Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers

Résumé

Des protocoles pour l’étude de la formation de biofilms dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux sont discutés. Le dispositif microfluidique se compose d’un réseau de micro-piliers et la formation de biofilms par Pseudomonas fluorescens dans ce dispositif est étudiée.

Résumé

Plusieurs espèces bactériennes possèdent la capacité de se fixer sur les surfaces et dans les coloniser la forme de films minces appelées biofilms. Les biofilms qui se développent dans les milieux poreux sont pertinentes pour plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement des eaux usées et séquestration du CO _2. Nous avons utilisé Pseudomonas fluorescens, une bactérie aérobie Gram-négatif, à étudier la formation de biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux. Dispositif microfluidique est constituée d'une matrice de micro-messages, qui ont été fabriqués en utilisant la lithographie molle. Par la suite, la formation de biofilms dans ces dispositifs à écoulement a été étudiée et nous démontrons la formation de biofilms filamenteux appelés banderoles dans notre dispositif. Les protocoles détaillés pour la fabrication et l'assemblage de dispositif microfluidique sont fournis ici avec les protocoles de culture bactérienne. Les procédures détaillées pour l'expérimentation avec le dispositif microfluidique sont également présentées, ainsi que représentantrésultats.

Introduction

Récemment, nous avons démontré bactériennes dynamique de formation d'un biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite un milieu poreux ^1. Les biofilms bactériens sont essentiellement des colonies de bactéries de surface agrégées qui sont encastrés par des substances polymériques extracellulaires (EPS) ^2-4. Ces films minces de bactéries peuvent se former dans presque toutes les niches imaginables allant de surfaces lisses à l'habitat beaucoup plus complexe de milieux poreux. Valiei et al. ¹ a utilisé un dispositif microfluidique avec une matrice de micro-piliers pour simuler une structure de support poreuse et a étudié la formation de biofilms dans ce dispositif en fonction du débit de fluide. Ils ont constaté que dans un certain régime d'écoulement, les biofilms filamenteux appelés banderoles ont commencé à émerger entre les différents piliers. Les banderoles peuvent être attachés à une ou deux extrémités de surfaces solides, mais le reste de la structure est suspendue dans un liquide. Serpentin formation commence typiquement après une première couche de biofilm est formé et son formation peut dicter l'évolution à long terme de biofilm dans des habitats complexes. Récemment, plusieurs chercheurs ont étudié la dynamique de la formation de banderoles. Yazdi et al. ⁵ a montré que les banderoles peuvent se former dans les flux tourbillonnaire provenant d'une bulle oscillante. Dans une autre expérience, Rusconi et al. ^Six étudié l'effet de la courbure de la voie et de la géométrie de la voie de la formation de flammes. Ils ont constaté que les flammes peuvent se former dans les sections courbes de microcanaux, et streamer morphologie est liée à la mobilité. Des recherches récentes ont démontré que les banderoles peuvent avoir d'importantes répercussions dans divers scénarios naturels et artificiels, car ils peuvent agir comme précurseurs pour la formation de structures matures dans les interfaces poreuses, conduire à une prolifération rapide et catastrophique biofilm dans un systèmes biomédicaux, et aussi causer accréditives importante interactions de structure, etc ^1,7-9.

banderoles de biofilms forment souvent ihabitats n complexes tels que les milieux poreux. La croissance du biofilm compréhension poreux environnement médiatique est pertinente à plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement biologique des eaux usées ^10, le maintien du bien-alésage intégrité dans des situations comme capture du CO ₂ ¹¹ et le colmatage des pores dans le sol ^12. Observer la formation de biofilm dans ces habitats complexes peut souvent être difficile en raison de l'opacité du milieu poreux. Dans de telles situations, les plates-formes de médias poreux microfluidiques à base peuvent s'avérer extrêmement avantageux car ils permettent en temps réel et le suivi in situ. Un autre avantage de la microfluidique est la possibilité de construire plusieurs bioréacteurs sur une seule plate-forme de bio-microfluidique et en même temps permettre le suivi et / ou l'intégration de capteurs en ligne. La flexibilité de mettre en œuvre des expériences de laboratoire multiples dans un seul appareil et la capacité de recueillir des données pertinentes importantes pour l'analyse statistique précise est une importante advantage de systèmes microfluidiques ^13,14.

