Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Les astrocytomes sont tumeur la plus fréquente primaire du cerveau et le glioblastome (GBM), un astrocytome de grade IV, est le sous-type le plus commun et agressif avec une survie médiane de ^1,2 mois 12-15. Invasion de astrocytomes diffus, en particulier GBM, s'oppose à la résection chirurgicale complète, limite l'efficacité des traitements adjuvants, et conduit inévitablement à un post-traitement récidive ^3. Les patients initialement présents soit avec de novo (primaire) GBM ou l'astrocytome de grade inférieur qui progresse inévitablement (secondaire) GBM ^4. GBM est hétérogène sur le plan génomique et caractérisé par des mutations qui s'excluent mutuellement et concomitants dans trois gènes qui régissent les voies de signalisation: la base G ₁ / S (Rb) de point de contrôle du cycle cellulaire, le récepteur tyrosine kinase (RTK), et TP53 cheminements de ^5-7. GBM est composée de quatre sous-types génomiques avec des profils d'expression distincts qui ressemblent à différents types de cellules du cerveau, suggérant que le sous-type GBM est influtionnés par sa cellule d'origine ^6,8,9. Modèles d'astrocytome de meilleure qualité sont nécessaires pour définir le rôle des combinaisons spécifiques de mutations dans certains types cellulaires au cours de l'astrocytome pathogenèse. S'appuyant sur ces modèles pour le développement préclinique de médicaments plus efficaces en fin de compte contribuer à améliorer les résultats des patients. Modèles d'astrocytome actuelles comprennent des lignées cellulaires humaines, dérivées patient xénogreffes (PDX), les astrocytes humains normaux génétiquement modifiés et les cellules souches neurales (CSN) et des souris génétiquement modifiées (GEM) ^10-14. Nous avons développé une solution de rechange, GEM non germinale (nGEM) modèle ¹⁵ utilisant des cellules cérébrales primaires - astrocytes corticaux et NSC - récoltées à partir de GEM abritant diverses combinaisons d'allèles oncogènes Floxé. L'objectif était de produire des modèles d'astrocytome avec des cellules génétiquement définies que l'on pourrait qualifier phénotypique à la fois in vitro et in vivo et potentiellement utilisés pour le développement préclinique de médicaments en isouris mmune-compétentes.

Lignées établies de cellules humaines sont le modèle le plus couramment utilisé de l'astrocytome pathogenèse et la réponse aux médicaments in vitro et in vivo. Ils sont techniquement simple, largement disponibles, et ont défini la cinétique et la tumorigénicité sur la xénogreffe orthotopique chez des souris immunodéficientes ^10,11,16-18 . Leurs inconvénients comprennent l'incapacité à générer des lignées cellulaires établies à partir des astrocytomes de bas grade, ce qui limite l'étude que pour les astrocytomes de haut grade; l'absence d'une cellule définie d'origine; la présence d'anomalies génomiques complexes, souvent avec des profils génomiques qui diffèrent nettement de l'échantillon du patient d'origine; et la susceptibilité à phénotypique et génotypique dérive pendant une série de culture dans le sérum ^11,17,19-22. Les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques individuels dans des lignées cellulaires de glioblastome humaines établies peuvent être masquées par la multitude des anomalies qui sont effectivement présents, ce qui empêche souvent elucdation des conséquences directes génotype-phénotype.

PDX sont générés par le passage sous-cutanée de cellules d'astrocytome patient isolé dans des souris immunodéficientes ou par leur culture sous forme de sphéroïdes non-adhérentes dans un milieu défini sans sérum avant l'injection orthotopique dans le cerveau de souris immunodéficientes ^12,23. PDX conserver avec plus de précision le paysage génomique d'astrocytomes humains, mais proche de lignées établies de cellules humaines, l'effet phénotypique de mutations oncogéniques individuels peuvent être masquées en raison de leur complexité génomique ^19,24. Pour définir les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques spécifiques, en particulier en réponse à de nouvelles thérapies, les panneaux de lignées cellulaires humaines établies ou PDX sont fréquemment utilisées pour établir des corrélations génotype-phénotype, montrer généralisation, et minimiser la probabilité d'effets spécifiques aux lignes cellulaires. Alors que PDX récapituler avec précision les caractéristiques histopathologiques de l'astrocytome humain, incLUDING invasion, xénogreffes orthotopiques de lignées établies de cellules humaines font généralement pas ^21,23,25. Par ailleurs, les astrocytes humains normaux et NSC ont été modifiés par génie génétique des mutations oncogéniques définis pour modéliser astrocytome la tumorigenèse in vitro et in vivo ^13,14,26. Ces cellules n'ont pas la complexité du génome de lignées cellulaires humaines établies et PDX et récapitulent précision histopathologie astrocytome humain, mais nécessitent xénogreffe chez les rongeurs immunodéprimés in vivo. Parce que tous les modèles de cellules humaines nécessitent hôtes rongeurs immunodéprimés pour prévenir le rejet de xénogreffe à médiation immunitaire, ces modèles ne permettent pas de récapituler les interactions tumeur-stroma natif d'un système syngénique et manquent d'un système immunitaire intact, ce qui limite investigation préclinique d'immuno-modulatrice du stroma ciblée et thérapies ^10,11.

