Production de haploïdes embryons de poisson zèbre par In Vitro Engrais

Summary

Le poisson-zèbre est un système modèle puissant pour la biologie du développement et la recherche sur les maladies humaines en raison de sa similitude génétique avec les vertébrés supérieurs. Ce protocole décrit une méthodologie permettant de créer des embryons de poisson-zèbre haploïde qui peuvent être utilisés pour des stratégies de dépistage avancé afin d’identifier les mutations récessives dans les gènes essentiels à l’embryogenèse précoce.

Abstract

Le poisson zèbre est devenu un modèle vertébré grand public qui est pertinente pour de nombreuses disciplines de l'étude scientifique. Poisson zèbre sont particulièrement bien adaptés pour l'analyse génétique avant des processus de développement en raison de leur fécondation externe, taille embryonnaire, l'ontogenèse rapide, et la clarté optique - une constellation de traits qui permettent l'observation directe des événements allant de la gastrulation à l'organogenèse avec une loupe binoculaire de base. En outre, les embryons de poisson zèbre peuvent survivre plusieurs jours dans l'état haploïde. La production d'embryons haploïdes in vitro est un outil puissant pour l'analyse mutationnelle, car elle permet l'identification des allèles mutants récessifs présents dans la première génération (F1) des femmes porteuses suivantes mutagenèse dans le parental (P) génération. Cette approche élimine la nécessité d'élever plusieurs générations (F2, F3, etc) qui implique la reproduction des familles mutantes, économisant ainsi le temps de chercheur ainsi que la réductionles besoins en espace de poisson zèbre de la colonie, le travail et les coûts d'élevage. Bien que le poisson zèbre ont été utilisés pour mener de l'avant écrans pour les dernières décennies, il ya eu une expansion régulière des transgéniques et génome des outils d'édition. Ces outils offrent maintenant une multitude de façons de créer des analyses nuancées pour les prochaines écrans de nouvelle génération qui peuvent être utilisés pour disséquer les réseaux de régulation des gènes qui conduisent vertébré ontogenèse. Ici, nous décrivons comment préparer embryons de poisson zèbre haploïdes. Ce protocole peut être mis en œuvre pour de nouveaux futurs écrans haploïdes, comme dans les écrans amplificateurs et suppresseurs, pour faire face aux mécanismes de développement pour un large nombre de processus et de tissus qui se forment pendant stades embryonnaires.

Introduction

Les processus fondamentaux qui orchestrent le développement des vertébrés sont largement conservées ^1. Un moyen puissant pour identifier les gènes des rôles essentiels dans le développement est d'isoler des mutations héréditaires qui conduisent à des défauts phénotypiques dans le processus d'intérêt. Le poisson zèbre, Danio rerio, est une petite espèce d'eau douce de poissons téléostéens appartenant à la famille des poissons cyprinidés qui est devenu un organisme modèle largement utilisé pour la génétique du développement des vertébrés au cours des dernières décennies ^2. Oeufs fécondés de poisson zèbre à l'extérieur, permettant l'accès à la zygote dès le début de la fertilisation ^3. En outre, l'embryon est optiquement transparent, permettant la visualisation de développement avec une loupe binoculaire simple, ^3. Ontogenèse poisson zèbre est rapide, avec les processus de clivage, gastrulation, l'organogenèse et de nombreuses structures, comme le cœur et les reins, en grande partie achevés au cours du premier jour de développement ^3. Til temps de stades larvaires à la maturité sexuelle prend 2-3 mois, et les adultes sont de petits vertébrés environ 3-4 cm de longueur, de sorte que de nombreux poissons peuvent être maintenus dans un espace minimal ^2. En outre, les adultes de poisson zèbre ont une fécondité élevée, avec chaque poisson en mesure de produire plusieurs centaines d'embryons par semaine ^2. Ces attributs ont rendu la traçabilité de poisson zèbre pour avant et arrière écrans génétiques. Poisson zèbre possède un degré élevé de conservation dans leur anatomie, biologie cellulaire, physiologie et des espèces de vertébrés les plus avancés comme les mammifères ^2,4. En effet, une analyse récente de la séquence a montré que le génome contient des homologues de poisson-zèbre à près de 70% des gènes humains ^5. Cette conservation a permis aux chercheurs d'utiliser le poisson zèbre comme modèle pour de nombreuses maladies humaines, y compris à la fois embryonnaire et conditions adultes ^2,4. Pris ensemble, ces facteurs ont rendu le poisson-zèbre un excellent système pour les écrans visant à identifier les gènes qui sontessentiel pour l'ontogenèse des vertébrés normale.

Un certain nombre de grands écrans à grande échelle ont été menées chez le poisson zèbre et ont identifié plusieurs milliers de mutations dans les gènes du développement ^6-8. Le mâle adulte poisson zèbre se prête à une mutagenèse, et altérations chromosomiques peut être généré avec une fréquence relativement élevée en utilisant le éthylnitrosourée mutagène chimique (FRA) ^6,7 ou mutagenèse par insertion rétrovirale ^9. À ce jour, plus de 9000 mutations héréditaires ont été créés, et comprendre des gènes qui affectent pratiquement tous les aspects de l'embryogenèse. La communauté poisson zèbre a créé une banque centralisée de ces mutants au Centre international des ressources de poisson zèbre (ou ZIRC) ^10, qui a rassemblé environ 5000 allèles mutants et transgéniques dans le monde entier. Beaucoup de ces mutations ont été analysées et cloné, donnant aux chercheurs dans toutes les disciplines biologiques des renseignements précieux qui a été utilisé pour démêler numeroNous voies cellulaires et physiologiques à travers les idées provenant des expériences de poisson zèbre.

