Marqueur de surface cellulaire Purification médiation de iPS intermédiaires cellulaires à partir d'un modèle reprogrammable souris

Résumé

Le fibroblaste embryonnaire de souris peut être reprogrammé en cellules souches pluripotentes induites à faible efficacité par l’expression forcée des facteurs de transcription Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. Les rares intermédiaires de la réaction de reprogrammation sont isolés par FACS par marquage avec des anticorps contre les fabricants de surface cellulaire Thy-1.2, Ssea-1 et Epcam.

Résumé

Les cellules matures peuvent être reprogrammées à un état pluripotent. Ces cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont capables de donner naissance à tous les types de cellules du corps et ont donc un vaste potentiel pour les applications de la médecine régénérative. Traditionnellement, les cellules iPS sont générées par l’introduction virale des facteurs de transcription Oct-4, Klf-4, Sox-2 et c-Myc (OKSM) dans les fibroblastes. Cependant, la reprogrammation est un processus inefficace avec seulement 0,1 à 1 % des cellules revenant à un état pluripotent, ce qui rend difficile l’étude du mécanisme de reprogrammation. Une méthodologie éprouvée qui a permis d’étudier le processus de reprogrammation consiste à séparer les rares intermédiaires de la réaction de la population réfractaire. Dans le cas des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), nous avons déjà montré que les cellules de reprogrammation subissent une série distincte de changements dans le profil d’expression des marqueurs de surface cellulaire qui peuvent être utilisés pour la séparation de ces cellules. Au cours des premiers stades de l’expression d’OKSM : les cellules reprogrammant avec succès perdent le marqueur d’identité des fibroblastes Thy-1.2 et régulent à la hausse le marqueur associé à la pluripotence Ssea-1. La transition finale d’un sous-ensemble de cellules positives à Ssea-1 vers l’état pluripotent est marquée par l’expression d’Epcam au cours des dernières étapes de la reprogrammation. Nous fournissons ici une description détaillée de la méthodologie utilisée pour isoler les intermédiaires de reprogrammation des cultures de MEF de reprogrammation. Afin d’augmenter la reproductibilité expérimentale, nous utilisons une souche de souris reprogrammable qui a été conçue pour exprimer un transactivateur transcriptionnel (m2rtTA) sous le contrôle du locus Rosa26 et OKSM sous le contrôle d’un promoteur sensible à la doxycycline. Les cellules isolées de ces souris sont isogéniques et expriment l’OKSM de manière homogène lors de l’ajout de doxycycline. Nous décrivons en détail l’établissement des souris reprogrammables, la dérivation des MEF et l’isolement ultérieur des intermédiaires lors de la reprogrammation dans les cellules iPS via le tri des cellules activées par fluorescence (FACS).

