Mesure de la fonction respiratoire chez la souris utilisant effrénée pléthysmographie corps entier

Résumé

L'évaluation de la physiologie respiratoire a traditionnellement compté sur des techniques, qui nécessitent une contention ou sédation de l'animal. Effrénée pléthysmographie corps entier, cependant, fournit une analyse précise et non invasive, quantitative de physiologie respiratoire dans des modèles animaux. En outre, la technique permet une évaluation répétée de souris respiratoire permettant d'études longitudinales.

Résumé

Dysfonctionnement respiratoire est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde et les taux de mortalité continuent d'augmenter. L'évaluation quantitative de la fonction pulmonaire chez les rongeurs est un outil important dans le développement de futures thérapies. Communément utilisé des techniques pour évaluer la fonction respiratoire, y compris pléthysmographie invasive et oscillation forcée. Bien que ces techniques fournissent des informations précieuses, la collecte de données peut être lourde avec des objets et de la variabilité expérimentale en raison de la nécessité d'une anesthésie et / ou instrumentation invasive de l'animal. En revanche, sans retenue pléthysmographie corps entier (UWBP) offre un moyen quantitatif précis, non invasif qui pour analyser les paramètres respiratoires. Cette technique permet d'éviter l'utilisation de dispositifs de retenue et l'anesthésie, qui est commun aux techniques traditionnelles de pléthysmographie. Cette vidéo montrera la procédure UWBP y compris l'équipement mis en place, l'étalonnage et les poumons fonction enregistrement. Ilexpliquera comment analyser les données recueillies, ainsi que d'identifier les valeurs aberrantes expérimentales et des objets qui résulte de mouvements d'animaux. Les paramètres respiratoires obtenus en utilisant cette technique comprennent le volume courant, le volume minute, le rapport cyclique inspiratoire, le débit inspiratoire et le rapport du temps d'inspiration au temps d'expiration. UWBP ne repose pas sur des compétences spécialisées et est peu coûteux. Une caractéristique clé de UWBP, et plus attrayant pour les utilisateurs potentiels, est la possibilité d'effectuer des mesures répétées de la fonction pulmonaire sur le même animal.

Introduction

Dysfonction du poumon est l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. La condition est caractérisée par l'échange d'oxygène insuffisante, synonyme de la toux, des douleurs thoraciques et dyspnée. Les maladies respiratoires pour ~ 10% de mortalité dans le monde ^1. Selon l'Organisation mondiale de la santé, les taux de mortalité vont augmenter à cause du tabagisme persistant, la pollution et les irritants au travail. UWBP est un complément utile pour l'étude de la physiologie du poumon, qui complète fortement biochimique traditionnelle et analyse histologique ^2. D'autres procédures utilisées pour l'évaluation du poumon ne fournissent pas les mêmes avantages que UWBP. Pléthysmographie invasive est une technique couramment utilisée qui exige que l'animal soit anesthésié ^3,4 et donc, des mesures respiratoires résultant ne sont pas nécessairement le reflet d'un état ​​naturel. En outre, l'exigence de ventilation et chimiques défis mécaniques n'empêche mesures futures ^3,4.Une autre méthode de collecte de données respiratoire est en oscillation forcée, qui est plus sensible aux changements dans les plus fins par rapport aux paramètres respiratoires UWBP ^5. Oscillation forcée est, cependant, une technique invasive et nécessite résiliation animal pour la collecte de données ^5-7.