Dans le contexte de la discussion ci-dessus, la compréhension dynamique de formation de banderoles dans un environnement de milieux poreux serait bénéfique à plusieurs applications. Dans cette étude, nous développons le protocole d'enquête pour la formation de banderoles dans un appareil qui imite les milieux poreux. La fabrication de la plate-forme microfluidique, les mesures nécessaires pour la culture cellulaire et l'expérimentation est décrite. Dans nos expériences, la souche bactérienne de type sauvage de Pseudomonas fluorescens a été utilisé. P. fluorescens, qui se trouve naturellement dans le sol, joue un rôle clé dans le maintien de l'écologie du sol ^15. La souche bactérienne utilisée a été génétiquement modifié pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) constitutive.

Protocole

Effectuez les protocoles expérimentaux ici dans l'ordre décrit ci-dessous. les protocoles de microfabrication pour la création de la plate-forme microfluidique sont examinées à l'étape 1 étape 2 décrit le protocole de culture bactérienne (figure 2), et l'étape 3 se rapporte à l'assemblage du dispositif expérimental (figure 3). Enfin, l'étape expérimentale réel est décrit à l'étape 4.

Procédure de fabrication 1 Chip

REMARQUE: les procédures de sécurité doivent être suivies pour les procédés décrits ci-dessous. Consultez l'agent de sécurité institutionnel pour plus de détails.

1. Concevoir le masque avec un logiciel approprié (par exemple, L-Edit). La conception de la chaîne se compose d'un micro-canal principal 625 um de largeur. La région centrale de la chaîne contient un réseau de micro-messages 50 m de diamètre, espacés de 25 um à part (voir Fichiers supplémentaires).
2. Imprimez le design sur verre (5 "x 5" verre sodocalcique), Qui a une épaisseur de 0,09 "et est recouvert par environ 70 couche épaisse nm de chrome (Cr), en utilisant le masquage de manière à préparer un masque de photo. Utilisation AZ400K développeur pendant 1 min. Ensuite graver la couche de Cr en utilisant du Cr décapant pendant environ 1 min de l'acétone pour enlever la résine et le nettoyer avec une solution piranha froid. (H ₂ SO ₄ et H ₂ O ₂ dans un rapport de 3: 1).
3. Photolithographie
   1. Nettoyer une plaquette 4 "de silicium norme chimiquement avec une solution piranha pendant 20 min.
   2. Rincer la plaque avec de l'eau déminéralisée et sécher.
   3. Chauffer la pastille sur une plaque chauffante (200 ° C pendant 15 min).
   4. Enduire la plaque de silicium de résine photosensible. Ici, l'AZ4620 de résine photosensible positive a été enduite par centrifugation sur une tranche de silicium à 2000 tours par minute pendant 25 secondes pour obtenir une couche épaisse de 12,5 um.
   5. Retirez tout le solvant par cuisson douce de la tranche sur une plaque chauffante en faisant flotter la tranche de 90 secondes sur les flux d'azote à 100 ° C. Alors, gardez-le dans le vide à til même température pendant 60 sec.
   6. Placez la tranche dans une boîte sombre pendant 24 heures pour la déshydratation.
   7. Exposer la tranche à de la lumière UV afin de transférer le motif conçu à la résine photosensible.
   8. Immerger la plaquette dans une solution de révélateur de résine photosensible (AZ400K) à 240 sec. Ensuite, rincer la tranche avec de l'alcool isopropylique et le sécher en le plaçant dans un flux d'azote gazeux.
4. ICP-DRIE (Plasma à couplage inductif - Deep Reactive Ion Etching) Process
   1. Appliquer gravure DRIE. Choisissez la profondeur de gravure appropriée en fonction de la profondeur finale requise pour le dispositif (50 um dans cette enquête). Résine photosensible agit comme une couche de masquage au cours de ce processus.
   2. Retirer la résine photosensible restante avec de l'acétone et nettoyer la plaquette.
5. PDMS (polydiméthylsiloxane) Castings
   1. Utilisez trichlorométhylsilane (SMTC) pour silaniser la moule maître de silicium. Versez 2 ou 3 gouttes de trichlorométhylsilane dans un flacon et le placer dans un dessiccateur à côté de lasilicium moule maître. Autoriser 2-3 h pour le processus de silanisation pour terminer.
   2. Dans un récipient séparé, mélanger la base de silicone Sylgard 184 avec l'agent de durcissement par rapport en poids de 10: 1 pour préparer des PDMS. Dégazer les PDMS en le soumettant à des conditions sous vide (environ 2 h).
   3. Mettez le moule maître de silicium dans un support. Puis verser le PDMS sur le moule maître de silicium pour former le tampon en PDMS. Veiller à ce que les bulles ne se forment pas dans les PDMS cours de ce processus.
   4. Guérir les PDMS pendant 2 heures à 80 ° C.
   5. Décollez le timbre de PDMS du moule maître. Ensuite, couper les PDMS timbre en puces distinctes. Enfin, l'utilisation d'un noyau de coupe pour percer des trous pour l'entrée (s) et sortie (s).
6. Collage de PDMS à verre
   1. Dégager la lamelle et PDMS tampon à un plasma d'oxygène pendant 30 secondes. Bond PDMS timbre à la lamelle.
   2. Pour obtenir une bonne étanchéité entre le timbre de PDMS et la lamelle couvre-objet, le dispositif de recuit en le plaçant dans un four à 70 ° C pendant 10 min.

