Article de méthode

Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-

DOI :

10.3791/51710

⸱

18 octobre 2014

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1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

Dans cet article

Résumé

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Cette présentation démontre une méthode dans laquelle l’électroporation de cellules adhérentes et cultivées est utilisée pour l’étude de la communication intercellulaire et jonctionnelle, tandis que les cellules se développent sur une lame recouverte d’oxyde d’indium-étain conducteur et transparent.

Résumé

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Dans cette technique, les cellules sont cultivées sur une lame de verre partiellement recouverte d’oxyde d’indium-étain (ITO), un matériau transparent et conducteur d’électricité. Une variété de molécules, telles que des peptides ou des oligonucléotides, peuvent être introduites dans 100 % des cellules de manière non traumatique. Ici, nous décrivons comment il peut être utilisé pour étudier la communication intercellulaire et jonctionnelle lacunaire. Le jaune de Lucifer pénètre dans les cellules lorsqu’une impulsion électrique, appliquée sur la surface conductrice sur laquelle elles se développent, provoque la formation de pores à travers la membrane cellulaire. C’est l’électroporation. Les cellules qui se développent sur la surface du verre non conducteur immédiatement adjacente à la région électroporée n’absorbent pas le jaune de Lucifer par électroporation, mais acquièrent le colorant fluorescent lorsqu’il leur est transmis via des jonctions lacunaires qui les relient aux cellules électroporées. Les résultats du transfert du colorant d’une cellule à l’autre peuvent être observés au microscope sous éclairage de fluorescence. Cette technique permet une quantification précise de la communication jonctionnelle des lacunes. De plus, il peut être utilisé pour l’introduction de peptides ou d’autres molécules non perméables, et le transfert de petits peptides électroporés via des jonctions lacunaires pour inhiber le signal dans les cellules adjacentes non électroporées est une démonstration puissante de l’inhibition du signal.

Introduction

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L'application d'un courant électrique à une cellule provoque la formation de pores de la membrane de la cellule, par un processus appelé électroporation. Les pores permettent le passage d'une variété de molécules à travers la membrane nonpermeant. Le champ électrique peut être commandée avec précision, de sorte que les pores formés sont très petites et se referment rapidement, avec un minimum de perturbation de la physiologie cellulaire. Fait intéressant, les cellules adhérentes sont cultivées sur une lamelle de verre revêtue d'oxyde d'indium-étain conductrice et transparente (ITO) et une électroporation in situ, qui se trouve sur la surface, où elles poussent, sans se détacher à une électroporation en suspension. Les cellules peuvent se développer très bien sur cette surface, et comme ils sont attachés et étendus, l'observation microscopique détaillée est possible. En utilisant cette technique, de petites molécules peuvent être introduites nonpermeant directement et essentiellement en 100% des cellules, ce qui rend cette technique particulièrement appropriée pour des études sur l'activation de la components une voie de stimulation suivantes ligand d'un récepteur (revue dans 1).

L'électroporation a été utilisé principalement pour l'introduction d'ADN (également appelé électrotransfection). Cependant, l'électroporation in situ peut être utile pour l'introduction d'une grande variété de molécules, telles que des peptides, des oligonucléotides 2-4, tels que l'ARN antisens, des oligonucleotides double brin de l'ADN leurre pour inhiber la liaison du facteur de transcription, ou siRNA 3,5, 6, 7-10 nucléotides radioactifs, des protéines 11 12 ou pro-médicaments 13. Après l'électroporation, les cellules peuvent être lysées par des analyses biochimiques ou fixées et colorées avec des anticorps.

Le revêtement d'ITO conductrice est très mince, 800-1,000Å, de sorte que la croissance de la cellule n'est pas perturbée par la différence de hauteur des deux surfaces, comme les cellules se développent à travers le bord de la couche conductrice. Ceci offre l'avantage que le non-electropfilmée cellules peuvent être cultivées à côté de ceux électroporation, pour servir de témoins. La même approche peut être utilisée pour l'examen des jonctions lacunaires, la communication intercellulaire (GJIC), comme décrit dans la vidéo.