GEM examen du permis de les conséquences phénotypiques de combinaisons prédéterminées de muta oncogènetions in vivo au cours de la tumorigenèse in situ. Considérant que GEM non conditionnelle ont des mutations dans tous les tissus au cours du développement, GEM conditionnelle ont floxé allèles oncogènes qui permettent le ciblage des mutations en limitant la recombinaison médiée par Cre à des types spécifiques de cellules grâce à l'utilisation de cellules promoteurs spécifiques de type ^10,11,15,18. Astrocytome GEM conditionnelle ont été utilisés pour élucider les rôles fonctionnels des mutations oncogéniques dans des types cellulaires distincts au sein d'un cerveau intact ^11. L'utilitaire préclinique de gliomagenèse in situ en utilisant GEM conditionnelle est limitée par un certain nombre de facteurs, y compris 1) l'absence d'une corrélation in vitro, 2) la difficulté à générer de grandes cohortes de souris avec des génotypes complexes, 3) longue période de latence du développement tumoral in situ , 4) et stochastique progression tumorale. Parce que la tumorigenèse in situ manque un modèle in vitro correspondant, le test de médicament in vitro ne peut être réalisée avecmodèles conditionnels classiques vec GEM. Contrairement à d'autres cancers, les modèles GEM conditionnelles des astrocytomes sont rarement induites par des mutations oncogéniques individuelles ^11. Ainsi, les programmes de sélection complexes sont nécessaires pour produire GEM conditionnelle avec de multiples mutations oncogéniques. En outre, l'astrocytome initiation se produit avec une pénétrance variable après une longue période de latence dans ces modèles, alors que la progression de l'astrocytome de haut grade se produit généralement dans un non-uniforme, stochastique manière et donne finalement naissance à des tumeurs avec des paysages génomiques complexes et de la cinétique de croissance rapide ^{27, 28.} La pénétrance variable et la nature stochastique de la progression maligne dans les modèles GEM conditionnelles exige que les souris individuelles seront examinées par imagerie radiographique pour détecter la présence et l'emplacement des astrocytomes de haut grade avant leur inscription dans les essais de médicaments précliniques. Pris ensemble, ces limites entravent la production et les essais des grandes cohortes de GEM conditionnelle requis pour prdépistage des drogues eClinique.

Le système de GEM RCAS-tva, qui utilise rétroviraux aviaires (CR) des vecteurs d'infecter GEM modifié pour exprimer le récepteur viral (tva) sur des types spécifiques de cellules neurales, a été largement utilisé pour modéliser l'astrocytome ¹¹ tumorigenèse. Contrairement à GEM conditionnelle, ce système modèle permet l'introduction de multiples mutations oncogènes des types de cellules spécifiques sans l'obligation pour les programmes de sélection complexes. Toutefois, il est limité par une pénétrance variable, l'exigence de cellules en division active pour réaliser l'intégration virale, et l'insertion aléatoire de transgènes dans le génome de l'hôte ^29.

Non germinales GEM (nGEM) modèles, qui utilisent les cellules récoltées à partir de GEM, sont de plus en plus important car ils surmonter bon nombre des limitations d'autres systèmes modèles ^15. Le rôle d'initiateur de type cellulaire et des mutations concomitants dans l'astrocytome pathogenèse sont difficiles à dissuaderla mine en utilisant des lignées de cellules humaines de glioblastome ou PDX parce qu'ils sont issus de tumeurs en phase terminale qui ont accumulé de vastes mutations génétiques dans des types cellulaires définis au cours de la progression maligne. En revanche, toutes les qualités de astrocytomes peuvent être modélisés à l'aide nGEM en induisant défini mutations génétiques dans les types de cellules du cerveau purifiés spécifiques ^11,30. Ainsi, l'influence de mutations génétiques spécifiques et le type de cellule sur des phénotypes cellulaires et moléculaires peut être déterminée in vitro et in vivo. Similaires à des lignées de cellules de glioblastome humaines établies, le test initial de médicament in vitro à l'aide nGEM peut être utilisé pour établir des priorités des médicaments pour les essais in vivo en utilisant les mêmes cellules. Tumorigenèse in vivo peut être déterminée par allogreffe de cellules nGEM orthotopique dans le cerveau de la même portée syngéniques immunocompétentes ^30. Ces modèles d'allogreffe orthotopique permettent donc de tester in vivo non seulement de classique cytotoxique unee thérapies ciblées, mais immuno-modulateur et les thérapies ciblées stroma ainsi. Enfin, le rôle du micro-environnement sur l'initiation et la progression de la tumeur peut être déterminée par la comparaison des résultats entre les modèles et nGEM GEM classiques en utilisant les mêmes mutations dans les mêmes types de cellules.