Bien que les écrans à terme ont identifié un nombre impressionnant de gènes importants, il reste encore beaucoup à être apprécié sur les réseaux de régulation génétiques qui interviennent dans une multitude de processus. De nombreux écrans menées jusqu'à présent n'ont pas atteint la saturation, et donc de l'avant ainsi que des écrans de génétique inverse sont restés une pierre angulaire d'identifier et d'analyser les mécanismes de l'embryogenèse. Bien qu'il existe des idées extraordinaires qui peuvent être tirées à partir de n'importe quelle ligne mutant poisson zèbre unique, un facteur limitant majeur dans le domaine a toujours été l'effort de temps impliqué dans le clonage positionnel. Pour cette raison, l'identité de nombreuses mutations induites chimiquement est restée un mystère. Cependant, avec l'avènement récent des approches de séquençage du génome entier qui facilitent le clonage rapide ^11-14, identification incroyablement efficace des mutations génétiques est maintenant feasible.

L'écran avant prototype dans le poisson zèbre est un écran diploïde qui peut identifier des mutations récessives dans les trois générations ^6,7 (figure 1, colonne de gauche). Cette technique consiste à générer des mutations dans les cellules germinales du mâle parentale (P), puis l'accouplement ce mâle avec une femelle de type sauvage. Chacun de la première génération (F1) descendance de ce croisement seront abriter une ou plusieurs mutations uniques en raison des contributions chromosomiques du génome paternel muté. La descendance F1 sont élevés et par croisement avec des types sauvages pour créer des familles de F2. Dans la famille de F2, frères et sœurs seront soit de type sauvage ou les porteurs hétérozygotes, et sont incrossed hasard pour générer embrayages F3 qui sont analysés pour phénotype (s) d'intérêt. Les embrayages F3 de porteurs hétérozygotes contiennent 25% de type sauvage, 50% hétérozygotes et 25% homozygote poisson mutant. Ce schéma de dépistage multi-générationnelle est efficace, cependant un inconvénient majeur à cela uneAPPROCHE comprend le temps nécessaire pour se préparer à l'écran: au moins 1 an d'élevage de poissons est seul en cause, puisque chaque génération a besoin d'environ 3 mois pour atteindre la maturité sexuelle. Autres limites de ce type d'écran diploïdes sont le travail, l'espace, et le coût du logement ces générations.

L'écran est un haploïde alternative qui peut être utilisée pour identifier et isoler la suite des mutations récessives en utilisant des stratégies de mutagenèse similaires ¹⁵ (figure 1, colonne de droite). La production d'embryons de poisson zèbre haploïdes a d'abord été décrit il ya plus de 30 ans ^16, et la capacité du poisson zèbre normalement diploïde à développer pendant plusieurs jours avec une ploïdie chromosomique haploïde a été utilisé pour de nombreuses études génétiques depuis cette époque. Le principal avantage de l'écran haploïde est que cette méthode ne comporte pas élever une famille F2 afin de dépister les allèles mutants récessifs. Au lieu de cela, les femelles de la génération F1 sont évalués pourhétérozygotie des mutations récessives dans le processus d'intérêt en examinant leur progéniture F2 dans un état ​​haploïde (figure 1, colonne de droite). Dans l'ensemble, les mesures pour se procurer des embryons haploïdes sont relativement simples (figure 2). Après la préparation des solutions nécessaires pour la manipulation de sperme, les oeufs sont obtenus à partir de femelles de la génération F1 par la manipulation manuelle de manière à extruder (ou «squeeze»), les œufs du ventre. Une fois les oeufs sont obtenus, ils sont fertilisés in vitro par exposition à un rayonnement ultraviolet (UV) du sperme inactivé. Le sperme inactivé aux UV sont incapable de contribuer ADN viable pour l'œuf en raison du fait que la longueur d'onde courte UV réticule l'ADN paternel. Cependant, les spermatozoïdes sont encore capables de déclencher l'activité de l'oeuf et les événements liés au développement zygotique. Lors de l'activation métabolique, l'œuf va compléter la méiose II, et de procéder à développer avec seulement une copie maternelle déposé de chaque chromosomoi. En raison de cette 1N ploïdie, l'embryon est soumis à des conséquences sur le développement d'un allèle mutant récessif, si elle est présente sur un chromosome maternel. Ainsi, chaque embrayage haploïde F2 contient 50% de type sauvage et 50% des embryons mutants si la mère est porteuse hétérozygote d'un allèle récessif entièrement pénétrante. Cette distribution des génotypes embryonnaires permet une relative facilité en termes d'évaluation de l'embrayage de la présence du phénotype mutant (s) d'intérêt. Si un tel phénotype est détectée, le fondateur femelle génération F1 est ensuite par croisement de type sauvage poisson zèbre mâle à créer et à mobiliser davantage de porteurs hétérozygotes. Parce qu'il n'est pas nécessaire de soulever plusieurs générations pour effectuer l'écran, le chercheur peut économiser beaucoup de temps, de travail et un espace d'aquarium, mais il a encore le pouvoir de surveiller un nombre important de génomes fondée sur le nombre de femelles F1 examiné. Ainsi, les écrans haploïdes sont particulièrement possible pour les petits laboratoires ou des projets initiés dans le absence de financement important.