Introduction

Des cellules souches embryonnaires (ES) sont dérivées à partir de la masse cellulaire interne d'embryons au stade de blastocyste ^1. Dans des conditions de culture appropriées, ils s'auto-renouveler et restent pluripotentes. En 2006 Yamanaka et ses collègues ont démontré que les cellules matures peuvent être reprogrammées en dite souches pluripotentes induites cellules (iPS) par l'expression forcée de facteurs de transcription Oct-4, Klf-4, Sox-2, c-Myc (OKSM) ^2. cellules iPS, comme les cellules ES, peuvent donner lieu à tous les types de cellules du corps, cependant, ils sont libres des contraintes éthiques liées à la génération de cellules ES ^3. En outre, les cellules iPS portent la promesse de la médecine régénérative personnalisée et un potentiel énorme pour les applications telles que la modélisation de la maladie et dans la drogue vitro de dépistage ^4,5. Pour reprogrammer la technologie pour réaliser ce potentiel, le mécanisme de base de reprogrammation nucléaire doit être pleinement compris. Cependant, les efforts de disséquer la pat de reprogrammationHway ont été entravés par le fait que seul un très petit nombre de cellules reprogrammer (0,1-1%). Fibroblastes reprogrammation succès ont été rapportés à subir une série distincte d'événements, dont un mésenchymateuses de la transition épithéliale ^6-10 et, dans les dernières étapes de la reprogrammation, l'activation du réseau de la pluripotence de base endogène ^11-14. Nous et d'autres ^12,13,15-17 avons récemment identifié une série de marqueurs de surface cellulaire qui permet la séparation de produits intermédiaires à partir de la population de rares masse réfractaire. Reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) subissent des changements dans l'expression de Thy-1.2, SSEA1 et EpCam (entre autres) au cours du processus de reprogrammation ¹⁵ 2-semaine. Tôt au cours reprogrammation d'un sous-ensemble de MEF réguler à la baisse l'expression d'un marqueur de l'identité des fibroblastes (Thy-1.2) et commencez à exprimer le marqueur de pluripotence associée AESS-1 ^12. Au cours des dernières étapes de la reprogrammation des cellules SSEA1 positifs reACTIVmangé gènes de pluripotence endogènes comme Oct-4 ^10-13,15. Cette dernière transition est marqué sur la surface de la cellule par l'expression détectable de EpCAM (voir la figure 1) ou dans une étape ultérieure Pecam ^15. Récemment, O'Malley et al. Rapporté l'utilisation de CD44 et ICAM1 comme des alternatives ou complémentaires à Thy-1.2 et l'AESS-1 pour l'identification des intermédiaires de reprogrammation. Nous avons déjà FACS extrait intermédiaires de reprogrammation de jours 0, 3, Jour 6, cultures Jour 9 Jour 12 et reprogrammation, ainsi que de lignées cellulaires iPS établies sur la base de ces marqueurs de surface cellulaire ^15,18. Pour que le système et les conditions de reprogrammation décrit ci-dessous, nous avons montré au niveau de la cellule unique, bien que les populations sont calmes homogène, il ya un certain degré d'hétérogénéité dans les populations intermédiaires identifiés. Il convient de noter que seul un sous-ensemble de cellules au sein de ces populations sont en mesure de passer à la prochaine sta respectivege du processus de reprogrammation et de donner naissance à des colonies de cellules iPS à des rendements différents, qui ont été largement caractérisées auparavant ^15,19. En outre, l'efficacité de la reprogrammation de ces populations dépend aussi bien sur les conditions re-placage et de la culture. Pour augmenter la reproductibilité expérimentale on utilise une souche de souris reprogrammable qui a été conçu pour exprimer un transactivateur transcriptionnel (m2rtTA) sous le contrôle du locus Rosa26 et une cassette d'OKSM polycistronique sous le contrôle d'un promoteur sensible à la doxycycline ^20,21. L'utilisation de ce modèle de souris évite les effets secondaires indésirables des procédés traditionnels de production virale des cellules iPS, à savoir, une population hétérogène de départ de cellule à cellule dans la variabilité du nombre et de l'emplacement des sites d'intégration des inserts viraux. Deux souches de souris transgéniques (OKSM, m2rtTA), disponibles comme animaux homozygotes fondateurs du Laboratoire Jackson, doivent être franchi en vue d'établir la reprogramodèle de souris mmable (voir Figure 2). Dans ce manuscrit, nous décrivons en détail comment obtenir MEF, générer des cellules iPS, et isoler les intermédiaires de reprogrammation à différents stades du processus de conversion par FACS.

Protocole

1 Instrument Settings / Préparation des réactifs / Génotypage

1. Préparer le milieu de cellules iPS: Supplément de 500 ml Knockout milieu DMEM avec du sérum 75 ml fœtal bovin (FBS), 5 ml de L-glutamine, 5 ml acides aminés non essentiels, 500 pi β-mercaptoéthanol, 5 x 10 ⁵ unités leucémie facteur inhibiteur ( FRV). S'il vous plaît se référer à la liste des matériaux pour le produit et les informations d'achat pour les réactifs utilisés dans le cadre de ce manuscrit.
2. Préparer le milieu MEF: Supplément de 500 ml du milieu DMEM avec 50 ml de FBS, 5 ml de L-glutamine, 5 ml acides aminés non essentiels, 5 ml de pyruvate de sodium, 500 pi β-mercaptoéthanol.
3. Préparer le milieu de congélation: Pour 10 ml, mélanger 9 ml de FBS avec 1 ml de DMSO.
4. Préparer la gélatine enduite plats Ajouter une solution de gélatine porcine 5.3 ml à 0,1% pour un flacon T75, incuber à température ambiante pendant au moins 10 min et aspirer juste avant utilisation.
5. Préparer milieu de marquage FACS: Pour 10 ml, mélanger 9,9 ml de PBS avec 0,1 ml de FBS.
6. Effectuerun génotypage par PCR pour le locus Rosa26 m2rtTA: Effectuer des réactions avec l'ADN polymérase Taq selon les instructions du fabricant. Utilisez une modification de _MgCl2 -concentration de 3,5 mM et les trois amorces suivantes: oIMR8052: 5 'GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC 3', oIMR8545: 5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 ', oIMR8546: 5' GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG 3 '. Les conditions de cyclage: 94 ° C pendant 3 min; 35 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 65 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 1 min); 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 12 ° C. La taille du produit attendu: 650 pb pour l'allèle sauvage et 340 pb pour l'allèle mutant.
7. Effectuez une PCR génotypage du locus collagène StemCa / OKSM: Effectuer des réactions avec l'ADN polymérase Taq selon les instructions. Utilisez une modification de _MgCl2 -concentration de 2,5 mM et les trois amorces suivantes: col / frt-B: 5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3', col / frtA1: 5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3', col / frtC1: 5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '. Les conditions de cyclage: 95 ° C pendant 1 min: 2 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 70 ° C pendant 45 s), 6 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 68 ° C pendant 45 s) et 30 cycles de (94 ° C pendant 20 s, 60 ° C pendant 1 min); 72 ° C pendant 5 min; maintenir à 12 ° C. La taille du produit attendu: 331 pb pour l'allèle sauvage et 551 pb pour l'allèle mutant.
8. Effectuer toutes les étapes de centrifugation à 400 g pendant 3 min à 4 ° C.