Nous et d'autres avons développé astrocytome nGEM utilisant des cellules primaires - les astrocytes, NSC, ou de cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) - récoltées à partir de GEM ^30-34. La raison d'être de l'élaboration d'un astrocytome nGEM était de créer un modèle pour déterminer les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques dans des types cellulaires spécifiques qui pourraient être utilisés pour les essais préclinique in vitro et in vivo chez l'animal immuno-compétentes. Nous avons récolté les astrocytes phénotype WT corticales et NSC à partir du non-Cre exprimant, GEM conditionnelle maintenu sur un> 94% C57 / BL6 fond avec la voie RB floxé - Rb1 ^{loxP / loxP,} ou TgGZT121 - et Floxé RTK / RAS / PI3K voie - Nf1 ^{loxP / loxP,} Kras ^G12D, PTEN ^{loxP / loxP} - gènes dans diverses combinaisons ^35-39. Nous avons provoqué la recombinaison génétique in vitro en utilisant des vecteurs adénoviraux codant pour la recombinase Cre. Étant donné que les récoltes d'astrocytes corticaux contiennent un mélange de types de cellules, nous avons utilisé des vecteurs ou des transgènes Ad5GFAPCre oncogènes dominants, tels que TgGZT ₁₂₁ entraîné par le promoteur de la GFAP humain, pour enrichir GFAP pour les astrocytes corticaux ⁺ dans ces cultures. Nous avons défini les conséquences phénotypiques de G ₁ / S (Rb), MAPK, et les mutations de la voie de la PI3K dans les astrocytes corticaux et NSC in vitro et in vivo. MAPK et PI3K activée par voie G1 / S défectueux astrocytes moléculaire imitée de glioblastome humain proneural et, lors de l'injection orthotopique, tumeurs formées dans un endroit pré-défini avec une cinétique de croissance uniformes, des latences courtes, et la histopathologiquescaractéristiques al de GBM humain ^30. Surveillance longitudinale de la croissance tumorale in vivo facilite le dépistage des drogues à travers la normalisation préclinique de cohortes de traitement et d'analyse quantitative de la croissance de la tumeur en réponse à un traitement ^40. Nous avons déterminé la cinétique de croissance de la tumeur par imagerie par bioluminescence longitudinal de souris injectées avec les astrocytes corticaux exprimant la luciférase. Par conséquent, les astrocytes corticaux et NSC dérivées de GEM conditionnelle fournissent un système de modèle souple pour la définition des conséquences fonctionnelles des mutations d'astrocytome-associé et un système de modèle potentiel pour le développement préclinique de médicaments.

Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par l'Université de Caroline du Nord institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1 Culturing corticale astrocytes de souris néonatale