Cependant, il existe plusieurs limitations et inconvénients de l'utilisation d'haploïdes. Tout d'abord, embryons de poisson zèbre haploïdes ne vivent que quelques jours, et meurent généralement entre 3 et 5 jours après la fécondation (DPF) ^15. Embryons de poisson zèbre haploïdes peuvent être distingués des diploïdes en fonction de plusieurs caractéristiques, au premier rang desquels étant un corps court et trapu qui a néanmoins le nombre normal de segments somites ^15,17. Comme le développement progresse, les expositions du cerveau a augmenté la mort cellulaire et la circulation est faible, généralement associée à l'accumulation de sang par 2-3 dpf et œdème ^15,17. En outre, haploïdes ne parviennent pas à gonfler un ^15,17 de la vessie natatoire. Indépendamment de ces différences morphologiques, la plupart des principaux organes et tissus sont formés, y compris le cœur, les yeux, et notocorde ^15,17. Une caractéristique à noter sur les embrayages haploïdes, c'est qu'ils contiennent une gamme de phénotypes en termes de variétés d'embryons défectueux et #8212; une caractéristique observée dans les souches de poisson-zèbre. Ainsi, on devrait vérifier si le tissu (s) et le point d'intérêt de temps montrent le développement raisonnablement normale dans la souche haploïde de type sauvage et ont donc le potentiel d'être évalué pour les défauts génétiques dans un écran ou un projet de recherche.

Malgré ces défis, écrans haploïdes ont été mises en œuvre avec succès pour identifier les gènes nécessaires pour les processus de développement précoce dans le poisson-zèbre, et les protocoles haploïdes ont été bien établies des ressources dans la communauté depuis de nombreuses années ^15-19. Plus récemment, le procédé consistant à générer des embryons de poisson haploïdes a été utilisée par les chercheurs pour créer haploïde souches embryonnaires (ES) de cultures de cellules de poissons de medaka ^20,21. Après la production d'embryons haploïdes medaka in vitro, les embryons ont été utilisées pour obtenir des cultures de cellules primaires qui ont été soumises à des passages pendant environ 15 semaines, suivies par un autre 5-8 semaines pour générer des clones purs de cellules haploïdes avecES propriétés des cellules ^15-19. La génération de haploïdes lignées de cellules ES de poissons détient large promesse d'avenir pour l'analyse des phénotypes récessifs dans des lignées de cellules de vertébrés, et représente une nouvelle approche pour l'analyse génétique dans les années à venir. Ainsi, la production d'embryons de poisson haploïdes a de plus en plus d'applications dans le milieu de la recherche biomédicale. Cet article vidéo fournit une démonstration visuelle des étapes de la production d'embryons de poisson zèbre haploïdes in vitro en utilisant le sperme inactivé aux UV basée sur des protocoles établis ^15-19,22.

Protocol

REMARQUE: Les procédures pour travailler avec embryons de poisson zèbre décrits dans le présent protocole ont été approuvés par l'établissement de soins et d'utilisation des animaux Comité à l'Université de Notre Dame. NOTE: Bien que le protocole suivant fournit une démonstration de l'isolement des spermatozoïdes qui implique l'euthanasie des hommes, le sperme peut être la collecte du pore génital de anesthésié vivant poisson zèbre mâle utilisant la pression abdominale douce et un micro-capillaire pour la collecte de sperme ^17,18. Presser des hommes vivants nécessite plusieurs hommes pour être utilisé afin de recueillir une quantité équivalente de sperme qui peut être obtenu à partir d'un mâle euthanasiés ^17,18. Cependant, les hommes qui ont subi une compression restent en bonne santé et peuvent être utilisées pour des accouplements naturels ou des procédures ultérieures in vitro ^17. Chaque fois que possible, les procédures choisies doivent minimiser sacrifice de poissons inutile.

1. Préparation des solutions et de poisson-zèbre accouplement Chambers

1. Préparer images Solutions de Hank (n ° 1, 2, 4, 6) et Premix solution de Hank (voir le tableau des Matériaux) ^19, puis l'autoclave et conserver à 4 ° C.
2. Sélectionnez le nombre souhaité de femelle adulte (s) de poisson zèbre pour la collecte d'embrayage haploïde. REMARQUE: Basé sur l'expérience, en utilisant une F1 mutagénisée composé de consanguine Tübingen souche de poisson zèbre, environ 50% des femmes sexuellement matures étaient «compressible» en moyenne après leur amorçage en les plaçant dans une cage d'accouplement pendant la nuit avec un homme - c'est à dire un embrayage a été obtenu via la procédure de compression - et la majorité de ces embrayages (variant entre 70-90%) produit haploïdes viables. Avec deux chercheurs effectuant la préparation haploïde, environ 80 femmes adultes F1 poisson zèbre peut être pressé en une matinée. Pour calculer les réactifs nécessaires pour l'expérience haploïde, dans le facteur à la fois le taux de compression de la génération F1 et du nombre de chercheurs disponible pour effectuer l'experiment. Gardez à l'esprit que le nombre de femmes qui produisent embrayages haploïdes de haute qualité est extrêmement variable, avec des différences observées entre les femmes de différentes souches de poisson zèbre, les âges et régime alimentaire ^15.
3. Préparer cages d'accouplement en plaçant chaque femelle adulte poisson zèbre avec un poisson-zèbre mâle adulte dans une chambre d'eau du système de sorte qu'ils sont séparés par une cloison nuit. REMARQUE: Les femelles doivent être exposés à une nuit de sexe masculin pour amorcer, ou les préparer, pour le frai par compression.