UWBP consiste à placer un animal à l'intérieur d'une chambre spécialisée. Pendant l'inspiration, la marée air est réchauffé et humidifié à l'intérieur des poumons de plus en plus la pression de vapeur d'eau et provoque la dilatation thermique de gaz ^8. Cet effet provoque une variation nette de la quantité d'air créant une augmentation de pression dans la chambre de pléthysmographe ^8. L'inverse se produit lors de l'expiration créer une forme d'onde respiratoire à partir de l'animal. analyse de forme d'onde est ensuite utilisé pour mesurer à partir de la trace respiratoire: fréquence respiratoire (respirations / min), le temps de cycle de la respiration totale (s), d'inspiration / heure d'expiration (Ti / Te, sec) et les variations de pression dues à chaque volume courant (P _T). Figure 1 illustre chaque origine des mesures à partir d'une trace respiratoire. Ces mesures sont simples à calculer les paramètres respiratoires et multiples peuvent être dérivés à partir de ces mesures. Ces paramètres sont les suivants: volume courant (le volume d'air déplacé entre l'inhalation normale et l'expiration), le volume minute (volume de gaz inhalé par les poumons par minute), le rapport cyclique inspiratoire (le pourcentage de temps d'inspiration pour la durée totale du cycle de la respiration) et débit inspiratoire (la quantité d'air inspiré dans un temps donné).

UWBP fournit une analyse précise et non invasive, quantitative de physiologie respiratoire chez des modèles animaux et peut être utilisé pour mesurer la progression de la maladie des voies respiratoires et des poumons ^6,9. Contrairement à d'autres techniques de pléthysmographie, UWBP évite l'utilisation de l'anesthésie, les restrictions et les manipulations invasives qui produisent des artefacts et expérimentale variabilité ^6,9. Anesthésie peut supprimer la respiration,modifier le rythme cardiaque et peut être difficile à régler ^10. Restrictions induisent une augmentation de la respiration due à un stress supplémentaire via la corticostérone et l'adrénaline libèrent ^11,13. La principale caractéristique de UWBP est répété évaluation physiologique rendant prêtent à des études longitudinales. UWBP est fortement recommandé pour l'évaluation longitudinale de la physiologie du poumon et offre une compétence précieuse pour l'avenir de l'évaluation des médicaments respiratoires.

Bléomycine, l'ovalbumine et l'hypoxie ont été utilisés pour induire défis respiratoires dans plusieurs études et UWBP a réussi à mesurer poumon précis évaluation physiologique ^7,9,13-16. Le protocole décrit est conçu pour les souris de laboratoire adulte standard. Cependant, UWBP a été adaptée à d'autres animaux tels que les rats, les cobayes et les primates non humains ^{de 17 à 20.} UWBP ne se limite pas seulement à l'évaluation de la dysfonction pulmonaire mais a également été utilisée pour l'évaluation de la maturation pulmonaire ^3.La polyvalence, la simplicité et la reproductibilité des UWBP ont établi une excellente technique pour l'évaluation de la fonction pulmonaire chez les animaux. Divers logiciels (voir matériaux et la table de l'équipement) sera tenu de suivre cette procédure. Un scientifique expérimenté serait en mesure d'effectuer ce protocole avec une souris dans 1 heure.

Protocole

REMARQUE: La procédure expérimentale suivante est approuvé par le Comité d'éthique animale à l'Université Monash et réalisée conformément aux dispositions du Code australien de pratiques pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques (2006). Adultes C57BL / 6 femelles souris utilisées pour générer les résultats représentatifs ont été obtenues à partir des Services animaliers de Monash. Les souris ont été logées dans un local spécifique de l'agent pathogène, température et humidité contrôlées avec un cycle de lumière-obscurité de 12 heures. Ces souris avaient un accès libre à la nourriture et de l'eau.

1 Configuration initiale

1. Connectez l'ordinateur portable / de bureau à la machine d'acquisition de données pour l'enregistrement via un câble USB.
2. Connectez l'amplificateur pont de 'sortie 1' à 'entrée 1' de la machine d'acquisition de données via un câble BNC.
3. Insérez le capteur de pression en «voie 1» de la Octal Pont Amp. Mettez l'appareil d'acquisition de données et ouvrir le logiciel d'analyse. Le logiciel devrait autodétecter automatiquement la configuration de l'équipement (voir tableau des matériaux et de l'équipement).
4. Les réglages des canaux ouverts trouvés dans la barre d'outils de configuration du logiciel. Changer le nombre de canaux en cours d'enregistrement à 1.
5. Mettre en place le baromètre pour mesurer la pression ambiante et l'appareil de colonne d'eau pour calibrer l'amplificateur Bridge. Appareil de colonne d'eau comprend deux pipettes de seringue 5 ml sérologiques reliés par des tubes en plastique.
6. Remplissez les colonnes avec de l'eau et s'assurer que les niveaux d'eau sont équilibrés avec une règle. Raccorder une section de tube en matière plastique à la partie supérieure de chaque pipette. Figure 2 montre la colonne d'eau créée.