2. culture bactérienne

REMARQUE: Les protocoles de biosécurité doivent être suivies pour les étapes 2-4. Consultez l'agent de sécurité institutionnel pour plus de détails.

1. Préparer des plaques de gélose LB
   1. Ajouter 20 g de Luria-Bertani (LB) gélose (Miller) des poudres et 500 ml d'eau ultra-pure à une fiole de 1 L. Remuez pour dissoudre la poudre.
   2. Stériliser à l'autoclave à 15 psi, 121 ° C pendant 15 min.
   3. Laisser le flacon refroidir à 50-55 ° C sur un banc ou dans un bain d'eau dans la hotte de biosécurité.
   4. Ajouter l'antibiotique tétracycline pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Bien mélanger en tourbillonnant.
   5. Verser le mélange dans des assiettes. Remplir chaque plaque jusqu'à 1.2 à 2.3 complet.
   6. Air flamme bulles brièvement pour les faire éclater si elles se forment. Bulles d'air solidifiées sont difficiles à diffuser la culture bactérienne sur.
   7. Laisser les plaques refroidir à la température ambiante pendant une nuit.
   8. Quand ils sont froids,mettre des plaques de retour dans leur manche, sceller le sac, l'étiquette (antibiotique et la date), et conserver à 4 ° C.
      REMARQUE: Couvrir le stock de plaques avec du papier d'aluminium, comme la lumière désactive de nombreux antibiotiques.
2. Préparation du bouillon LB
   1. Ajouter 20 g de Luria-Bertani (LB) (Miller) des poudres et 1 L d'eau ultra-pure à un ballon. Remuez pour dissoudre la poudre.
   2. Stériliser à l'autoclave à 15 psi, 121 ° C pendant 15 min.
   3. Laisser refroidir ballon à 50-55 ° C sur un banc ou dans un bain d'eau dans la hotte de biosécurité.
   4. Ajouter l'antibiotique tétracycline pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml. Bien mélanger en tourbillonnant.
   5. Une fois refroidi, placez la bouteille étiquetée à 4 ° C.
      REMARQUE: Couvrir la bouteille avec du papier d'aluminium, comme la lumière désactive de nombreux antibiotiques.
3. Les bactéries de la culture sur une plaque de gélose LB (Ce protocole utilise Pseudomonas fluorescens)
   1. Prenez le stock bactérienne du congélateur (-80 °; C) et placez-le sur la glace.
   2. Placez le -80 ° C stocks bactérienne et une plaque de gélose LB dans une hotte de sécurité biologique.
   3. La série de souches bactériennes sur une plaque de gélose LB dans un motif en zigzag. Couvrir la plaque de gélose et incuber à 30 ° C pendant la nuit. Enfin, stocker la plaque au réfrigérateur à 4 ° C.
4. Préparer la solution bactérienne (S1)
   1. Verser 50 ml de milieu de bouillon LB à un ballon autoclave. Effectuez cette opération dans une hotte de sécurité biologique.
   2. Transférer une colonie bactérienne unique de la gélose LB plaque dans le ballon. Cette opération doit également être effectuée à l'intérieur d'une hotte de sécurité biologique.
   3. Mettre la fiole dans un incubateur agitateur à 30 ° C et 150 tours par minute pendant un temps suffisant (4 heures).
5. Préparer la solution bactérienne diluée (de S2)
   1. Verser 5 ml de milieu LB de bouillon dans un tube en plastique stérilisé.
   2. Diluer S1 par mélange avec un bouillon LB. Ensuite, vortex la solution. Diluer la solution atteindre l'optique désiréedensité al (DO mesurée à 600 nm = 0,1).
      REMARQUE: expériences biofilm utilisent généralement des valeurs de DO dans ce voisinage.