2. Dissection des testicules

1. Assurez Stock Solution # 6 de frais de Hank en ajoutant 0,35 g de bicarbonate de sodium à 10 ml d'eau distillée. Bien mélanger pour dissoudre la poudre de bicarbonate de sodium.
2. Combiner le texte suivant dans un tube sur la glace afin de préparer une solution de travail final de Hank tamponnée pour le sperme: 9,9 ml de Hanks Premix I avec 100 pi de solution de stock # 6.
3. Mélangez bien, puis aliquoter 500 pi de l'écheveau7; s solution de travail final dans un tube à centrifuger et placer sur la glace. REMARQUE: Chaque pi aliquote 500 sera utilisé pour préparer les spermatozoïdes des testicules de poisson-zèbre mâle 4-5.
4. Choisissez entre 4-5 poisson zèbre mâle pour chaque récolte de sperme. NOTE: Ce sera récolter suffisamment de spermatozoïdes pour être collectées, traitées et stockées dans un tube de 1,5 ml, qui peut être utilisé pour fertiliser environ 15 embrayages haploïdes. Sélectionnez cohortes supplémentaires des hommes en vue de préparer des tubes supplémentaires en fonction de l'ampleur de l'expérience. Si le poisson zèbre mâle sélectionné sont de petite taille ou des testicules dissection est incomplète, généralement 5 mâles seront nécessaires.
5. Euthanasier chaque mâle en utilisant un filet de transférer délicatement le poisson dans un plat contenant 0,2% tricaine environ 5-6 min à température ambiante. NOTE: Soyez attentif à ce que l'homme a été correctement euthanasiés avant le début de la dissection. Typiquement, attendre plusieurs (2-3) minutes après les branchies de l'arrêt mobile de poisson et le poissonest plus sensible au toucher.
6. Choisissez le mâle doucement avec une cuillère en plastique et éponger soigneusement le mâle sec de liquide. Ensuite, retirez la tête de l'homme avec une paire de ciseaux et couper une incision le long de la ligne médiane ventrale. NOTE: suppression de tous les excès de liquide du poisson est essentiel pour empêcher l'activation des spermatozoïdes de déclenchement.
7. Retirer l'intestin et les organes de l'intestin associés de la cavité abdominale à l'aide de pinces fines et placez dans un container prévu pour l'élimination.
8. Utilisez une pince fine pour retirer les testicules, qui sont situés le long de la paroi dorsale du corps, latéraux à la vessie natatoire, et avoir un aspect blanc opaque lorsqu'il est vu sous la loupe binoculaire. NOTE: Garder les testicules intact peut aider à prévenir l'exposition du sperme à des fluides corporels à base d'eau et ainsi empêcher le déclenchement prématuré.
9. Placez les testicules dans la solution de sperme sur la glace et garder le tube sur la glace que les autres testicules sont disséqués. Répétez les étapes 2.6 à 2.9 jusqu'à ce que tout le males ont été disséqués.
10. Placez les carcasses et les tissus d'animaux restants dans un container prévu pour l'élimination institutionnel approprié.

3. UV sperme Inactivation

1. Homogénéiser les testicules par broyage délicatement le tube à centrifuger avec un pilon microtube stérile.
2. Transférer le surnageant dans une petite boîte de Pétri ou verre de montre sur la glace. NOTE: Ne pas transférer les débris de tissu avec la solution de surnageant. Cela va créer des ombres et de compromettre l'inactivation UV de sperme.
3. Rincer le tube de sperme avec entre 300-400 ul de solution de travail final de plus Hank (préparé à l'étape 2.2 et stocké sur de la glace), et ajouter ce lavage de surnageant à la petite boîte de Petri ou regarder le verre à l'étape 3.2.
4. Exposer le plat à partir d'une lampe UV de banc (254 nm) pour un total de 2 minutes à une distance de la source d'environ 15 à (38,1 cm) de la lampe. NOTE: Soyez prudent lorsque vous travaillez avec une lampe UV et de porter un masque ouautre œil équipement de protection individuelle.
5. Remettre le plat dans le seau de glace, puis transférer le sperme UV inactivé dans un tube à centrifuger frais et stocker l'échantillon sur la glace. NOTE: A ce stade, il y aura environ 800 pi de UV inactivé sperme pour la fécondation embrayage haploïde. Le sperme doit être conservé sur de la glace pendant toute la durée de temps passé sur serrant les femmes. Sperme dans le froid de Hank peut être utilisé pour un maximum de 6 heures sans réduction de la fertilisation résultat. Fait intéressant, d'autres chercheurs ont rapporté que les spermatozoïdes dans le froid de Hank est viable de plusieurs heures à plusieurs jours ^18.