2. génération de fibroblastes embryonnaires de souris

1. Effectuer un calage entre l'accouplement d'un animal de la souche OKSM avec un membre du sexe opposé de la souche m2rtTA. Embryons de récolte au jour embryonnaire 13,5 par l'abattage de la mère et de retirer la corne utérine. Avant l'enlèvement de la corne utérine, de pulvérisation de la région abdominale avec une solution d'éthanol à 80%, pour éviter une contamination microbienne.
2. Transférer la corne de l'utérus dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm contenant 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Utilisez des ciseaux de qualité chirurgicale stérilisés pour couper la corne utérine en morceaux contenant un embryon (voir la figure 3A, B).
3. Utiliser un microscope de dissection (idéalement placé au sein d'une culture capot de tissus) et des pinces stérilisées à retirer soigneusement l'enveloppe de l'utérus et les membranes extra-embryonnaires entourant chaque embryon. Transférer chaque embryon à une boîte de 10 cm séparée avec 10 ml de PBS.
4. Procédez en supprimant la tête de l'embryon, les membres, la queue et les organes internes (coeur, foie, intestin etc) avec la pince (voir la figure 3C). Transférer la tête de l'embryon dans un tube de 1,5 ml et congeler le bas de sorte qu'il peut être utilisé pour le génotypage si nécessaire.
5. Transférer le torse de l'embryon dans un 10cm assiette vide et utiliser deux lames chirurgicales pour hacher l'embryon pendant 2 min. Ajouter 200 ul de solution de trypsine / EDTA au-dessus de l'embryon hachées et incuber pendant 3-5 min à température ambiante. Continuer hachage pour 2 min, ajouter 2 ml de milieu MEF à l' activer la trypsine, puis les transférer dans un tube de 15 ml.
6. Utiliser une pipette de 1000 pi de dissocier davantage mécaniquement le tissu léger pipetage. Transfert à une gélatine recouvert de 10 cm et d'ajouter un montant supplémentaire de 10 ml de milieu MEF. Remarque: Les deux incubateurs normoxiques et hypoxiques peuvent être utilisés pour la culture, se réfèrent à la discussion pour plus d'informations.
7. Après 24-48 heures, la plaque doit être densément couvert MEF.
8. Alternativement, les cellules peuvent ensuite être propagées ou congelées. Pour la congélation de cellules, retirez le support de culture, rincer le plat avec 10 ml de PBS pour éliminer les traces de médias et de superposition avec 3 ml de trypsine solution / EDTA. Incuber pendant 3 à 5 min à 37 ° C, l'inactivation de la trypsine digestion en ajoutant 5 ml de milieu et de transfert MEF à un tube de 15 ml de centrifugation. Isoler et remettre en suspension le culot dans 3 ml de gel médias. Transfert à 3 cryotubes et congeler dans un récipient de congélation de cellules.

3. reprogrammation de MEF

ove_content "> NOTE: cellules pellets par centrifugation à 200 g pendant 5 min à 4 ° C et utiliser normoxiques incubateurs de culture de tissus pour la reprogrammation Il peut être bénéfique de tirer et d'élargir MEF dans des conditions hypoxiques (5% d'oxygène, voir la discussion pour plus d'informations. ).

