Un test comportemental simple pour tester la fonction visuelle dans Xenopus laevis

Summary

Têtards de Xenopus laevis préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir noir / blanc. Ce comportement est guidé par la vision. Sur la base de ce comportement, nous présentons un test simple pour tester la fonction visuelle des têtards.

Abstract

Mesure de la fonction visuelle chez les têtards de la grenouille Xenopus laevis, permet le dépistage de la cécité chez les animaux vivants. La réponse optocinétique est un comportement réfléchi basé sur la vision qui a été observée chez tous les vertébrés testés. Tadpole yeux sont petits, la réponse queue de bascule a été utilisé comme mesure de rechange, ce qui nécessite un technicien qualifié pour enregistrer la réponse subtile. Nous avons développé un test de comportement alternatif basé sur le fait que les têtards préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir lorsqu'il est placé dans une cuve avec des côtés à la fois en noir et blanc. L'analyse présentée ici est une alternative simple peu coûteux qui crée une réponse qui est facilement mesurable. L'installation se compose d'un trépied, d'une webcam et bacs de test imbriqués, facilement disponibles dans la plupart des laboratoires de Xenopus. Cet article comprend un film montrant le comportement des têtards, avant et après le sectionnement du nerf optique. Afin de tester la fonction d'un oeil, on inclut également reprérésultats représentatifs d'un têtard dans lequel chaque œil a subi axotomy rétinienne sur plusieurs jours consécutifs. Les études futures pourraient développer une version automatisée de ce test pour tester la vision de nombreux têtards à la fois.

Introduction

Xenopus laevis ont été utilisés comme un organisme modèle pour étudier la formation des yeux. Les yeux se développent rapidement, de plus en plus de maturité dans moins d'une semaine des gènes ou des voies d'essai qui ont un effet sur le développement et la fonction visuelle. Pour tester la fonction visuelle, la réponse optocinétique et optomoteur a été utilisée dans le poisson-zèbre et les têtards de Xenopus, respectivement ^1,2. Parce que les yeux de têtards de Xenopus sont relativement plus petit que le poisson-zèbre, ce test nécessite l'utilisation d'équipement spécialisé et de personnel qualifié pour détecter le comportement subtil queue-flip et mouvements oculaires chez Xenopus. Un comportement plus robuste chez Xenopus est la préférence pour la natation dans un réservoir avec un fond blanc, ce qui est décrit ici ^3. Lorsque vous placez un têtard dans un réservoir à moitié noir / moitié blanc, le têtard pré-métamorphique nage rapidement sur le côté blanc de la cuve. Nous avons déjà utilisé ce test pour déterminer si pluripotentes dérivé des cellulesyeux étaient fonctionnels ^4. Nous rapportons ici une version détaillée de ce test, qui peut être utilisé pour tester la fonction visuelle des têtards de Xenopus prémétamorphique.

Ce test est plus simple que le test de réponse optomoteur, car il ne nécessite un caméscope monté numérique, logiciel d'appareil photo numérique et un équipement standard dans la plupart des laboratoires de Xenopus. En outre, la réponse enregistrée ne nécessite aucune formation particulière aux résultats de pointage. Nos résultats représentatifs montrent que le même groupe de têtards, ayant subi deux axotomy rétinienne, nagent aléatoirement autour du réservoir. Nous avons également inclus les résultats d'analyse du comportement d'un têtard représentant, en montrant comment un oeil peut être testé pour la réponse visuelle. Une feuille de calcul a été inclus afin que les numéros acquises au cours de l'essai peuvent être insérés et analysés. Cette feuille peut être utilisée pour déterminer si les têtards testés ont une réponse visuelle.

Protocol

Protection des animaux

Le têtards de Xenopus laevis utilisées dans cette étude ont été cultivés, élevés et traités conformément aux procédures approuvées par Upstate Medical University IACUC et le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.

. 1 Configuration Pré-comportement: têtards

1. Obtenir des embryons de xénope fécondés provenant d'une source disponible dans le commerce ou in vitro féconder les ovocytes, comme décrit précédemment ^6.
2. Placez blastula des embryons de neurones de la scène de la plaque à 18 ˚ C en 60 mm boîtes de Pétri contenant 0,1 X MMR [10 modifié (ROR) solution mère de Ringer X Marc (10 mM MgCl _2, 20 mM de KCl, 20 mM de _CaCl2; HEPES 50 mM; NaCl 1 M; ajusté à pH 7,5, passé à l'autoclave à température ambiante et stockées)] avec 50 ug / ml de l'antibiotique gentamicine. Changez 0,1 X MMR chaque jour et éliminer les embryons morts.
3. Une fois les embryons atteignent Nieuwkoop et Faber stade ~ 27 au ³⁰ juillet, passer èmee embryons dans 0,1 X MMR sans antibiotique pour permettre la croissance bactérienne de l'intestin.
4. Cultiver les têtards jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade d'alimentation (étape 45) et déplacez-les dans des boîtes de Pétri de 100 mm remplis de 0,1 X MMR. Les nourrir ortie poudre surnageant chaque jour pendant une semaine, en changeant le 0,1 X MMR le jour intervenir.
5. Après une semaine dans le plat 100 mm Petri, déplacer les animaux de la moitié des réservoirs de gallons remplis d'eau de grenouille [0,5 g / L océan instantanée et 2 mM de phosphate de sodium dibasique (Na ₂ HPO _4: mw 141,96) pH 6,8]. Nourrissez-les comme dans l'étape 2.4, mais changer l'eau seulement 2-3 fois par semaine lorsque l'eau est trouble. Maintenir les animaux dans un cycle lumière obscurité de 12 h de lumière/12 avec les lumières allumer à 6 heures.
6. Placez le réservoir demi-gallon avec les sujets de test sur une surface blanche, comme un sous-tapis de paillasse, au moins 12 heures O / N, avant le test.
7. têtards d'essai aux stades 45 à 50 comme décrit dans l'étape 3 ci-dessous.