4. Marchés œuf, de la Femme et de poisson zèbre adulte fécondation in vitro de l'embrayage

1. Préparer un bain de tricaine pour l'anesthésie en combinant 20 ml de 0,2% tricaine actions avec 80 ml d'eau du système de poisson.
2. Sélectionnez la femelle pour la collecte des œufs, à l'aide d'un filet à la placer délicatement dans le plat de tricaine.
3. Attendez 2-3 min jusqu'à ce que la femelle est anesthésié et ne répond plus au toucher. NOTE: Si les tics féminins ou provoque d'autres mouvements, lui donner plus de temps pour succomber à l'anesthésie.
4. Utilisez une cuillère en plastique pour soulever délicatement la femelle, la décantation la solution avant de placer la femme sur une serviette en papier pour évacuer l'excès de liquide. REMARQUE: Veillez à ne pas laisser solution supplémentaire sur la femelle, comme fluide déclencher l'activation de l'œuf avant l'ajout de sperme.
5. Placez la femelle sur son toboggan dans une boîte de Petri propre et visualiser son ventre sous la loupe binoculaire.
6. Maladies du ventre de la femelle doucement pendant environ 10-20 secondes en utilisant un ou deux doigts d'une main à serrer les œufs de son abdomen, le soutien en attendant le retour de la femelle en positionnant un ou deux doigts de l'autre main, juste derrière le mur de son corps dorsale. NOTE: Lors de caresser le ventre de la femelle, les œufs doivent sortir très facilement. Si les œufs ne sont pas apparues esprith facilité, il n'est pas conseillé de «pousser plus fort» et de la force des œufs de la femelle. Cela indique que les oeufs ne sont pas présents et / ou n'est pas prêt pour la fécondation, et a continué de poussée est associée à un risque considérable de nuire à la femelle (par exemple, dégonfler la vessie natatoire ou causer d'autres blessures internes létale). Si une femme est pressé mais fournit aucune ou peu d'oeufs, de retour à la femelle de l'animalerie. Après 1-2 semaines de repos, la paire la femelle avec un mâle pour un accouplement naturel pour nettoyer les débris d'œufs résiduelle. Séparer les femelles qui s'accouplent naturellement dans un réservoir pendant 1-2 semaines de repos avant de tenter une seconde pression. Alternativement, les femelles peuvent être mis au repos pendant 4 semaines, période pendant laquelle ils peuvent être mis en place pour accouplements naturels ^15.
7. Utilisez une sonde fine ou petite spatule pour ramasser les oeufs de sous la femelle et / ou sa surface de ventre.
8. Soulevez doucement la femelle et son retour à un réservoir d'isolement dûment étiquetés contenant de l'eau du système de poisson.
9. Ajouter 50 ul de solution de sperme UV inactivé à la ponte, et incuber à température ambiante pendant 30 secondes et pendant ce temps, apposer une étiquette correspondant à la boîte à pister avec le numéro attribué au parent femelle.
10. Ajouter 1 ml de E3 pour les oeufs, et incuber à température ambiante pendant 1 min.
11. Ajouter la solution de l'E3 suffisante pour remplir le plat à mi-chemin, et placer les embryons à 28 ° C pour une incubation ultérieure. NOTE: L'addition de pénicilline / streptomycine (1% (v / v) de solution pen-strep contenant 5.000 unités de pénicilline et 5 mg de streptomycine par ml) ¹⁹ à la E3 peut aider à la santé globale des embryons haploïdes.

5. Observation et la manipulation des embryons haploïdes

1. Après 4-8 heures, retirer les embryons non fécondés dans le plat et laver les embryons restants par le remplacement du support d'embryon E3 avec une solution de E3 frais. NOTE: non fécondés embryons afficheront, un aspect blanc opaque ou peuvent afficher une manière transparenteppearance avec une cellule unique difforme.
2. Incuber jusqu'à ce point d'intérêt de temps souhaité, puis utiliser dans le test de l'écran désiré ou une autre application (s) de recherche.

Results

La production d'embryons haploïdes peut être mis en œuvre pour identifier les mutations récessives dans la génération F2 lorsque les haploïdes sont obtenus à partir de femelles de poisson zèbre matures qui sont les enfants de parents ayant subi une mutagénèse (Figure 1). Cela économise du temps et de l'espace par rapport à l'écran diploïde traditionnel, dans lequel les chercheurs ont besoin pour élever une famille dont les descendants F2 diploïdes sont ensuite évaluées pour phénotypes d'intérêt (figure 1).

Les principales étapes du protocole décrit dans les étapes 1-5 ci-dessus pour obtenir des embryons de poisson zèbre haploïdes par fécondation in vitro sont schématisés sous forme d'organigramme (Figure 2). Ces étapes comprennent la préparation de solutions et l'amorçage des femmes par l'exposition aux hormones mâles dans les réservoirs d'accouplement (Jour 1), suivie par le sperme et les achats d'oeufs et la fécondation in vitro (Jour 2), et enfin l'élevage des haploïdes (jours 3-5) (Figure 2). Lorsque comcombinée avec un écran génétique, une procédure de mutagenèse commun chez le poisson zèbre comprend l'exposition précédente du poisson zèbre adultes mâles de type sauvage à un agent mutagène (par exemple, à un agent mutagène chimique comme ENU, bien que d'autres procédures, comme rétroviral à base mutagenèse peuvent être mises en œuvre qui a également faciliter le clonage de l'anomalie chromosomique), suivie par l'élevage avec des femelles sauvages de créer une génération de F1 mutagénisée. Ces préparations nécessitent plusieurs mois de travail (environ 6 mois) sur la base des temps de génération nécessaires pour les types sauvages arrière, effectuer la mutagenèse, et à l'arrière de la suite mutagénisée F1 ^15,17,22.