3 Préparer la configuration expérimentale

1. Utilisation des pinces connecter des tubes souples en matière plastique (0,20 "d'identification) dans l'entrée (s) et sortie (s) de la puce électronique. Les entrées et les sorties ont été préalablement percés dans la partie de PDMS de la puce (étape 1.5.5). Dans cette enquête , la puce électronique est constitué de deux entrées et une sortie.
2. Remplir la seringue (s) avec une solution bactérienne (solution S2) et enlever toutes les bulles dans la seringue (s).
3. Connectez embout de la seringue (s) (30 G 0,5 "d'aiguille émoussée) dans le tube (s) d'entrée. Ensuite, connectez le tube de sortie (s) de perdre conteneur.

4 Réalisation de l'expérience

1. Fixez la seringue (s) à la pointe (s) de la seringue.
2. Place et fixe seringue (s) sur la pompe à seringue. Ensuite, placez la puce sous un microscope optique avec lentilles de l'objectif de desired grossissement (par exemple, 40X). Couvrir la puce avec un dispositif de chambre de cellules vivantes de maintenir un environnement à température constante pour la croissance bactérienne (à 30 ° C pour P. fluorescens).
3. Placer la pompe au niveau du débit souhaité (par exemple 10 pi / h) et de lancer pompage de fluide.
4. Une fois que les bactéries sont introduites dans la chambre, la formation du biofilm est également déclenchée. La formation du biofilm et la maturation se produisent généralement sur une période de plusieurs heures, voire plusieurs jours. Observer et prendre des images de la croissance du biofilm à travers le microscope.

Résultats

En utilisant le protocole de microfabrication mentionné ci-dessus, un dispositif microfluidique à base de PDMS a été construit. Figure 1 montre le microscope électronique à balayage (MEB) d'images de l'appareil PDMS. Figure 1a représente la section d'entrée du dispositif. Une entrée en forme de fourche est créé pour égaliser la pression à travers la tête de l'appareil. De plus l'imagerie SEM a montré également que les parois de pilier sont presque verticale (figure 1b)....

Discussion

Nous avons démontré un dispositif microfluidique simple qui imite les milieux poreux pour étudier le développement de biofilm dans des habitats complexes. Il ya plusieurs étapes critiques qui dictent les résultats des expériences. Ils comprennent la géométrie de l'appareil. Alors que la géométrie de poste peut varier, pores suffisamment d'espace pour banderoles pour former est nécessaire. En outre, Valiei et al. ¹ ont démontré que la formation de banderoles a lieu seulement dans une certaine ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope fluorescent	Nikon
LB agar	Fisher	BP1425-500	suspendre 40 g dans 1 L d’eau purifiée
bouillon LB	Fisher	BP1427-500	suspendre 20 g dans 1 L d’eau purifiée
Capot de biosécurité	Microzone corporation
Boîte de Pétri	Fisher	875712	stérile 100 mm x 15 mm polystyrène Boîte de Pétri
Agitateur d’incubateur	New Brunswick Scientific		Excella E24 série d’agitateurs
50 ml tube centrifuge stérilisé	Corning	430828	Polypropylène RNase-/DNase sans
tétracycline	Base MP Biomedicals	103012	50 μ ; g/ml
SYLGARD 184 silicone	Dow Corning Corporation	68037-59-2	Élastomère Base et agent de durcissement
Photorésine positive (AZ4620)
Tube en plastique	Cole-Parmer