connu à 1 et l'unité de longueur de mm. Cochez la case mondial, et fermer la fenêtre.
- Définissez les mesures privilégiées (longueur, largeur, circonférence) en accédant à analyser, et Set mesures en sélectionnant régionaux et le diamètre de Feret (longueur et largeur). Cliquez sur OK pour confirmer et continuer avec l'analyse de l'image.
- Pour mesurer les oeufs, zoom sur un oeuf dans de la première masse d'oeuf qui doit être mesuré. Un zoom de 800% est recommandé. Puis, en utilisant l'outil elliptique dessiner un ovale exactement autour de l'oeuf, appuyez sur CTRL + D pour dessiner la circonférence sur l'image (pour empêcher la mesure de la même œuf deux fois). Ensuite, appuyez sur Ctrl + M pour enregistrer la mesure des propriétés de l'ovale (longueur, largeur, circonférence); un écran pop-up s'ouvre et affiche les mesures.
NOTE: L'utilisation de l'outil elliptique pour mesurer les oeufs ne s'applique pas à toutes les espèces. Pour les espèces aux oeufs en forme de manière non uniforme, utiliser les sélections à main levée à la place. - Mesurer autant d'œufs que nécessaires, puis enregistrer les mesures. Xls feuille de calcul. Eventuellement, copier les données directement dans une feuille de calcul.
- Par la suite compter les œufs dans une masse d'œufs, à l'aide de la fenêtre du compteur et de mettre les chiffres manuellement dans la feuille de calcul.
- Sinon, compter les œufs individuels par la masse des oeufs à l'aide de la cellule contre le plug-in. Pour cela, accédez à des plug-ins,alors, analyser et sélectionner portable compteur. La fenêtre du compteur de cellule s'affiche, cochez la case "garder originale" boîte et appuyez sur "initialiser". Une nouvelle fenêtre du compteur apparaît, sélectionnez l'outil en forme de croix de la barre d'outils et sélectionnez un type de compteur dans le menu de compteur de cellules. Compter les œufs individuels en cliquant sur les œufs individuels dans la fenêtre du compteur de cellule. Observer le nombre total en regard du type de compteur dans le menu de compteur de cellules. Copiez ce numéro manuellement à une feuille de calcul ou d'obtenir les résultats en appuyant sur les résultats.
- Comptez plusieurs masses d'œufs dans un événement de comptage en ajoutant types de compteurs, si nécessaire.
Résultats
La figure 1 montre le pourcentage d'animaux pondent des œufs après l'injection intra-vaginale ou l'autre de la substance témoin (solution saline), Ovipostatin, ou Ovipostatin accompagnés de sperme. N = 15 pour chaque traitement; voir Koene et al 16 pour plus de détails et des statistiques (Source: Figure 3 de Koene et al 2010, la revue PLoS ONE.)..
Figure 1. Effet de Ovipostatin sur la production d'oeufs de masse de Lymnaea stagnalis. Le graphique montre le pourcentage d'animaux pondent des œufs après l'injection intravaginale soit la substance de contrôle (saline), Ovipostatin, ou Ovipostatin accompagnés de sperme. N = 15 pour chaque traitement; voir Koene et al. 2010 Détails et statistiques. Réimpression avec la permission de Koene et al 2010 PLoS ONE 5:. E10117.
Discussion
Le protocole présenté montre comment recueillir le liquide séminal et comment tester ce d'une manière biologiquement significative. Bien que cette procédure est représenté ici à l'aide de l'extrait de la glande de la prostate, l'effet d'une seule protéine purifiée liquide séminal peut également être testée en suivant la même procédure. Évidemment, dans ces tests, il est toujours crucial d'inclure des contrôles appropriés (traitements fictifs) de veiller à ce que la procédure et / ou le moyen de transport n'affectent pas les paramètres en question 14,16. En utilisant ce procédé, il a déjà été montré qu'il existe une seule protéine de liquide séminal, à savoir Ovipostatin, qui médie une réduction de la ponte 14,16. Cette protéine, produite dans la glande de la prostate et transféré au cours de l'accouplement avec les spermatozoïdes, représente le premier composant liquide séminal entièrement caractérisé par un hermaphrodite simultané et n'a, jusqu'à présent, ne montre aucune ressemblance avec des protéines connues.