1. Décongeler rapidement un cryovial faible passage (P0-P1, 2-3 cellules Mio) dans un bain d'eau (37 ° C) et transférer le contenu dans un tube de 10 ml de milieu MEF préchauffées. Cellules à granules, remettre en suspension dans les médias MEF 12 ml fraîches, transférer dans un récipient de culture T75 de gélatine appliquée, et permettent aux cellules de récupérer pendant 24-48 heures avant de continuer. Remarque: MEF peuvent également être utilisées directement après dérivation.
2. Après l'élimination du milieu de culture, le lavage avec du PBS et les MEF cellularize par superposition avec une solution de trypsine / EDTA (3 ml de 3-5 min à 37 ° C). Étancher la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu MEF et dissocier en outre des cellules par un mélange doux avec une pipette de 10 ml. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre.
3. Pour reprograexpériences mming, MEF de semences SUR DES gélatine enduit flacons T75 à des densités de 6,7 x 10 ³ cellules / cm ² (~ 0,5 Mio cellules par flacon) dans les médias iPSC contenant 2 pg / ml de doxycycline. Reportez-vous au tableau 1 concernant les recommandations de semis pour obtenir environ 2 Mio intermédiaires de reprogrammation pour chaque point de temps. Remarque: La reprogrammation commence avec l'addition de doxycycline (2 pg / ml) additionné médias
4. Pour les 6 premiers jours remplacent les médias tous les jours avec de la doxycycline frais complété médias iPSC (12 ml de milieu par flacon T75). Au-delà de ce point renouveler multimédia sur une base quotidienne s'il existe un grand nombre de cellules. Doubler le volume de la culture si les changements de supports ne peuvent être effectuées tous les deux jours.
5. Intermédiaires de récolte de reprogrammation aux points de temps requis (suggestion: Jours 3, 6, 9, 12) en supprimant les médias, le rinçage avec un volume approprié de PBS (10 ml pour un flacon T75) et recouvrant avec une solution de trypsine-EDTA (3 ml pour un flacon T75). Incuberpour 3-5 min à 37 ° C et éteindre en ajoutant 5 ml d'iPSC médias suivis par pipetage doux.
6. Comptez suspension de cellules avec un hémocytomètre (voir ci-dessus), culot par centrifugation, aspirer les cellules surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de PBS pour éliminer toute trace de la trypsine. Pellet les cellules une fois de plus, aspirer le surnageant et passez à l'étape 4.1 pour isoler les intermédiaires de reprogrammation. Remarque: Les cellules subissant reprogrammation peuvent être cryoconservés et décongelés pour FACS isolement à un stade ultérieur.
7. Pour établir iPS cultures entièrement reprogrammées, cultiver des cellules en libre-dox iPSC médias pour une période de 4-7 jours. Remarque: les cultures de reprogrammation succès contiennent un grand nombre de colonies par jour 12 (voir Figure 4). Pendant ce temps, les cellules iPS aberrantes qui nécessitent encore l'expression OKSM disparaîtront.
8. Sinon, pour propager les autres entièrement reprogrammées iPS cultures: d'abord, les semences MEF irradiés à une densité de 15 x 10 ³ cellules / cm ² dans 12 ml d'iPSC support sur un enduit de gélatine T75 ballon d'un jour ou 6 heures avant les expériences.
9. Ensuite, cellularize cultures de cellules iPS en supprimant les médias, le rinçage du flacon T75 avec 10 ml de PBS, la superposition avec 3 ml de solution de trypsine-EDTA et incubation pendant 3 à 5 min à 37 ° C. Étancher la trypsine en ajoutant 5 ml de milieu iPSC suivis par un mélange doux, transférer dans un tube conique de 15 ml, centrifuger, puis remis en suspension dans 10 ml iPS médias.
10. Transférer 500 ul de cette suspension cellulaire sur les FAE irradiés (flacon T75) et de permettre aux cultures de se développer pendant 4-5 jours. Remarque: iPS établies cultures peuvent être cryoconservés ou utilisés pour des expériences. Les lignées cellulaires clonales sont obtenues par prélèvement de colonies individuelles iPSC sous un microscope de dissection ^22.
11. Cryo préserver les cultures confluentes iPSC comme décrit à la section 2.8 pour MEF.