. 2 Configuration Pré-comportement: Equipment

1. Mettez de côté une zone de laboratoire pour l'analyse du comportement. Il devrait être dans un quartier calme à faible trafic avec l'éclairage fluorescent standard.
2. Préparer les bacs de test pour les animaux.
   Les bacs de test, un demi-gallon imbriqués sont composées de deux parties: un réservoir interne qui contiendra l'eau et têtards; et un réservoir externe avec le stimulus visuel.
   1. Pour le réservoir interne, faire une petite marque sur les coins extérieurs avec un feutre, 5 cm du fond; il s'agit de la ligne d'eau (figure 1A, la ligne pointillée verte).
   2. Aussi, pour le réservoir intérieur, remplir les divets dans le réservoir (dans les coins et au centre) avec un composé inerte, comme Sylgard élastomère. NOTE: Les têtards s'attarder dans ces domaines si elles ne sont pas remplis po
   3. Pour le réservoir externe, couvrir exactement la moitié de l'extérieur d'un réservoir avec du ruban électrique noir et l'autre moitié avec le tissu blanc papier Figure 1B.
3. Placez les réservoirs sur leinoculation platine.
4. Configuration de la webcam / trépied afin qu'il soit au-dessus des bacs de test. Régler la caméra pour permettre la visualisation de la zone d'essai, comme le montre la figure 1C.
5. Connectez la webcam à un ordinateur avec le logiciel QuickTime Player installé ^5. Allumez l'appareil photo. Dans QuickTime Player, sous Fichier, sélectionnez "Nouvel enregistrement de séquence. La configuration de test de comportement sera visible sur l'ordinateur tout de suite.
6. Drapé d'un chiffon de coton léger sur l'ensemble de la configuration pour réduire indices externes qui pourraient influer sur le comportement des têtards, ainsi que, de réduire la lumière réfléchie sur la surface de l'eau.
7. Veiller à ce que la luminance au titre des mesures de tissu entre 35-50 cd / m ^2.

3. Comportement Assay

1. Remplir le réservoir de test interne pour la marque de 5 cm d'eau fait dans l'étape 1.2.1 avec de l'eau de grenouille.
2. L'utilisation d'un petit filet, déplacez doucement l'animal dans le réservoir de test interne.
3. Ouvrir QuickTime logiciel sur ordinateur et, à l'aide du réservoir externe comme un guide, assurez-vous que l'appareil est en mesure de visualiser et d'enregistrer la zone de test.
4. Écrivez le nom de l'animal, la date et l'heure sur un morceau de papier et d'enregistrer avec la caméra.
5. Placez le réservoir de test dans le réservoir extérieur, le côté noir du réservoir vers la droite Figure 2.
6. Commencer à enregistrer le film immédiatement après l'organisation du réservoir et réglez la minuterie pendant 2 min.
7. Quand le minuteur sonne, retirer le réservoir de test interne, tourner le réservoir externe de 180 ° et placez le réservoir de test interne à l'intérieur du réservoir externe. Démarrer la minuterie. Remarque: le côté noir devrait maintenant être de l'autre côté.
8. Répétez l'étape 3.7, huit fois plus pour un total de dix essais. Utilisez la figure 2 comme un guide, en cochant chaque essai.
9. Répétez le test de comportement sur deux jours différents.