2 Pont Amplificateur étalonnage

Remarque: Pour étalonner l'amplificateur de pont d'une injection d'air dans la colonne d'eau est nécessaire pour créer un 1 cm H ₂ O déviation. Cela se produit dans un seul ensemble de conditions et dépend de l'appareil de l'utilisateur. Pour plus de précisions ces étapes demonstrate comment ce laboratoire serait effectuer l'étalonnage.

1. Retirer une seringue de 1 ml à 300 pi; fixer la seringue au robinet d'arrêt à l'extrémité de la tubulure sur le côté droit de la colonne d'eau. REMARQUE: Assurez-vous que le robinet est ouvert à la seringue et la colonne d'eau, et fermé à l'air ambiant. Si les niveaux d'eau ne sont pas équilibrés, à ce stade, tourner le robinet de sorte qu'il est ouvert à l'air ambiant et la colonne d'eau, ce sera à rééquilibrer l'eau. Le tube sur le côté gauche de la colonne d'eau doit être connecté au transducteur de pression pour mesurer la variation de pression provoquée par la chute de la seringue.
2. Fixer le tube de la colonne d'eau sur le côté gauche du connecteur sur le transducteur de pression (supérieure annulaire du transducteur).
3. Sélectionnez le menu déroulant en bas trouvé près de la voie 1 à l'écran principal sur le côté droit du logiciel et sélectionnez "ampli Bridge" (voir tableau des matériaux et de l'équipement).
4. Entrerles paramètres à 5 mV, 20 Hz passe-bas, cocher la case «inverti» et cliquez sur «zéro». Cliquez sur 'zéro' pour fixer la trace à ~ 0 mV. Réduire la taille de la fenêtre à 4: 1 pour faciliter la visualisation.
5. Avec tout mis en place, appuyer sur la seringue de 1 ml, laissant pendant 3 sec. Cela fera apparaître une hausse soudaine sur le logiciel parce que la pression a changé. Lorsque les 300 ul est enfoncée la pression déplace l'eau dans la colonne d'eau de 1 cm. Cette valeur connue aidera calibrer l'amplificateur Bridge.
   NOTE: L'augmentation de la pression dans la chambre en raison de la dépression 300 pi correspond à la valeur P _K utilisée pour des calculs ultérieurs.
6. Sélectionnez «unités d'entrée», trouvées sur le coin inférieur gauche de la fenêtre Bridge Amp.
7. Mettez en surbrillance le "trace de fond" avant le pic autrement connu comme la «Région zéro».
   1. Cliquez sur la flèche à côté de «point 1» et cela produira le bacsignal de kground dans la gamme de -0.002 mV 0,002 mV (la valeur ne sera jamais exactement à 0 mV).
   2. Type de «0» dans la fenêtre adjacente à la fenêtre du signal de fond.
8. Mettez en surbrillance le "zone de pression accrue de graphique" à partir de quand la seringue est enfoncé. Cliquez sur la flèche au point 2 et la valeur doit être dans la gamme de 0,9-1,2 mV.
   1. Type «1» dans la fenêtre à côté de la fenêtre "pression accrue". Pour une clarification visuelle sur les mesures 2.7 et 2.8 se référer à la Figure 3. Valeurs trouvées en dehors des plages spécifiées peuvent indiquer des dommages à l'octal Pont Amp.
9. Aller à «définir des unités» qui se trouve dans le coin supérieur droit de la fenêtre et sélectionnez "cmH ₂ O". Si cette option n'est pas disponible, elle peut être saisie manuellement. Cliquez sur OK.
10. Retour au menu «Pont Amp» (voir 2.1). Sélectionnez 1 mV et réglez l'amplificateur à «zéro»;. Cela viendra compléter l'étalonnage et la colonne d'eau peut être retiré en toute sécurité.