4. Anticorps étiquetage

1. Remettre en suspension les culots de cellules de cultures de reprogrammation, tels que préparés à la section 3, dansFACS support d'étiquetage complété avec des anticorps (anti-Thy-1.2 Pacific Blue 1: 400, anti-SSEA-1 biotine 1: 400 et anti-EpCam Fitc 1: 400). Utilisez 200 pi de mélange complété d'étiquetage par 5 millions de cellules et incuber sur de la glace.
2. Après 10 min tapotez doucement le tube pour remettre en suspension les cellules et incuber pendant 10 minutes de plus sur la glace. Ajouter 10 ml de PBS froid par tube et centrifuger.
3. Pour chaque tube à teindre préparer 200 pi de support d'étiquetage complété avec 1 pi de streptavidine PeCy7 (1: 200) par 5 millions de cellules. Lorsque les cellules ont granulés, aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension dans un volume approprié de support d'étiquetage complétées par streptavidine-PeCy7.
4. Gardez cellules sur de la glace pendant 10 minutes, appuyez sur pour remettre en suspension, incuber pendant 10 minutes sur la glace, ajouter 10 ml de PBS froid par tube, un spin et aspirer le surnageant.
5. Remettre en suspension les culots cellulaires dans des milieux complétés de marquage l'iodure de propidium (PI) (2 pg / ml) à environ 1 x 10 ⁷ cellules / ml. Retirer amas de cellules en faisant passer la suspension à travers un tamis de 70 um. Transférer les cellules dans un tube FACS appropriée et de les garder sur la glace.
6. Préparer les échantillons séparés avec les différents anticorps (anti-Thy-1.2, anti-SSEA-1 et anti-EpCam). NOTE: Ce sont nécessaires pour effectuer une compensation de la couleur dans les trois canaux utilisés dans l'analyse. En outre, les cellules non marquées sont nécessaires pour établir des tensions et des portes pour le tri. Idéalement cellules iPS sont utilisés pour la compensation: les stocks de 0,5-1 x 10 ⁶ cellules iPS entretenus sur MEF irradiés sont stockés dans des cryotubes dans l'azote liquide. La présence de MEF est essentiel pour obtenir un signal dans le canal Thy-1.2.
7. Décongeler un tube cryogénique des cellules iPS comme décrit pour les FAE (section 3). Après la centrifugation, remettre les cellules dans 800 ul de tampon de marquage et 200 ul de cet échantillon est mis de côté en tant que témoin non marqué.
8. Utilisez les cellules restantes en tant que témoins de rémunération. cellules Diviser entre trois tubes de 15 ml et ajouter anticorpscomme suit: Pacific Blue commande de compensation: ajouter 0,5 pi de l'anticorps anti-Thy-1.2 Pacific Blue. Tube de compensation Fitc: ajouter 0,5 pi de l'anticorps anti-EpCAM-FITC. Pe-Cy7 commande de compensation: 0,5 pi de l'anticorps anti AESS-1-biotine.
9. Conserver les échantillons de cellules-anticorps sur la glace pendant 10 min, mélanger en tapotant et incuber pendant 10 min sur la glace.
10. Échantillons lavage avec 10 ml de PBS froid pour éliminer les anticorps non liés, tournent cellules vers le bas et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les culots cellulaires dans 200 pl de substrat d'étiquetage FACS.
11. Pour les anti-SSEA-1-biotine échantillons marqués, ajouter un conjugué streptavidine-PeCy7 (1 pi par 200 pi de cellules). cellules d'étiquetage tels que décrits pour l'anticorps primaire (AESS-1-biotine).
12. Faire passer tous les échantillons y compris le contrôle non marqué à travers un tamis de 70 um et ajouter PI (2 pg / ml). Transférer les cellules dans des tubes FACS et garder sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.

5 FACS isolement d'intermédiaires

Remarque:Les cellules sont triées à l'aide d'une fluorescence Activé Cell Sorter avec 405 nm, 488 nm et 560 nm lasers d'excitation et une buse de 100 um.

1. Mettre en place des tensions de diffusion vers l'avant et sur le côté de sorte que la population de cellules est visualisée correctement. Dessiner une grille autour des cellules, comme indiqué sur la figure 5A pour exclure les débris. Remarque: La bonne mise en place de tensions sur le trieur de cellules peut être complexe et nécessite un opérateur expérimenté FACS.
2. Utilisez diffusion vers l'avant (FSC) de hauteur par rapport à la zone CFA d'exclure agrégats (Figure 5B).
3. Visualisez la chaîne de PI en fonction de FSC à porte dans les PI cellules vivantes négatifs (figure 5C).
4. Utilisez les cellules non marquées pour régler les tensions pour les canaux de fluorescence de PB, Fitc / GFP, Pe-Cy7. Idéalement positionner la population de cellules à l'extrémité inférieure du canal respectif.
5. Set portes avec des cellules témoins non marqués comme le montre la figure 6A, B à la sous-fraction de culte de reprogrammationures en jour 3, 6 et 9 populations: l'AESS-1-/ Thy-1.2 + cellules; AESS-1 / Thy-1.2- cellules; et la reprogrammation d'intermédiaire pour l'AESS-1 + / Thy-1.2- cellules.
6. Subdiviser la Journée 9 AESS-1 + / Thy-1.2-fraction en utilisant le Pe-Cy7 contre Fitc blot; établir des barrières autour du Sse-a1 + / EpCam + cellules et les cellules de l'AESS-1 + / Epcam-. Set portes avec des cellules témoins non marqués comme le montre la figure 6C, D.
7. Pré-remplir des tubes de collecte appropriés avec les médias de cellules iPS (1-2 ml) avant de trier les sous-populations souhaitées (voir Figure 7 pour les profils FACS représentatifs des MEF, Jour 3 / Jour 6 / Jour 9 / Jour 12 cultures et des cellules iPS).
8. Effectuer FACS tri selon fabrique protocole.
9. Après FACS isolement soumettre les cellules à un profilage moléculaire (ARN / extraction de protéines, immunoprécipitation de la chromatine, l'ADN méthylome analyse etc). En variante, les différentes fractions cellulaires peuvent être mises en culture.

