Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Résumé

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Résumé

Les cellules souches se divisent de façon asymétrique pour générer deux cellules filles ayant un potentiel de sort inégal: une cellule souche auto-renouvellement et de différenciation d'une cellule. Compte tenu de leur importance pour le développement et la maladie, la compréhension des mécanismes qui régissent la division des cellules souches asymétrique a été une zone robuste d'étude. Parce qu'ils sont génétiquement docile et soumis à des cycles successifs de la division cellulaire environ une fois toutes les heures, les cellules souches du système nerveux central chez la drosophile, ou neuroblastes, sont des modèles indispensables pour l'étude de la division des cellules souches. Environ 100 cellules souches neurales sont situés près de la surface de chacun des deux lobes du cerveau des larves, ce qui rend ce système modèle particulièrement utile pour des études de microscopie d'imagerie en temps réel. Dans ce travail, nous passons en revue plusieurs approches couramment utilisées pour visualiser les divisions de cellules souches, et nous abordons les avantages et les inconvénients de ces techniques qui emploient indissociables contre tissus cérébraux intacts. Nous avons également en détail notre simplified protocole utilisé pour explantation cerveaux entiers de troisième stade larvaire pour l'imagerie des cellules vivantes et des applications d'analyse fixes.

Introduction

Les cellules souches de maintenir un équilibre de la différenciation et de l'auto-renouvellement pour générer la diversité cellulaire au cours du développement précoce et remplacer les cellules endommagées dans les tissus adultes. Le règlement de cette homéostasie empêche à la fois la perte et la sur-expansion de la population de cellules souches, ce qui peut entraîner une dégénérescence tissulaire néfaste ou la tumorigenèse.

Neuroblastes (NBS) sont les cellules souches neurales largement étudiés du système nerveux central chez la drosophile (figure 1A) que première forme embryonnaire pendant ^{1, 2.}....

Protocole

1. Préparation du matériel requis pour explant Brains troisième stade larvaire

1. Préparer les outils nécessaires pour microdissection.
   1. Forge deux outils de dissection (un scalpel et un crochet) en plaçant d'abord un axe de dissection unique dans chaque support de broche. Garantir les broches étroitement main et l'aide de pinces (La figure 1C).
   2. Utilisez une paire de vieilles pinces à plier une broche de dissection à un angle d'environ 120 °. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour s'assurer que la moitié supérieure de la broche à plat lorsque le support de broche est tenu dans la main. Cet outil ....

Résultats

Imagerie en temps réel a élucidé un certain nombre de mécanismes qui régulent NB ACD. Avant l'acquisition des images, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales d'imagerie. Il est nécessaire d'équilibrer le taux de capture d'image avec la durée d'imagerie des cellules vivantes. Pour l'analyse cellulaire fine, par exemple, a augmenté temporelle et la résolution optique peut être nécessaire. Quand la visualisation d'un cycle cellulaire NB unique (figure 4A), la vi.......

Discussion

Imagerie des cellules vivantes est une approche précieuse utilisée pour étudier les mécanismes qui régulent ACD de cellules souches, la différenciation des lignées cellulaires, et la morphogenèse des tissus complexes. Bien que les groupes de recherche ont toujours utilisé une variété de techniques pour visualiser NB ACD, ces approches peuvent généralement être regroupés en deux catégories qui diffèrent principalement quant à savoir si le tissu cérébral est laissé intact ou dissocié.

Imagerie.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de culture tissulaire Lumox 50 x 12 mm	Sarstedt	94.6077.410	Une boîte de culture réutilisable avec une base de film perméable aux gaz et optiquement transparente.
Schneider’s S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotique-Antimycosique (100x)	Invitrogen	15240-062	Un supplément contenant de la pénicilline (10 000 U/ml), de la streptomycine (10 000 μ ; g/ml) et l’amphotéricine B (25 μ ; g/ml) qui est ajouté au milieu S2 de Schneider pour prévenir la contamination bactérienne et fongique.
Lamelles de protection en verre, #1.5 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Huile halocarbonée 700	Sigma-Aldrich	H8898	Une huile inerte à haute viscosité, claire et incolore.
Paire de porte-goupilles nickelés, 17 cm de long	Outils scientifiques fins	26018-17
Paire de pinces Dumont #5	Outils scientifiques fins	11252-20
Aiguille/sonde de dissection avec poignée en plastique	Fisher Scientific	08-965-A
Filtre à seringue, 0,22 μ ; taille des pores	Fisher Scientific	09-719A
Seringue, 5 ml	BD Biosciences	309646
Pipette de transfert en plastique	Fisher Scientific	S30467-1
Paraformaldéhyde, 32 % de qualité EM	Microscopie électronique Sciences	15714	ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique ; il doit être manipulé dans une hotte. Suivez les directives de la fiche signalétique pour une manipulation en toute sécurité.
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate)	Invitrogen	D1306	Un colorant qui marque l’ADN et est excité par la lumière UV.