Fonction 3 Enregistrement du poumon

1. Peser la souris (g). REMARQUE: Une semaine avant l'évaluation physiologique introduire la souris à l'environnement de la chambre de pléthysmographie. Cela aidera à réduire le stress et l'acclimatation lors de l'exécution de cette procédure à une date ultérieure. Pour un schéma d'ensemble montrant la configuration UWBP, s'il vous plaît se référer à la Figure 4.
2. Mesurer la température du corps avec un thermomètre rectal. Graisser le thermomètre avec de la vaseline avant l'insertion. Enregistrez la lecture de la température et de nettoyer le lubrifiant hors 80% (v / v) d'éthanol. Si l'on utilise de très petits animaux tels que les souriceaux nouveau-nés, la valeur moyenne de la température corporelle peut être déterminée avec un thermomètre infrarouge à la place.
3. Placer la sonde d'humidité / température par rapport à l'extrémité d'un trou de la chambre de pléthysmographie. Enregistrer la température, l'humidité et barometric pression à l'intérieur de la chambre de pléthysmographie avant de passer à l'intérieur de la souris.
4. Placez la souris dans la chambre de la pléthysmographie, couvrir légèrement l'extrémité ouverte. Cela permet à la souris pour s'acclimater. Fermez la chambre.
5. Avec la sonde de température / humidité inséré dans le côté de la chambre de pléthysmographie avec un trou, maintenant insérer la seringue dans le transducteur et de l'autre côté avec les deux trous.
6. Appuyez sur 'Start' sur le logiciel et d'enregistrer pendant environ 15-45 secondes. Fiche 5-10 sec de données où l'animal ne se déplace pas. Mouvement va modifier la physiologie respiratoire de base de l'animal et de fournir des résultats médiocres. La respiration doit osciller sur un trajet linéaire sur le programme. Ce sont des données utilisables. Remarque: la miction ou la défécation peut conduire à une augmentation de la température et de l'humidité à l'intérieur de la chambre de pléthysmographie. Cela occulter les résultats lors de l'analyse. Dans le cas de la miction ou la défécation, arrêter immédiatement l'enregistrement et nettoyer la plchambre de ethysmography avec 80% (v / v) d'éthanol. Reportez-vous à la figure 6 pour une représentation visuelle des résultats sous-optimaux, où les données doivent être rejetés.
7. Après avoir enregistré pendant 45 secondes, appuyez sur «Stop» sur le logiciel (voir matériels et ustensiles de table) programme. Débranchez la souris de la chambre de pléthysmographie et enregistrer immédiatement la température et de l'humidité chambre. Ne pas enregistrer continuellement pendant plus de 45 secondes comme cela peut souligner l'animal.
8. Retour de la souris dans sa cage, vaporiser et essuyer la chambre avec 80% (v / v) d'éthanol.
9. Laisser la chambre à sécher et revenir à la température et l'humidité de base avant de passer à la prochaine souris. Répétez les étapes 3.1 à 3.9 pour les animaux suivants. Remarque: Si plusieurs animaux sont à l'étude, s'assurer que la température de la chambre et le retour de l'humidité à des valeurs de référence proches avant chaque nouvel animal est mis dans la chambre.

4. pléthysmographie analyse

Aucunte: Pour calculer les paramètres respiratoires tels que le volume courant _{(V T)} et le volume minute, les variables suivantes doivent être mesurées: le taux de respiration (respirations / min), la respiration totale du temps de cycle (s), d'inspiration / heure d'expiration (Ti / Te, secondes) et le changement de la pression due à chaque volume courant (P _T). Figure 1 illustre les variables qui peuvent être mesurées à partir d'une trace. Les étapes suivantes utilisent un logiciel (voir matériaux et de la table de l'équipement) pour mesurer ces variables. Lors de l'analyse, d'éviter les régions de la trace contenant renifler ou mouvement. Pour obtenir des résultats reproductibles, au moins 5 secondes de la bonne trace respiratoire est nécessaire. Pour un exemple de différentes traces de respiration se référer à la Figure 5 et 6.