Résultats

Après la dissection, la désagrégation et le placage d'un embryon de souris E13.5, on prévoit une boîte de 10 cm à atteindre la confluence dans environ 1 à 2 jours. A ce stade, il est normal que la culture contient de quelques pièces de tissu adhérentes qui n'ont pas été correctement cellularisées. Celles-ci disparaissent après repiquage.

Lors de l'induction de la doxycycline, les MEF reprogrammation subissent des changements morphologiques distincts. Autour jour 6, les premières plaques de colonies comme devraient commencer à apparaître (figure 4C). Ceux-ci vont continuer à croître en taille à autre culture (voir la figure 4D, E). Une bonne expérience de reprogrammation devrait aboutir à> 500 colonies par T75 qui a été initialement ensemencé avec 5 x 10 ⁵ cellules (figure 4E). Cultures iPS établies possèdent caractéristiques dôme en forme de colonies et doivent surtout être dépourvu de cellules différenciées (figure 4F). De temps en temps, des passages supplémentaires de iPS cultures peuvent être nécessaires pour éliminer les cellules indifférenciées / partiellement reprogrammées; un ballon confluente de cellules peut être divisée en un rapport de 01:10 sur une couche nourricière de MEF irradiés.

Comme mentionné ci-dessus, les changements morphologiques et moléculaires au cours de reprogrammation se traduisent par des changements dans les profils FACS pour Thy-1.2, l'AESS-1 et, finalement, EpCam (voir la figure 7A-F). Comme indiqué précédemment ^12,15, tandis que MEF sont majoritairement positives pour Thy-1.2 et négatif pour les autres marqueurs, Jour 3 cultures ont déjà l'air très différent. Une grande proportion de cellules ont commencé à réguler à la baisse l'expression de Thy-1.2 et un très petit sous-ensemble de ces Thy-1.2 cellules négatifs sont devenus positifs pour l'AESS-1, la reprogrammation réelle intermédiaire de ce point de temps. Le nombre d'intermédiaires de reprogrammation qui peuvent être extraites de la Journée 3 cultures est très imprévisible que le pourcentage de l'AESS-1 + / Thy-1.2-se trouve généralement dans une fourchette comprise entre 1-10% de viablcellules de e. Sur Jours 6 et 9 une augmentation du pourcentage de cellules AESS-1 +, bien au dessus de 10%, peut être détectée. Autour jour 12 un sous-ensemble de l'AESS-1 cellules positives peut être détectée que étiqueter également positifs pour EpCam. Jour 12 cultures, comme Jour 3 cultures, représente un goulot d'étranglement dans la purification des intermédiaires, comme le pourcentage de l'AESS-1.2 + / EpCam + cellules est variable et se situe dans la gamme de seulement 2-4% de toutes les cellules vivantes en général. Le nombre attendu de reprogrammation des intermédiaires présentés dans le tableau 1 sert uniquement une approximation grossière. Cultures cellulaires établies de bonne foi iPS seront fortement positive pour l'AESS-1 et EpCam.

Figure 1: Surface des changements de position au cours de la voie de reprogrammation: régulation à la baisse de l'identité des fibroblastes marqueur Thy-1.2 est suivi par une régulation deAESS-1. L'transition d'un sous-ensemble de l'AESS 1-cellules positives vers un état ​​pluripotent est indiqué par l'acquisition de EpCam autour du jour 12. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Représentation schématique du modèle de souris reprogrammable. Expression m2rtTA est sous le contrôle du locus Rosa26 ubiquitaire actif en présence de doxycycline (dox), la protéine m2rtTA se lie à un promoteur dépendant de tétracycline (tetOP) au collagène 1A1 (COL1A1) locus résultant dans l'expression de la cassette à quatre facteurs. Deux cassettes bicistroniques sont liés par un site d'entrée interne des ribosomes (IRES). Cadres de lecture ouverts pour Oct-4 / Klf-4 et Sox-2 / c-Myc sont fu sed par F2A et E2A séquences d'auto-clivage, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 embryons dissection: (A) transfert corne utérine dans un plat de 10 cm rempli de 10 ml de PBS et (B) coupé en morceaux contenant un embryon. (C) En utilisant des pinces libèrent les embryons à partir de tissu extra-embryonnaire et supprimer tête, les membres, la queue et les organes internes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Patchs Figure 4 changements morphologiques au cours de reprogrammation. Colonies comme apparaissent dans les cultures du jour 6 partir. CSPi de bonne foi sont caractérisées par une morphologie en forme de dôme. (A) Jour 0 / MEF, (B) Jour 3, (C) Jour 6, (D) Jour 9, (E) Jour 12, (F) iPS culture cellulaire. Barre d'échelle:. 200 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 de configuration de base FACS. (A) Exclure les débris avec Side Scatter contre Forward Scatter zone blot. (B)Exclure les agrégats de débris non par le fenêtrage seule population cellulaire avec Forward Scatter zone contre Forward Scatter Haute blot. (C) Exclure les cellules mortes de la population d'une seule cellule par le fenêtrage PI faibles des événements avec le canal de PI contre Forward Scatter zone blot. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6 gate. (A, B) En utilisant les cellules de contrôle non étiquetés mis en place portes pour Thy-1.2 + / AESS-1-cellules, Tes 1.2--/ AESS-1-cellules et Thy-1.2-/ AESS-1 + cellules. (C) Utilisez les cellules témoins non marqués pour définir portes des cellules positifs et négatifs EpCam EpCam. (D) AESS-1 + / Tes-1.2- cellules peuvent être séparéesdans un EpCam positive et dans une population EpCam négatif. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7 Thy-1.2 par rapport à l'AESS-1 FACS taches à différents stades du processus de reprogrammation. (A) Jour 0 / MEF, (B) Jour 3, (C) Jour 6, (D) Jour 9, (E) Jour 12, la culture cellulaire (F) iPS.