4. Rétinienne axotomie

1. Placez l'animal dans 0,02% tricaine jusqu'à ce qu'ils ne répondent pasà une pincée de queue avec un # 3 forceps.
2. Faire fondre 1% d'agarose dans 0,1 X MMR puis ajouter à une boîte de Pétri de 60 mm. Une fois refroidie, une petite motte de terre rectangulaire dans l'agarose et ajouter le têtard de la motte de terre avec un peu de tricaïne 0,02%, de sorte que l'animal est partiellement immergé dans le liquide.
3. Pierce la peau à un angle de 45 degrés derrière la région dorsale de l'oeil avec une aiguille 25 G, tout en s'agrippant de l'animal contre la pince sur le côté opposé.
4. Prendre soin de ne pas couper la veine, qui se trouve à côté du nerf optique, atteindre soigneusement dans le trou avec # 5 pinces, couper le nerf optique et le retourner à l'écart. Si il ya une hémorragie sévère en raison de la biopsie accidentellement l'artère, puis placer rapidement l'animal dans 2% tricaïne à euthanasier. ATTENTION: solution de tricaine 2% peut provoquer un engourdissement dans les humains. Cette solution doit être manipulé avec des gants.
5. Pour récupérer l'animal après la chirurgie, placer l'animal dans 100 mm boîte de Petri avec 0.7X ROR et 50 pg / ml de gentamicine pendant 20 min. Next, transfert têtard à la cuve de récupération d'eau de grenouille. Laisser reposer animale O / N.
6. Le lendemain matin, tester la fonction visuelle comme décrit ci-dessus (étapes 3.1 à 3.9).

5. Analyser les résultats

1. Après les essais sont terminés, mesurer la quantité de temps le têtard reste sur le côté noir de la cuve.
   1. Voir manuellement les vidéos en utilisant un logiciel qui affiche l'heure et permet des pauses fréquentes. Regardez le temps d'affichage de la vidéo. Notez le début du procès de deux minutes, ce qui est quand le réservoir interne niche avec succès à l'intérieur du réservoir externe et est carré en vue de la caméra.
   2. Utilisez la position des yeux du têtard à définir de quel côté de la cuve les animaux nagent sur. Définir la traversée d'un côté de la cuve à l'autre que lorsque les deux yeux ont franchi la ligne noir / blanc.
2. Notez le début et la fin de chaque intervalle (en secondes) que l'animal passe sur le côté noir. Faites une pause et reenrouler la vidéo pour assurer l'exactitude. Additionner le sec dans chaque essai.
3. Entrée ces nombres dans la feuille de calcul du comportement joint. La feuille de calcul calcule le rapport entre le temps que l'animal a passé sur le côté blanc en soustrayant le temps passé sur le côté noir de la cuve de l'essai sec 120 au total et le diviser par le temps total en secondes [(120 - nombre total de secondes consacrées à le côté noir) / 120 sec]. Les moyennes de feuille de calcul de ce ratio sur l'ensemble des 10 essais.
4. Utilisez le T-test de Student, jumelé, distribution bilatérale afin de déterminer si les essais entre les jours sont significatives (P ≤ 0,05).

Results

Les rapports précédents ont montré que les têtards de Xenopus prémétamorphique préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir noir / blanc et a appelé cet essai, l'arrière-plan de couleur préférée de dosage ³ Nous avons changé ce test afin de tester la fonction visuelle des deux yeux de têtards dans moins d'une semaine. De cette manière, les yeux peuvent être collectées pour un examen histologique.

Nous montrons ici comment la réponse est due à des indices visuels. Dans...

Discussion

Nous rapportons ici un test de comportement guidé par la vision simple qui peut être facilement réalisée en moins d'une semaine par le personnel de laboratoire une formation minimale. Alors que d'autres tests nécessitent un équipement spécialisé et de l'expertise en comportement animal, ce test permet un test rapide pour déterminer la fonction visuelle. Un autre essai de comportement, le test d'évitement visuel, a été développé pour déterminer comment le tectum contribue à la perception visuelle chez

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 gallon Flex-Tank avec couvercle	eNasco	SB19271M	Taille : 5-3/8 » x 7 » x 3-3/4
Ruban
Papier
Grand plateau tournant d’inoculation	VWR	50809-022	Taille : Dia 114.3 x  ; H 76,2 mm (4 1/2 x 3 »)
Sous-matelas Durasorb	VWR	82004-836	Taille : 43,2 x 60,1 cm (17 x 24 »)
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
Trépied		Divers
appareils photo ou webcam iSight	Apple	M8817LL/A	Bon pour les plus gros têtards mais les petits sont difficiles à voir
Ordinateur portable	Apple/PC	Divers	Nous avons utilisé un MacBook 13", Intel Core 2 Duo 2 GHz fonctionnant sous MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV caméscope handycam	SONY	DCR-HC42	Connecté par FireWire à l’ordinateur à l’aide d’un câble alpha FireWire 400 à 6 conducteurs et 4 conducteurs.
Station Handycam	SONY	DCRA-C121	Peut être utilisé pour connecter le fil de feu à la caméra
Logiciel QuickTime Player	Quicktime	Version 10.1
26 G Aiguille (longueur 5/8") VWR		BD305115
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Consommables
Sulfate de gentamicine [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	Stocké à
RT Sylgard 184 Élastomère de silicone	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	Solution mère = 100 g/L stocké à RT
Phosphate de sodium dibasique	Sigma Aldrich	S0876	Solution mère = 0,4 M stocké à RT
In vitro embryons fécondés	eNasco	LM00490MX	100 embryons/unité