Un autre point majeur pour examen en employant haploïdes pour un écran est le choix de la souche de poisson zèbre. L'AB * (AB étoiles) souche est devenu bien connu pour produire des embryons haploïdes avec de meilleures caractéristiques globales et de la santé que les autres souches ^15. Cependant, dans la souche dérivée Tübingen élevés dans notre laboratoirehistoire, nous avons récemment observé caractéristiques embryologiques qui ont permis écrans succès pour les anomalies de développement du système rénal (G. Gerlach et R. Wingert, non publié). Adulte poisson zèbre Tübingen contrainte hommes ont été soumises à une mutagenèse par une série de trois traitements ENU, puis croisés à des femelles sauvages Tübingen pour générer une génération F1 pour le dépistage. Les femelles F1 ont été pressés d'obtenir des œufs et des œufs de F2 ont été fécondés avec le sperme UV inactivé. Par rapport aux embrayages diploïdes obtenus par croisements naturels des parents Tübingen de type sauvage (figure 3A), les embryons de ces haploïdes Tübingen contrainte embrayages affichés un court, trapu tronc caractéristique de l'état haploïde (figures 3B, C). En outre, les embrayages haploïdes sont généralement constitués de frères et sœurs d'embryons qui présentent une gamme de défauts, que nous avons observé aussi bien (figures 3B, C), qui est connu pour varier à l'intérieur de souches, comme on le verra plus loin ^15,17.

Des études antérieures ont établi une série de classement canonique, correspondant aux grades de A à D, de classer la gamme de défauts haploïdes phénotype ^15,17, et plus haploïdes ont aussi été mentionnées en termes de les adjectifs bon, intermédiaire et de mauvaise qualité ^22. Haploïdes de catégorie A, correspondant à haploïdes de haute qualité, sont le plus normal en apparence, avec un corps court et trapu, mais montrent dans l'ensemble une apparence morphologique similaire à diploïdes ^15,17,22 (comparer frères diploïdes (d) à haploïde grade A (marqué A) frères et sœurs, la figure 3B). Haploïdes embryons de catégorie A développent également un œdème péricardique modeste, qui est une caractéristique typique du développement de poisson zèbre haploïde ^15,17,22 (figure 3B). En comparaison haploïdes de catégorie A, intermédiaire ou soi-disant grade B embryons haploïdes (B marqué, figures 3B, C) ​​se distinguent par le développement d'un / twis encore raccourci ou pliéted tronc, si caractéristiques d'une tête et la queue sont clairement distingués ^15,17,22. Enfin, grade C ou de mauvaise qualité haploïdes (également énumérés dans certaines références comme C / D) ^15,17,22 sont extrêmement défectueuse et affichent une masse désorganisée des cellules en association avec une boule de jaune (marqué C, figure 3C). Même parmi la même souche, embrayages haploïdes varient dans la distribution de A, B, et C phénotypes que l'on va observer. Par exemple, l'embrayage haploïde d'une femelle Tübingen affiché un meilleur développement global, avec une majorité de A et de classe B descendance haploïde (figure 3B) par rapport à haploïdes obtenus à partir d'une deuxième femme Tübingen, dont embrayage se composait de nombreux grade C descendance haploïde ainsi que A et les phénotypes haploïdes B (figure 3C). Souche similaire variabilité des qualités d'embryons haploïdes ont été précédemment observé dans AB et AB * souche poissons ainsi ^15.

Malgré ces mordifférences morphologiques, l'organogenèse de nombreuses structures relativement procède normalement dans l'embryon haploïde. Bien qu'ils aient une plus courte corps tronc, le développement d'organes tels que les yeux et le coeur est relativement similaire à celle du type sauvage des embryons diploïdes, et des types de cellules telles que des cellules de pigment (les mélanophores et xanthophores) peut aussi être évaluée ^15. En outre, nous avons documenté récemment que les pronephros, ou de rein embryonnaire, est développé par après la fécondation 1 jour dans le haploïdes de type sauvage, de façon similaire à diploïdes de type sauvage. Comme preuve de ce type pronephros cellulaire motifs affiche le motif prototype de segments (figure 4). En outre, le phénotype des mutations récessives qui modifient le développement des pronephros, comme la mutation lib qui réduit la production d'acide rétinoïque, montrent une tendance similaire à l'état haploïde rapport à l'état diploïde (figure 4) ^23,24. Cette observation est en accord avec celle des autres récessionSive mutations qui conduisent à des phénotypes similaires à la fois dans l'état haploïde et diploïde, si ce n'est pas toujours le cas avec toutes les mutations et doit être gardé à l'esprit si l'évaluation de ce type de stratégie de l'écran ^15.

Un certain nombre de tissus et d'organes sont généralement anormaux dans haploïdes. Par exemple, haploïdes présentent des défauts dans la circulation, communément présentant l'accumulation de sang, ce qui peut rendre leur capacité à étudier certains aspects de la vasculogenèse limitée ^15. En outre, il a été constaté que les haploïdes peuvent avoir des irrégularités dans le développement de l'oreille, de telle sorte qu'ils peuvent être évaluées pour des mutations qui empêchent la formation de vésicule otique entièrement, mais pas pour les mutations qui affectent les processus impliqués dans la morphogenèse subtiles de cette structure ^15. Comme autre exemple de cela, cerveau morphogenèse est anormal dans haploïdes, et donc écrans haploïdes à identifier requises voies de développement du cerveau sont limités ^15. Malgré ces limites, notre unenalyse de développement du rein à l'état haploïde (figure 4) ajoute cet organe à la liste des structures embryonnaires «criblés». Ce constat met en évidence qu'une méthodologie d'écran haploïde peut être utilisé pour disséquer les composantes génétiques de rénale ancêtre structuration et ajoute l'accent sur ​​le sentiment que les approches d'écran ingénieux peuvent contourner les limites de haploïde embryon ontogenèse de découvrir de précieux nouveaux modèles mutants pour étudier le développement des vertébrés ^15.