Tableau 1 suggérés densité semis, le nombre de ballon et les résultats escomptés pour P1 MEF d'un embryon hétérozygote pour OKSM et m2rtTA. S'il vous plaît cliquer havant de voir une version plus grande de cette figure.

Jour	Nombre de flacons T75 ensemencées au jour 0	Nombre total de cellules SSEA1 + après FACS	Nombre total de SSEA1 + / EpCam + cellules après FACS
3	8	2 millions de
6	4	2 millions de
9	4	2 millions de
12	10	10 millions	2 millions de

Discussion

Pour reprogrammer avec succès MEF en cellules iPS et de purifier les intermédiaires de reprogrammation à grande quantité, il est essentiel d'être conscient des facteurs qui ont un impact sur l'efficacité globale. En particulier, le lot de FBS utilisée pour compléter médias iPS peuvent avoir un effet néfaste. Dans des expériences positives générales ont été faites avec des souches embryonnaires (ES) cellules FBS qualifiés, mais le contrôle par lot de sérums à partir d'une variété de fournisseurs pourrait identifier une alternative moins chère.

Un autre facteur qui influe sur l'efficacité de la reprogrammation est le génotype de ^15,20 MEF. Bien MEF provenant de souris hétérozygotes (het) à la fois pour la OKSM et le lieu m2rtTA ne reprogrammer, homozygousity à un ou deux résultats loci dans de meilleurs rendements de reprogrammation. En effet, MEF issus de la progéniture de OKSM et m2rtTA croix montrent une augmentation de l'efficacité de la reprogrammation dans l'ordre suivant (OKSM / m2rtTA): het / het le tableau 1 pour les animaux het / het). A l'occasion rare d'un homme homo / homo animal est identifié, un harem à s'accoupler avec plusieurs femelles m2rtTA peut être mis en place. Toute la progéniture de ces croisements sera Het / homo pour la OKSM / m2rtTA loci, respectivement. En outre, le génotypage rapide des portées est recommandé que des portées plus importantes sont obtenues lors de l'utilisation pour la reproduction des souris jeunes (6-15 semaines d'âge).

De plus, l'utilisation de MEF de passage faible pour la reprogrammation est souligné ^23. Si MEF ont été obtenues et développées dans un normoxique incubateur de culture de tissu, nous vous recommandons fortement d'utiliser uniquement ces cellules à passage 2 Toutefois, si l'expérimentateur a accès à un incubateur faible teneur en oxygène (5% d'oxygène) pour le calcul et l'expansion de la FAE, numéros de passage aussi élevées que 3 sera toujours donner de bons résultats ^23.

Dans le cas où l'expérimentateur rencontre des problèmes liés à la reprogrammation, comme il est indiqué, les explications les plus probables sont des nombres élevés de passage au moment de l'addition de dox, le génotype des souris incorrect ou l'utilisation de FBS qui n'est pas propice pour la production de cellules iPS. Cependant, dans de rares cas, nous avons observé que les MEF ne sont pas en mesure de reprogrammer même dans des conditions idéales. Dans ces cas, une deletion spontanée de novo au sein de cadre de lecture ouvert de la m2rtTA a été identifié comme la cause sous-jacente.

Cette méthodologie a été adaptée avec succès pour extraire l'AESS-1 + intermédiaires via l'isolement cellulaire magnétique (MACS). Il ya un avantage de temps évident à recourir MACS, cependant, la pureté des AESS-1 + populations de cellules est réduit à 80-90%, plutôt que plus de 95%, ce qui selon le type d'expérience, les cellules sont destinées à risque de poser un problème. Ainsi, une option est d'utiliser MACS pour enrichir l'AESS-1 + cellules suivie par FACS pour augmenter la pureté et / ou fraction-les dans l'AESS-1 + / + et EpCam AESS-1 cellules + / Epcam-.