La constatation que Ovipostaétain réduit la production de masse d'oeufs dans le récipient corrobore les travaux antérieurs indiquant que les substances dans le sperme peuvent influencer la ponte 13-15. En transférant biologiquement montants concernés (voir 3.2 16), on peut démontrer de façon convaincante que c'est une protéine liquide séminal, et non la présence de spermatozoïdes eux-mêmes, qui intervient dans la réduction observée de la ponte (Figure 1). Étant donné que la réception répétée de liquide séminal par croisements naturels augmente l'investissement par oeuf 15, il devient maintenant très pertinent pour quantifier d'autres paramètres de la ponte. Le protocole présenté fournit maintenant les méthodes nécessaires pour le faire. Bien qu'aucun effet n'a été trouvée de Ovipostatin sur le succès des œufs pondus par le destinataire 16 à couver, il peut y avoir d'autres protéines du liquide séminal qui agissent de concert avec cette protéine. Par conséquent, les paramètres qui doivent être quantifiés dans ce contexte - à côté de la pose nombre de fréquences et des œufs - comprennent la taille des œufs, hatctemps hing, le développement des nouveau-nés et la taille des nouveau-nés. En outre, il est possible d'examiner les effets sur d'autres processus femmes que la ponte, telles que le stockage de sperme et l'utilisation, ainsi que l'allocation des ressources vers la fonction de reproduction mâle et femelle 14,17. De toute évidence, la méthode présentée est instrumentale dans la résolution de ces questions suivi, à la fois dans Lymnaea stagnalis et dans d'autres escargots d'eau douce.
En somme, les expériences utilisant ce protocole montrent que les protéines transférées liquide séminal affectent la performance de reproduction féminin du bénéficiaire dans ces hermaphrodites simultanés. Étant donné que peu d'études ont abordé ce, il est susceptible d'être beaucoup plus fréquent dans la fertilisation interne hermaphrodites que actuellement reflété dans la littérature scientifique. Surtout quand on sait que le choix du partenaire pré-copulation et de la concurrence de sperme ont été montré à jouer un rôle important dans ces hermaphrodites 14, qui highlights le potentiel de ces protéines mâles de la glande accessoire à être sélectionné sexuellement dans ce système. Enfin, cette recherche contribue à soutenir le développement de la notion que les protéines du liquide séminal sont d'égale importance pour hermaphrodites simultanés car ils sont des espèces distinctes-sexué.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Nous remercions M. Helmus pour la voix-off, CM Popelier, S. et C. Levesque Ypenburg pour l'assistance technique. Cette recherche est financée par l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO), l'Académie royale néerlandaise des arts et des sciences (KNAW) et l'Organisation des services aux étudiants au Japon (JASSO). Cette publication a été financée par une subvention de l'Open Access de NWO à JMK.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Flocons d’aliments pour poissons | TetraPhyll | ||
| Stéréomicroscope | |||
| Petits ciseaux chirurgicaux | WPI | ||
| Pinces grossières et fines | WPI | ||
| Seringue | |||
| Aiguilles d’injection (0,3 mm x 13 mm) | |||
| 50 mM MgCl2 | |||
| 5,83 mmol/L de CaCl2· ; 2H2O | |||
| 3,76 mmol/L MgCl2· ; 6H2O | |||
| 42,69 mmol/L NaCl | |||
| 37,53 mmol/L KCl | |||
| Seringues | |||
| en silicone | Sylgard | ||
| Tube en silicone (diamètre 1 mm) | |||
| Aiguilles d’injection émoussées (0,3 mm x 13 mm) | |||
| Tubes | Eppendorff | ||
| 460 ml Récipients | |||
| Perforateur de feuilles en métal (19,6 cm2) | |||
| Spatule/cuillère | |||
| (Ordinateur portable) Scanner | |||
| à plat | |||
| Échelle | millimétrique | ||
| Plaques | |||
| Carreaux de verre Flacons | |||
| en verre de 20 ml |
Références
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Réimpressions et autorisations