Figure 1. Schéma de stratégies d'écran diploïdes et haploïdes dans le modèle de poisson zèbre. Suite à la mutagenèse de la génération parentale, la génération F1 peut être relevé et utilisé soit pour générer des familles de mutant F2 qui sont utilisés pour cribler la génération F3 dans un état ​​diploïde (à gauche ) ou directement l'écraned dans une stratégie haploïde (à droite). Dans un écran haploïde, les femelles matures de la génération F1 sont utilisés pour recueillir des embrayages F2 haploïdes pour analyse génétique. Porteurs hétérozygotes femelles sont identifiés si environ la moitié des haploïdes F2 afficher un phénotype mutant (embryons rouges) par rapport à la fratrie haploïdes de type sauvage (embryons jaune).

Figure 2. Haploïdes organigramme de production d'embryons. Les principales étapes de la fécondation in vitro pour produire des embryons haploïdes sont schématisé comme tâches effectuées au jour 1 (boîtes roses) pour préparer les solutions de sperme et Premier adulte de poisson zèbre femelles, les tâches effectuées sur Jour 2 (boîtes oranges ) pour recueillir et inactivent UV sperme, à ramasser les œufs, pour fertiliser les oeufs avec UV inactivé sperme pour générer haploïdes, puis de relancer la mère femelle, et Finalltâches y effectuées les jours suivants 3-5 (boîte jaune) quand les embrayages sont incubées au point de temps souhaité (s) d'observation et d'analyse.

Figure 3. Comparaison de Tübingen embryons de poisson zèbre souche de diploïdes et haploïdes. A) diploïdes embryons de type sauvage ont été produites par la reproduction naturelle et ensuite incubés jusqu'à environ 30 HPF. B, C) ​​haploïdes embryons de type sauvage ont été produites par fécondation in vitro d'embrayages obtenus à partir de la génération F1 femmes ayant subi une mutagénèse avec le sperme inactivé aux UV, et incuber jusqu'à ce que environ 30 HPF. Haploïdes ont présenté une série d'anomalies dans le développement par rapport aux embryons diploïdes de type sauvage (flèches noires, d indiquer diploïde). Haploïdes relativement normales, il avait, plus de brut raccourci analogue au système de notation deun A haploïde ¹⁵ (flèches rouges, étiquetées A), tandis que haploïdes avec des anomalies flagrantes présentaient un axe de corps fortement tronqués (flèches violettes, B marqué) correspondant à une note de B, et enfin grade C (pointes de flèches bleues, marqué C) reposent sur descriptions publiées ^15. Tous les embryons ont été photographiés en direct à un grossissement 2.5X.

Figure 4. Structuration du développement de types de cellules qui composent l'organe pronephros embryonnaire du rein dans haploïde Tübingen souche de poisson zèbre. Types sauvages haploïdes affiché un schéma normal de types de cellules dans la structure de rein embryonnaire (ligne du haut). Le rein embryonnaire se compose d'une paire d'unités fonctionnelles segmentées appelées néphrons. Le motif segmenté de types de cellules présents dans néphrons discrètes peut être visualisée sur la base de l'ensemble de montage wt1b et néphrine dans le tubule contourné proximal (PCT) marquée par slc20a1a, le tubule droite proximale (TVP ) marqué par TRPM7, le début distale (DE) marquée par slc12a1, et le tube fin distale (DL) marquées par slc12a3. embryons lib haploïdes mutantes (podocytes rangée inférieure affichage) réduits, du PCT et un PST absent, avec un DE élargi et le segment de DL, semblable aux embryons lib diploïdes ^18. Les embryons ont été photographiés en vue dorsale, avec antérieure à la gauche, à un grossissement de 10X.

Discussion

Dépistage haploïde est une technique utile pour découvrir des gènes essentiels nécessaires pour les stades précoces du développement. En outre, la culture de cellules haploïdes du poisson médaka a été utilisée pour isoler des lignées de cellules ES-like qui ont de nombreuses applications et le potentiel de recherche, ce qui démontre que les cellules haploïdes peuvent offrir un lieu précieux pour l'avenir d'autres types d'études génétiques vertébrés ^20,21. Ce protocole fournit une démonstration des méthodes impliquées dans l'exécution de la production d'embryons de poisson zèbre haploïdes par fécondation in vitro avec sperme UV inactivé. Cette méthodologie peut être utilisée pour réaliser des écrans avant haploïdes avec des poissons de F1 mutagénisée, ce qui peut être fait en utilisant le type sauvage, transgénique ou des souches mutantes pour le dépistage amplificateur / suppresseur.