Les jonctions lacunaires sont des canaux reliant les intérieurs des cellules adjacentes 14. Gap jonction, la communication intercellulaire joue un rôle important dans la formation des tumeurs et des métastases, alors que les oncogènes Src telles que supprimer GJIC 15,16. Pour examiner GJIC un colorant fluorescent tel que le jaune Lucifer (LY) est souvent introduit dans des cellules en culture à travers la micro-injection ou gratter de chargement 17 et de la diffusion du colorant dans les cellules voisines est observée au microscope sous éclairage fluorescent. Ces techniques mais provoquent invariablement des dommages cellulaires. Nous décrivons maintenant une technique dans laquelle les cellules sont cultivées sur une lamelle de verre, qui est partiellement revêtue d'ITO 18. Une impulsion électrique est appliquée en présence de LY (ou d'autres colorants) cal'aide de sa pénétration dans les cellules en croissance sur la partie conductrice de la glissière, tandis que la migration de colorant aux cellules adjacentes, non électroporation a été observée au microscope par l'illumination de fluorescence. Pour éviter que les cellules sensibles perturbateurs peuvent avoir tendance à se détacher de la monocouche, un ensemble a été conçu qui ne nécessite pas une électrode à être placé au-dessus des cellules pour appliquer le courant électrique 19. Cette méthode offre la possibilité de quantifier GJIC dans un grand nombre de cellules, sans aucune perturbation détectable pour le métabolisme cellulaire, comme indiqué par l'absence d'un effet sur ​​la durée de la phase G1 suite à une stimulation de sérum 12, l'augmentation des niveaux de la fos protéine oncogène (Raptis, non publié) ou deux kinases associées au stress cellulaire, le porc de p38 ou JNK / SAPK kinase 1. Cette approche rendue possible l'examen du lien entre les niveaux d'expression oncogène, la transformation et GJIC 18, ainsi que l'effet de la Src et Stat3 sur GJIC dans une variété de types de cellules, y compris des cellules fraîchement cultivées à partir d'échantillons de tumeur du poumon de 20 à 23. En outre, dans l'électroporation in situ avec la configuration décrite qui manque une électrode supérieure a été utilisé avec succès pour la démonstration de l'écart jonction lors de la différenciation adipocytaire fermeture, bien que la fixation cellulaire au substrat est réduite à ce stade 19,24.

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Protocole

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1 Placage des cellules dans la électroporation Chambers

  1. Dans une hotte à flux laminaire, trypsiniser les cellules en utilisant une technique stérile, comme d'habitude.
    NOTE: Il est très important d'éliminer par centrifugation toutes les traces de la trypsine, car ils peuvent entraver la propagation des cellules sur la vitre, d'où la formation d'adhérentes et les jonctions communicantes.
  2. Introduire à la pipette 1 ml de la suspension de cellules dans des chambres d'électroporation stérile fourni avec l'électroporation in situ (Figure 1), et les placer dans un 37 o C, incubateur à CO 2.
    NOTE: L'adhésion cellulaire peut être améliorée par placage sur de la fibronectine, le collagène, la poly-lysine ou de la cellule et du tissu adhésif (voir le tableau des matériaux).
  3. Lorsque les cellules ont formé une couche confluente ils sont prêts pour l'examen de GJIC.

2. procédure électroporation

L'électroporation pour examen GJIC peut être effectuée en dehors d'une hotte à flux laminaire,car il ne prend que quelques minutes. Si des temps d'incubation plus longs sont nécessaires pour une expérience spécifique, il peut être réalisé entièrement dans une hotte à flux laminaire. Dans tous les cas, les chambres dans lesquelles les cellules sont cultivées doivent être stériles.

  1. Préparer une / ml solution jaune Lucifer 5 mg: Dissoudre 10 mg de poudre LY (fourni avec le électroporation) dans 2 ml de milieu de croissance exempt de calcium. Pour les expériences qui nécessite de plus longues durées d'incubation, filtre stériliser la solution et conserver à 4 o C.
  2. Aspirer le milieu de croissance et laver les cellules avec du milieu sans calcium, en faisant attention à ne pas rayer la monocouche ou sécher les cellules. Si les cellules sont séchées, ils ont généralement des noyaux sombres et ramasser LY sans électroporation. L'effet est plus prononcé dans le milieu de la diapositive qui est plus exposé aux courants d'air (figure 4F).
  3. Avec une pipette Eppendorf, pipeter la solution de colorant sur les cellules (400 ul pour l'ensemble de chambre), au niveau du bord de la chambre, being attention à ne pas toucher la couche de cellules.
  4. Placer la chambre dans le support fourni avec le électroporateur et appliquer une impulsion de la force appropriée (voir Discussion).
  5. Aspirer délicatement une partie de la solution LY. Il peut être réutilisé une deuxième fois pour des expériences moins importants.
  6. Ajouter DMEM sans calcium contenant 10% de sérum dialyse.
  7. Incuber les cellules pendant 3-5 minutes dans l'incubateur pour permettre le transfert de colorant à travers des jonctions communicantes.
    NOTE: L'inclusion de sérum dialyse à ce stade permet la fermeture des pores.
  8. Laver le colorant non constituée en société DMEM sans calcium pour l'observation de cellules vivantes. En variante, les cellules peuvent être fixées à ce stade, par l'addition de formaldehyde à 4% à la source, puis lavées avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate). Dans tous les cas, le lavage doit supprimer tous fond.
    NOTE: Dans des expériences préliminaires afin de déterminer les conditions optimales, si la tension est trop faible, il est possible de laisser les cellules récupèrent dans le incubator pendant quelques minutes et l'électroporation de la même lame d'une deuxième fois, à enregistrer dans le coût de diapositives.