1. Ouvrez l'écran en plein écran, réglez vue de 1: 1 et sélectionnez 5 secondes de données utilisables. Un cliché représentatif de ceci est montré dans la Figure 5.
2. Ouvrez la mini-fenêtre de tampon de données se trouve en haut de la programme dans l'onglet Datapad. Sélectionnez le canal 1 et sélectionnez «mesures de cycle» dans la colonne de gauche et la «hauteur moyenne cyclique» dans la colonne de droite.
   1. Sélectionnez «Option» et définir l'échelle pour la détection de crête minimum de 1 (ms). Cela permettra la détection de chaque valeur de crête et devient extrêmement important lors de l'utilisation de petits animaux qui produisent de petites oscillations.
   2. Cliquez sur 'OK'. Ce présentera 'déviation de la pression due à chaque volume courant "(P _T) de mesure.
3. Dans le mini-tampon de données, sélectionnez «mesures de cycle» suivi de «nombre d'événements 'et cliquez sur' OK '. Ce présentera la «fréquence» (f) mesure.
   1. La fréquence doit être converti de respirations / min. Cela se fait en multipliant la valeur de 60 secondes et en divisant le résultat par la durée totale d'enregistrement (min).
4. Dans le mini-tampon de données, sélectionnez cy »mesures de cle 'suivi de' période 'et cliquez sur' OK '. Cela présente le «temps total de cycle de respiration» (T _tot, s) mesure.
5. Les prochaines étapes sont utilisés pour créer une macro-instruction pour générer inspiration et d'expiration des valeurs de pointe de temps. Assurez-vous que le curseur est directement au-dessus du maximum du pic / creux et ajouter un commentaire sur 9 pics et les creux successifs. Commencer avec le sommet de l'oscillation, comme illustré sur la figure 5.
6. Par la suite, sélectionnez la fenêtre: tampon de données et de la colonne 1 Dans la fenêtre qui apparaît, cliquez sur "information de sélection» dans la colonne de gauche, la «durée» dans la colonne de droite et cliquez sur 'OK'.
7. Sélectionnez macro se trouve en haut de programme et puis commencer l'enregistrement. Maintenant, sélectionnez les commandes: 'Rechercher', 'Go', 'début du fichier "et cliquez sur" Rechercher ".
8. Sélectionner des commandes à: 'Rechercher' et 'Rechercher commentaires'. Tapez la même phrase typé pour la boîte de commentaire dans le 'contenant' case prévue. Choisissez l'onglet "Sélectionner pour point précédent 'et' Rechercher '.
9. Sélectionnez les commandes: «Ajouter au tampon de données. Ensuite, sélectionnez la macro: macro-commandes et de commencer la répétition. La fenêtre de comptage de répétition qui apparaît devrait être fixé à 9.
10. Sélectionnez la commande: «Rechercher le suivant». Sélectionnez la commande: «Ajouter au tampon de données. Enfin, sélectionnez macro-commandes et la répétition de fin.
    1. Maintenant, sélectionnez la macro et arrêter l'enregistrement. Enregistrez et nommez la macro après le nombre d'animaux. REMARQUE: La mise en place de la macro pour chaque animal permet la macro à utiliser pour les études longitudinales et gagner du temps.
11. La macro peut maintenant être exécuté pour obtenir l'Inspiration (T _i) et d'expiration (T _e) le temps entre chaque commentaire. Les données apparaissent sous la voie 1 du bloc de données. Expiration et l'inspiration se produit consécutivement et les données apparaîtront dans cet ordre.
    1. Les données doivent être répartis manuellement dans les valeurs d'inspiration et d'expiration. Faire la moyenne des quatre valeurs de données de chaque paramètre afin d'obtenir la moyenne T _i et T _e.
12. Une fois que les valeurs de base ont été dérivées du volume courant (V _T, ml) peut être calculée. Pour obtenir le volume de marée de l'équation de Drorbaugh et Fenn ⁸ est utilisé:
    V _T (ml) ₌ (P _T / P _K) x (V _K) x ((T _CORE (P _B - P _C)) / (T _CORE (P _B - P _C) - T _C (P _{B -} P _CORE)))
    