"> Alors que les cellules iPS produits par le protocole décrit et le modèle de la souris a été démontré que d'être pluripotentes et contribuer efficacement à tous les tissus des animaux chimériques ^15,20, une réduction de la capacité à produire des embryons entièrement composés de ces cellules iPS via la complémentation est tétraploïde démontré ^24. profils de méthylation aberrants au groupe de gènes DLK-DIO3 ont été identifiées comme la cause sous-jacente ^24. Cependant, l'addition d'acide ascorbique à une concentration de 50 pg / ml à la presse lors de la reprogrammation produira complémentation tétraploïde iPS compétentes cellules ^24. S'il vous plaît noter que le modèle de la souris reprogrammable alternatif conçu pour exprimer les facteurs de reprogrammation à une stoechiométrie différente peut produire tétraploïdes cellules iPS compétentes, même en l'absence de traitement à l'acide ascorbique ^25. Cependant, dans nos cellules mains de cette souche reprogrammer à considérablement plus basse fréquence par rapport pour le mode de la souris utilisé icil.

La méthodologie décrite dans ce manuscrit permet la séparation des intermédiaires de reprogrammation de la masse réfractaire de la population et doit être considéré comme un outil précieux pour disséquer et comprendre le processus de reprogrammation, la suppression des limitations précédentes d'avoir à utiliser une population non fractionnée pour le profilage (par exemple, bruit du signal haute à partir des cellules réfractaires). La combinaison de l'anticorps décrit ci-après permet l'isolement de produits intermédiaires à partir de cellules de souris à pureté élevée, mais il est possible que les marqueurs de surface des cellules supplémentaires seront découverts dans le futur qui permettra d'obtenir des produits intermédiaires à une pureté encore plus élevée. S'il vous plaît noter que l'AESS-1 expression n'est pas une caractéristique des cellules souches pluripotentes humaines induites et si bien que ce protocole ne peut pas être utilisé sur la reprogrammation des cellules d'origine humaine. En conclusion, la reprogrammation des intermédiaires isolés fois avec la méthode décrite peuvent être utilisés pour les analyses moléculaires dont l'expression profilineg, immunoprécipitation de la chromatine, méthylome analyse, et de protéines essais.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-souris CD90.2 (Thy1.2) Bleu Pacifique  ;	eBioscience  ;	48-0902-82  ;
Biotine SSEA-1 anti-humain/souris  ;	eBioscience  ;	13-8813  ;
Streptavidine PE-Cy 7  ;	eBioscience  ;	25-4317-82  ;
Anti-souris CD326(Epcam) fitc  ;	eBioscience  ;	48-5791-82  ;
Pyruvate de sodium  ;	Technologies de la vie  ;	11360-070  ;
Acides aminés non essentiels MEM (NEAA)  ;	Technologies de la vie  ;	11140-050  ;
Sérum fœtal bovin qualifié de cellules souches embryonnaires (FBS)	Technologies de la vie  ;
Trypsine-EDTA (0,25 %)  ;	Technologies de la vie  ;	25200-056  ;
GlutaMAX	Life Technologies  ;	35050-070  ;
&beta ;-Mercaptoéthanol  ;	Technologies de la vie  ;	21985-023  ;
DMSO (sulfoxyde de diméthyle)  ;	Sigma-Aldrich  ;	D8418  ;
Pénicilline/streptomycine  ;	Technologies de la vie  ;	15140
Solution d’iodure de propidium (PI)  ;	Sigma-Aldrich  ;	P4864-10ML  ;
Gélatine de peau de porc	Sigma-Aldrich  ;	G1890  ;
Hyclate de doxycycline  ;	Sigma-Aldrich  ;	33429-100MG-R  ;
Facteur inhibiteur de la leucémie (LIF)	Millipore  ;	ESG1107  ;
DMEM Glycémie élevée  ;	Technologies de la vie  ;	11960-044  ;
DPBS (solution saline tampon phosphate de Dulbecco)  ;	Technologies de la vie  ;	14190-144  ;
KnockOut DMEM  ;	Technologies de la vie  ;	10829-018  ;
MEF irradiés  ;	Technologies de la vie  ;	S1520-100  ;
Fioles de culture tissulaire de 75 cm2	Corning/BD Bioscience  ;
tubes à centrifuger de 15 ml.	Corning/BD Bioscience  ;
tubes à centrifuger de 50 ml  ;	Corning/BD Bioscience  ;
Lames chirurgicales jetables  ;	Clifford Hallam	SM0501
Flacons cryogéniques  ;	Corning/BD Bioscience  ;
70 & micro ; m Crépine à cellules  ;	BD Bioscience  ;	352340
Taq ADN polymérase  ;	Technologies de la vie  ;	10342-020  ;