3. examen microscopique

  1. Observer les cellules sous illumination par fluorescence en utilisant un microscope inversé équipé d'un filtre approprié pour la teinture utilisé. Pour jaune Lucifer, l'excitation est 423nm, émission 555 nm, filtre VTC pour un microscope Nikon IX70.
  2. Éliminer les effets du ménisque en plaçant une lamelle couvre-objet en verre sur le dessus de la matière plastique et, après l'avoir rempli de liquide avec la partie supérieure, afin d'examiner la morphologie cellulaire en contraste de phase. Pour de meilleures images, le puits peut être détachée de la lame, et la lamelle couvre-objet placé sur le châssis. Pour les cellules fixées, le puits peut être rempli avec du glycérol pour l'observation au microscope, tandis que pour des cellules vivantes, il doit être rempli avec un milieu de croissance.
    NOTE: Le lavage et la photographie est plus facile si les cellules sont fixées avec du formaldéhyde après le transfert du colorant (étape 2.7 ci-dessus). Si les cellules ne sont pas d't fixée, la fluorescence est éliminé des cellules à l'intérieur d'environ 60 minutes en fonction du type de cellule, la tension et la quantité de LY introduit alors dans les cellules fixes fluorescence est conservée pendant plusieurs heures. Cependant, la fluorescence se fane ou se dissipe après O / N incubation, même dans les cellules fixes. Pour cette raison, il faut prendre des images, peu de temps après l'électroporation (figure 2).

4 La quantification de la communication intercellulaire

  1. Photographier les cellules avec un objectif 20x sous fluorescence et contraste de phase (figure 3).
  2. Identifier et marquer d'une étoile les cellules par électroporation à la frontière avec la zone non-électroporation (Figure 2, flèche, bord d'électroporation).
  3. Identifier et marquer avec un point cellules fluorescentes sur le côté non-électroporation, où le colorant a transféré par les jonctions communicantes (figures 3A et 3B).
  4. Diviser le nombre total decellules fluorescentes sur la zone non-électroporation par le nombre de cellules électroporées le long du bord (figures 3A et 3B).
    REMARQUE: Le transfert d'au moins 200 cellules par électroporation frontières contiguës est calculé pour chaque expérience. Le nombre obtenu est la valeur GJIC.

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Résultats

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La figure 2 montre foie de rat cellules épithéliales de T51B électroporation avec 22, LY et photographiées sous fluorescence (panneau A et B) ou à contraste de phase (C), ci-après la fixation d'éclairage et de lavage. Dans le panneau A, le bord de la zone électroporation est marqué en rouge. Le gradient de fluorescence à la droite de la ligne rouge indique transfert à travers les jonctions communicantes. Dans la figure 3A et 3B, la quantification de la co...

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Discussion

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Les étapes critiques dans le protocole

Matériau électroporation
La pureté de la matière à une électroporation est très important. Si les cellules sont très plates, des concentrations plus élevées alors du colorant de suivi doivent être utilisés (jusqu'à 20 mg / ml pour LY) et dans de tels cas, la pureté est encore plus important que dans les cellules avec une forme plus sphérique 1. Outre LY une grande variété d'autres colorants ou des molécules nonpe...

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Déclarations de divulgation

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L’auteur correspondant est l’inventeur d’un brevet détenu par l’Université Queen’s, qui a été concédé sous licence à Cell Projects Inc. L’entreprise ou l’université n’avait aucune influence sur le contenu du journal.

Remerciements

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Nous remercions Lowell Cochran pour l’aide experte en vidéographie. Nous remercions LR pour l’aide financière des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), de la Fondation canadienne du cancer du sein (FCCS, section de l’Ontario), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), de l’Alliance canadienne pour la recherche sur le cancer du sein, des Centres d’excellence de l’Ontario, de Breast Cancer Action Kingston et du Fonds de legs Clare Nelson sous forme de subventions à LR. SG a été récipiendaire d’une bourse de recherche du CRSNG. MG a été soutenue par une bourse postdoctorale du US Army Breast Cancer Program, du ministère de la Recherche et de l’Innovation de la province de l’Ontario et du comité consultatif de recherche de l’Université Queen’s.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
DMEMCellgro http://www.cellgro.com/50-013-PB
DMEM sans Hyclone de Calcium(Thermo scientific : http://www.thermoscientific.com)SH30319-01
Sérum de veau donneur  ;PAA : http://www.paa.com/Cat.# B15-008
Sérum de veau fœtalPAA : http://www.paa.com/Cat.# A15-751
Appareil d’électroporationCell Projects Ltd Royaume-Uni : http://www.cellprojects.com/ACE-100
ChambersCell Projects Ltd Royaume-UniACE-04-CC4 puits
ChambersCell Projects Ltd Royaume-UniACE-08-CC8 puits
Lucifer YellowCell Projects Ltd Royaume-UniACE-25-LYHaute pureté
CelTakBD Biosciences354240Adhésif cellulaire et tissulaire
FibronectineSigma AldrichF1141
CollagèneBD Biosciences354236
Poly-LysineSigma AldrichP8920

Références

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Mots-clés

Communication par jonctions gaptransfert de Lucifer Yellowmicroscopie fluorescencepores de la membrane cellulaireinhibition du signalintroduction de peptidesanalyse quantitative

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