    Où
    V _T: Volume courant
    P _k: déviation de la pression due à l'injection de 1 ml (Reportez-vous à l'étape 2.5)
    T _{de base:} la température de base de chaque animal
    P _C: pression de vapeur d'eau à température chambre X humidité relative de chambre
    T _C: la température dans la chambre animaux
    P _noyau: la pression à la température du corps (pression de vapeur de l'eau à la température corporelle x 1,0)
    P _t: déviation de la pression due à chaque volume courant
    V _k: injection de volume pour l'étalonnage
    P _B: pression barométrique
    
13. Une fois que le volume courant a été calculé les paramètres suivants peuvent également être déterminés:
    • Volume minute (ml / min) = V _T xf
    • Volume minute (ml / min / kg) = (V _T xf) / poids corporel (kg)
    • V _T (ml / kg) = V _T (ml) / poids corporel (kg)
    • Duty cycle inspiratoire (%) = T _i / T _tot
    • Inspiratoire Débit (ml / sec) = V _T / T _i
    • Ratio du temps d'inspiration au temps d'expiration = T _i / T _e
    • Durée totale du cycle (sec) = temps de Inspiration (s) + temps d'expiration (s)

Résultats

Lorsque cette procédure a été correctement suivie, une trace d'oscillation cohérente est créé sur le logiciel d'analyse de données. La procédure prévoit une trace des voies respiratoires en quelques minutes après l'installation des calculs informatiques simples pour déterminer les paramètres respiratoires énumérés. Figure 5 représente une trace respiratoire approprié d'une gestion de la souris (en bonne santé). Données oscillant approprié est produit lorsque l'animal ne bouge pas activement.

Discussion

La technique décrite ici est une méthode non-invasive pour l'évaluation des paramètres respiratoires des souris effrénés et non anesthésiés. Les points forts de ce protocole sont sa simplicité et de précision pour mesurer la fonction pulmonaire longitudinalement avec des objets minimaux. Il ya, cependant, des limitations et des étapes critiques à noter à propos de la procédure. Tout d'abord et surtout, la souris doit rester calme dans la chambre pour un minimum de cinq secondes. Stress supplémentaire va perturbe...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Logiciel LabChart 7 (pour Macintosh)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	utilisé à l’étape 4
du protocole PowerLab 8/30 (modèle ML870)	ADINSTRUMENTS	PL3508
Octal Bridge Amp (modèle ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Noir BNC vers BNC (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 ou version ultérieure
Surgipack Thermomètre rectal numérique	Vega Technologies	MT-918
Transducteur de pression volumétrique d’herbe PT5A	Grass Instruments Co.	Numéro de modèle PT5A, n° de série L302P4.
Seringue de 1 ml	Becton Dickinson (BD)	309628
Pipettes seringues sérologiques de 5 ml	Greiner Bio One	606160	Connectée par un tube en plastique
Balance/Balances	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	Toute balance de pesée d’une résolution de 0,1 gramme
HM40 Hygromètre et thermomètre	Vaisala	HM40A1AB
Baromètre	Baromètre World	1586
Tube de laboratoire	Dow Corning	508-101	Utilisé pour connecter la colonne d’eau à la seringue et au transducteur de pression
Chambre cylindrique en plexiglas	Dynalab Corp.		Chambre cylindrique sur mesure avec les dimensions intérieures suivantes : 50 mm (L) x 1 500 mm (L). Il y a deux couvercles de chaque côté, de dimensions 80 mm (l) x 80 mm (l). Chaque couvercle a un trou circulaire de 60 mm de large découpé sur la face du couvercle de 50 mm de profondeur. Cela permet à la chambre de s’insérer dans le couvercle. Un anneau en caoutchouc est installé autour de chaque trou du couvercle où la chambre s’adaptera. Pour la fixation de la seringue et du transducteur de pression, les ouvertures ont un diamètre de 5 mm. Pour la fixation de la sonde d’humidité, les ouvertures ont un diamètre de 25 mm.
80 % éthanol (4 L)	VWR International, Pty Ltd	BDH1162-4LP