Bien que le temps de dépistage en utilisant une stratégie haploïde est largement réduite par rapport au dépistage diploïde, il sera néanmoins prendre plusieurs mois. Comme nous décriLit précédemment, il ya de nombreux avantages qui existent en effectuant un écran à l'aide d'un schéma haploïde, qui peut aider à faire de nouvelles contributions à la connaissance actuelle sur un certain nombre d'événements de développement. La méthodologie de l'écran haploïde est plus efficace pour l'identification des allèles mutants récessifs que les écrans diploïdes base en raison de la réduction du temps, de l'espace, et le nombre de poissons qui sont nécessaires. Cependant, il ya plusieurs pièges à un écran haploïde. Un écran haploïde ne peut identifier des mutants dans les gènes qui sont actifs dans les premiers jours de développement, l'embryon ne peut survivre que pour un temps limité avec un génome haploïde. Les gènes qui sont exprimés plus tard dans le développement auraient besoin d'être identifiés par un procédé différent, par exemple un écran diploïde. En outre, certains organes ne se développent pas correctement dans un organisme haploïde. Il peut y avoir des anomalies anatomiques, ou un temps retardé de développement, qui peuvent causer la mutation manquer par la technique de dépistage haploïde. Jen outre, certaines souches de poissons ne se développent pas aussi bien dans un état ​​haploïde ^15. Haploïdes peuvent être classés par une série de classement de bonnes, intermédiaires et pauvres caractéristiques embryonnaires, avec un embryons étant la plus normale, B pour désigner les embryons à des défauts dans l'axe, mais une tête et la queue claire, et C / D pour désigner embryons avec méconnaissable caractéristiques (masses de cellules au sommet de boules de jaune) ^15,17. Les proportions des embryons au sein de ces catégories varie selon la souche de poisson zèbre, avec un nombre accru de meilleures haploïdes de qualité les plus répandus dans certaines origines génétiques ^15,17. En raison de ces facteurs, il est nécessaire de trouver une souche appropriée d'un poisson zèbre pour effectuer la mutagenèse et de croisements ultérieurs. Dans notre expérience récente, la souche de type sauvage Tübingen produit haploïdes viables pour le dépistage (comme le montrent les figures 3 et 4) si les chercheurs ont utilisé historiquement poisson zèbre AB ou AB * les souches pour expérim haploïdetation ^15.

En plus de ces défis susmentionnés, pas toutes les femmes de poisson zèbre adulte amorcées vont produire un embrayage lors de l'exécution de la technique de compression. Par exemple, en travaillant avec FRA-mutagénisées Tübingen contrainte femelles, environ la moitié de toutes les femmes produit un embrayage à presser, et une fraction de ceux-ci (généralement 10-30%) étaient de mauvaise qualité de l'embryon ou n'a pas pu être fécondé. Ainsi, pour effectuer un écran haploïde, il faut prévoir de réunir au moins deux fois autant de poissons que nécessaire pour dépister le nombre souhaité de génomes (chaque femelle représente un génome projeté). Indépendamment de cette considération, les avantages de la méthode de dépistage haploïde pour couvrir un grand nombre de génomes sans animalerie massif sont en effet très important si le test se prête à l'état haploïde. Toutefois, il convient également de noter que l'étude complémentaire de la mutation (s) dans l'embrayage haploïde est entièrement tributaire de soulever avec succès unen retrempe du fondateur femelle. Comme avec n'importe quel écran, 'frappe' abord identifiés au cours du processus de sélection doit être ré-identifiés dans l'état diploïde.

Malgré les risques de l'utilisation de l'écran haploïde, il a montré de très bons résultats dans l'identification des mutants, qui ont été analysés en profondeur avec des gains perspicaces sur le terrain scientifique ^15. Écrans haploïdes peuvent être mises en œuvre pour enquêter sur d'autres processus mal compris de développement des vertébrés. Utilisation haploïdes pour écrans amplificateurs et suppresseurs est une façon de gagner plus de perspicacité dans les activités et réseau de régulation d'un gène d'intérêt. La technique de criblage haploïde peut également être utilisée pour identifier des activateurs et suppresseurs de mutants qui ont déjà été isolées par des procédés tels que la mutagenèse chimique ou insertion ou génétique inverse approches comme TILLING ou TALENs. En bref, le mutant isolé précédemment peut être mutagenèse avec ENU et tamisé pour amplificateurs ou suppressors du phénotype mutant d'origine. Le mutant doit être en mesure d'atteindre le stade adulte, il est donc nécessaire d'avoir un animal hétérozygote ou homozygote mutant faible poissons pour effectuer cet écran, mais les récents progrès dans la transgenèse ont permis aux chercheurs de jupe ce problème. Apprendre à manipuler les voies du développement peut conduire à de nombreuses possibilités intéressantes, dont la perspective de parcours de perturbation pour traiter des états pathologiques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution mère Hank’s #1			8,0 g de NaCl, 0,4 g de KCl dans 100 ml de ddH2O
Solution mère de Hank #2			0,358 g de Na2HPO4 anhydre ; 0,60 g de K2H2PO4 dans 100 ml de ddH2O
Hank’s Solution Mère #4			0,72 g de CaCl2 dans 50 ml de ddH2O
mère de Hank #5			1,23 g de MgSO4-7H2O dans 50 ml de ddH2O
Hank’s Premix			Combinez dans l’ordre suivant : (1) 10,0 ml HS#1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Stockez toutes les solutions HS et le prémélange à 4 ° ;C.
Hank’s Stock Solution #6			0,35 g de NaHCO3 dans 10,0 ml de ddH2O ; faire frais le jour de l’utilisation.
Hank’s Solution			Combinez 9,9 ml de Hank’s Premix avec 0,1 ml HS Stock #6
Lampe de banc UV série XX	UVP	95-0042-05	Modèle XX-15S Lampe
banc XX Support de banc (réglable)	UVP	18-0062-01	Modèle XX-15 Support
Plat d’incubation d’embryons	Falcon	35-1005
50 X E3			250 mM de NaCl, 8,5 mM de KCl, 16,5 mM de CaCl2, 16,5 mM de MgSO4 dans de l’eau distillée. Compléter avec du bleu de méthylène (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) pour inhiber la contamination.
1 X E3			Dilué 50 X E3 dans de l’eau distillée
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ645 ;