Article de méthode

Une méthode d'immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

DOI :

10.3791/51741

⸱

20 juillet 2014

 ,  , 
1Center for Thoracic Disease and Transplantation, Heart and Lung Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center

Dans cet article

Résumé

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Il est nécessaire d'améliorer l'information visible sur les moteurs moléculaires de l'oesophage de Barrett. Immunofluorescence est une technique utile pour comprendre les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie cellulaire. Nous présentons un protocole simple et efficace pour l'utilisation de la coloration par immunofluorescence pour évaluer le traitement thérapeutique dans les cellules oesophage de Barrett.

Résumé

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Adénocarcinome oesophagien (EAC) a un taux de survie global de moins de 17% et l'incidence de la CAE a augmenté de façon spectaculaire au cours des deux dernières décennies. L'un des principaux facteurs de risque de la CAE est l'oesophage de Barrett (BE), un changement de métaplasie épidermoïde de l'œsophage normale en réponse à des brûlures d'estomac chroniques. Malgré la connexion bien établie entre CAE et BE, interrogation des événements moléculaires, en particulier les voies de signalisation altérées impliquant progression de BE à EAC, sont mal compris. Beaucoup de ceci est dû à l'absence d'convenable dans des modèles in vitro disponibles pour étudier ces maladies. Récemment, les lignes BE cellulaires immortalisées sont devenus disponibles dans le commerce permettant des études in vitro de BE. Ici, nous présentons une méthode de coloration par immunofluorescence de lignes BE cellulaires immortalisées, permettant la caractérisation in vitro de la signalisation cellulaire et de la structure après exposition à des composés thérapeutiques. L'application de ces techniques se help développer comprendre les mécanismes impliqués dans la progression BE EAC et de fournir des pistes potentielles pour le traitement et la prévention de l'EAC.

Introduction

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L'oesophage de Barrett (BE) est un changement de métaplasie de l'épithélium malpighien normal de l'œsophage et une conséquence de l'exposition chronique à du contenu gastrique résultant de la maladie de reflux gastro-œsophagien (RGO) 1. BE est pensé pour être un mécanisme de protection en réponse à la DIRD, mais la présence de BE confère un risque accru d'adénocarcinome de l'œsophage (EAC), une maladie qui porte un faible taux de survie significativement 1. Les estimations actuelles indiquent que jusqu'à 5,6% de la population américaine ont BE, mais comme BE est souvent asymptomatique, on pense que la majorité des BE ....

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Protocole

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1. Entretien Cell ligne

  1. Humaine immortalisée BE dysplasiques de haut grade (CP-B, CP-C, CP-D) et métaplasique (CP-A) des lignées de cellules par transfection stable de la télomérase humaine transcriptase inverse (TERT) protéine 11.
  2. Maintenir BE lignées cellulaires dans un milieu de kératinocytes supplémenté avec de l'extrait de bovin pituitaire (BPE), le facteur de croissance épidermique (EGF), 5% de sérum bovin fœtal (FBS), acides aminés non essentiels (NEAA), de la pénicilline-streptomycine-néomycine (PSN), et la norme conditions de culture de tissus (37 ° C, 5% CO 2, 98% d'humidité).

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Résultats

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Un exemple des résultats obtenus à partir de l'application des procédures décrites, est illustrée sur les figures 1A-D. Lamelles couvre avec CP-D et cellules BE CP-C ont été traités pendant 24 heures avec 1 uM de l'inhibiteur de Src de la famille, SKI-606, ou d'un véhicule (DMSO) et colorées en utilisant les procédures ci-dessus pour la jonctions adhérentes et signalisation Wnt protéine, β -caténine. Visualisation de β-caténine a été obtenue par marquage avec un anticorps anti-IgG de lapin couplé à un f.......

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Discussion

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Nous avons décrit une méthode pour l'application de l'IF de cellules de BE à élucider les effets physiologiques des thérapies ciblées sur ces cellules. Alors que nous avons décrit l'utilisation de ces procédures à l'égard des cellules de BE, nous avons constaté que ces procédés sont également applicables à une variété de types cellulaires différents 13,17,18. En outre, ces procédures peuvent être modifiées de plusieurs façons d'optimiser coloration pour des objectifs spécifiques.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du St, la Fondation Joseph (AJF, LJI) et l'American Lung Association, RG-224607-N (LJI).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CP-A (lignée cellulaire métaplasique)ATCCCRL-4027
CP-B (lignée cellulaire dysplasique de haut grade)ATCCCRL-4028
CP-C (lignée cellulaire dysplasique de haut grade)ATCCCRL-4029
CP-D (lignée cellulaire dysplasique de haut grade)ATCCCRL-4030
Keratinocyte-SFM (1x), LiquidLife Technologies17005-042
0,25 % trypsine-EDTA (1x), rouge de phénolLife Technologies25200056
sérum de veau fœtal, qualifié, HILife Technologies10438026
mélange d’antibiotiques PSNLife Technologies15640
PBS - Phosphate-BufferedSaline Life Technologies10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent avec DAPI  ;Life TechnologiesP36931
Couvercle circulaire en verre 18 mmFisher Scientific15-183-86
&beta ;-caténine Anticorps primaire (lapin)Signalisation cellulaire9562S
Alexa Fluor 488 (anti-lapin de chèvre)Life TechnologiesA11008
Boîte PS traitée TC 10 cm, stérileUSA ScientificCC7682-3394
Plaque PS traitée TC 12 puits, stérileUSA Scientific5666-5180
DMSOSigma-Aldrich276855
ParaformaldéhydeSigma-AldrichP6148
Chlorure d’ammoniumSigma-AldrichA9434
SaponineSigma-Aldrich47036
Albumine sérique bovine - Fraction VSigma-Aldrich85040C
SKI-606 (Bosutinib)Selleck ChemicalsS1014
Plat carré de bioessai  ;Thermo Scientific240835
Parafilm  ;VWR82024-546
Pipettes Pasteur jetables, verre blancVWR14672-380
Nexcelom Mini compteur de cellulesNexcelom
Chambres de comptage de cellomètreNexcelomCHT4-SD100-014
Microscope Zeiss Apotome  ;Zeiss

Références

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  1. Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
  2. Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C.

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Mots-clés

Cellules de l sophage de Barrettmarquage immunofluorescentlocalisation prot iquemicroscopie fluorescenceanalyse de la structure cellulaireeffets du traitement pharmacologiqueincubation avec l anticorps primaireconjugaison de l anticorps secondairepr servation par fixateurpr paration de la lamelle couvre objet

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