Tableau hybridation génomique comparative (CGH array) pour la détection des variantes génomiques du nombre de copies

Summary

CGH array pour la détection des variantes du nombre de copies génomiques a remplacé l'analyse du caryotype G-bandes. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic.

Abstract

La CGH à matrice pour la détection des variants du nombre de copies génomiques a remplacé l’analyse du caryotype en bande G. Cet article décrit la technologie et son application dans un laboratoire de services de diagnostic clinique. L’ADN extrait de l’échantillon d’un patient (sang, salive ou autres types de tissus) est marqué avec un fluorochrome (cyanine 5 ou cyanine 3). Un échantillon d’ADN de référence est marqué avec le fluorochrome opposé. S’ensuit une étape de nettoyage pour éliminer les nucléotides non incorporés avant que les ADN marqués ne soient mélangés et remis en suspension dans un tampon d’hybridation et appliqués à un réseau comprenant ~60 000 sondes d’oligonucléotides à partir de loci à travers le génome, avec une densité de sondes élevée dans les zones cliniquement importantes. Après l’hybridation, les réseaux sont lavés, puis balayés et les images résultantes sont analysées pour mesurer la fluorescence rouge et verte de chaque sonde. Un logiciel est utilisé pour évaluer la qualité de chaque mesure de sonde, calculer le rapport entre la fluorescence rouge et la fluorescence verte et détecter les variantes potentielles du nombre de copies.

Introduction

Il a été connu depuis de nombreuses années que les suppressions ou des copies supplémentaires de segments chromosomiques causent une déficience intellectuelle, une dysmorphie et des malformations congentical, et dans certains cas provoquer des syndromes génétiques ^1. Cependant, la seule technologie disponible jusqu'au milieu des années 2000 pour la détection du génome entier de ces changements était G-bandes analyse des chromosomes, qui a une résolution de l'ordre 5-10Mb, selon la région et la nature du déséquilibre, et qui ne peut pas détecter chromosomes anormaux où la matière a été remplacé par une région d'un chromosome différent avec le mê....

Protocol

1. L'étiquetage Réaction

1. Avant d'utiliser, dUTP pré-aliquote cyanine 3 et 5 nucléotides marqués, non marqués et des amorces aléatoires aux concentrations recommandées par le fabricant et magasin en plaques à 96 puits à -20 C prêt à l'emploi. Pour les fins de ce protocole, aliquote 10,5 pi de la dUTP marqué de appropriée et 10,5 ul nucléotides non marqués et des amorces aléatoires à chaque puits.
2. Décongeler la plaque prête à l'emploi de 96 puits de nucléotides et des amorces à 4 ° C pendant environ 1 heure, à l'abri de la lumière.
3. Une fois décongelé, équilibrer cette plaque à température ambiante pendant au moins 30 m....

Results

Chaque sonde sur un réseau hybride est visualisée comme un mélange de fluorochromes rouge et vert (voir Figure 1). Le ratio de rouge à un signal vert fluorescent pour chaque sonde est quantifiée par le scanner et le logiciel associé graphiquement en ratios de log2 selon leur position génomique, et identifie les régions relevant de limites prédéfinies extérieur. Les traces de tableau résultant permettent interprétation de régions identifiées comme génomiquement déséquilibrée. Par exemple, la trace d'un e.......

Discussion

CGH array ne détectera pas remaniements équilibrés ou des anomalies de ploïdie tels que la triploïdie. En outre, les déséquilibres mosaïque de bas niveau ne peuvent pas être détectés. Cependant, CGH array a une résolution plus élevée pour la détection CNV que l'analyse des chromosomes bandes G laquelle il a remplacé dans de nombreux laboratoires de cytogénétique. Ce est donc la norme de référence actuelle pour la détection du génome entier CNV. Elle peut être remplacée par des technologies de séquençage de prochaine.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGH microarray 8 x 60K	Agilent	G4126
Array CGH tampons de lavage	Agilent	5188-5226
Array CGH hybridation	buffer Agilent	5188-5380
Minelute kit de purification	Qiagen	28006
Array CGH kit d’étiquetage Enzo		ENZ-42672-0000