1. Préparation
   1. 3.2 froisser les tissus de tâches délicates et la placer dans le fond d'un ballon contenant 70% d'éthanol. Placez ciseaux de dissection, pinces courbes et 2 paires de pince micro droites dans ce flacon. Les tissus sont utilisés pour éviter de plier les pince micro.
   2. Ajouter 1 ml de HBSS à une boîte de culture tissulaire de 60 mm. Préparer un plat séparé pour chaque animal et de maintenir les plats sur la glace.
   3. Anesthésier les animaux par les règlements institutionnels.
   4. Chaud 7 ml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine (milieu DMEM complet) pour chaque animal dans un bain d'eau à 37 °. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 1.1.1-1.1.4 aura ~ 15 min.
2. Tissus récolte
   1. Sacrifier la souris néonatale (jour 1-3) par institutiréglementation onal.
   2. Retirer des ciseaux de dissection de l'éthanol, de leur permettre de égoutter, et faire une coupe sagittale de la peau sur le crâne de la moelle épinière au nez.
   3. Faire une coupe dans le crâne le long de la suture sagittale, à partir de la moelle épinière et s'étendant au-delà des bulbes olfactifs. Prenez soin de garder les conseils de ciseaux près de la surface interne du crâne pour minimiser les lésions tissulaires de cerveau.
   4. En utilisant des pinces courbes, retirez délicatement chaque hémisphère du crâne latéralement loin du cerveau.
   5. En utilisant les micro pince droites, pincez doucement la partie dorsale de chaque hémisphère cortical et le placer dans la boîte de culture de tissu contenant HBSS. Prenez soin d'éviter le cervelet et le bulbe olfactif. Ne prenez pas n'importe quel tissu en dessous du corps calleux.
   6. En utilisant un microscope à dissection et 2 paires de pince micro, retirez délicatement les méninges de chaque hémisphère cortical. Retour la boîte de culture de tissus à la glace jusqu'à début homogenizatio de tissun.
   7. Répétez les étapes 1.2.1 par 1.2.6 pour chaque animal supplémentaire. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 1.2.1-1.2.7 aura ~ 30 min.
3. Homogénéisation des tissus
   1. En utilisant une lame de rasoir propre, dés finement hémisphères corticaux et déplacer la plaque à une hotte de culture de tissu.
   2. Transférer le tissu coupé en dés dans un tube de 15 ml conique stérile. Laver la plaque avec 1 ml de HBSS glacé et transférer dans le tube contenant le tissu.
   3. Attendez jusqu'à ce que le tissu se dépose au fond du tube, puis retirez soigneusement l'excès de HBSS aide d'une pipette.
   4. Ajouter 2 ml de la température ambiante de la trypsine / EDTA. Pipette ~ 10x avec une pipette de 1 ml de dissocier en outre des cellules.
   5. Incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 15 - 20 min. Mélanger soigneusement par inversion toutes les 5 min.
   6. Ajouter 3 ml de DMEM complet pour inhiber la trypsine. Pipette ~ 10x avec une pipette de 1 ml pour mélanger la solution.
   7. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
   8. Supprimerle surnageant avec une pipette de 1 ml. Ne pas aspirer le milieu car la pastille peut être lâche.
   9. Reprendre le culot dans 37 ml de 4 ° C DMEM complet. Transférer la suspension cellulaire à une vis de 75 cm de haut fiole de culture de tissu. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 1.3.1-1.3.9 aura ~ 50 min.
   10. Environ 16 heures après la récolte des astrocytes, laver le flacon avec 4 ml de HBSS 37 ° C, puis ajouter 4 ml de 37 ° C DMEM complet. Maintenir les astrocytes corticaux à 37 ° C dans 5% _de CO2. NOTE: L'étape de lavage est importante pour éliminer les cellules non-adhérentes et les débris à partir de la boîte de culture.
   11. Lorsque la culture est d'environ 95% de confluence, agiter une nuit à 37 ° C dans 5% de CO _2, retirez le support contenant les cellules individuelles, puis lavez le ballon avec 4 ml de 37 ° C HBSS. Ajouter 4 ml de 37 ° C compléter DMEM et maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% _de CO2. REMARQUE: Cette étape est importante pour enrichir les cultures pour les astrocytes corticaux, comme la contamination et la microgliedes cellules progénitrices d'oligodendrocytes se détachent de cette procédure et sont éliminés de la culture ^41.
   12. Répéter les étapes 1.3.1-1.3.11 pour chaque animal.
4. Induction de la recombinaison génétique
   1. 24 h après la fin de l'étape 3.1.11, remplacer le milieu avec 2 ml de 37 ° C DMEM complet. Ajouter 1 ml de 37 ° C SCM contenant 1 ul de> 10 ¹⁰ pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre. Incuber pendant 6 heures à 32 ° C dans 5% de CO ₂ .CAUTION: les mesures de sécurité lors de la manipulation utilisation BSL2 adénovirus recombinant.
   2. Retirez le support contenant le virus et ajouter 37 ° C DMEM complet sans virus aux astrocytes corticaux. ATTENTION: les mesures de sécurité lors de la manipulation BSL2 utilisation d'adénovirus recombinants et jeter les médias contenant le virus par les règlements institutionnels. REMARQUE: Pour 5 cultures d'astrocytes, les étapes 1.4.1 - 1.4.3 aura ~ 15 minutes hors de l'incubation de 6 h.
   3. Développer des cultures d'astrocytes corticaux dansvitro et in vivo caractérisation. REMARQUE: déterminer la présence de mutations suite à la recombinaison Cre par PCR avec des amorces spécifiques pour le gène recombiné ou par immunoempreintes pour soit la protéine mutée spécifique ou de ses conséquences de signalisation. Le temps nécessaire à la stabilisation phénotypique des cultures d'astrocytes corticaux après recombinaison Cre-va dépendre des mutations utilisés et doit être déterminée de manière empirique (figure 2).

2. La culture de neurones des cellules souches de souris néonatale

1. Préparation
   1. Avant de commencer la dissection, préparer 4 ml de solution de digestion par le cerveau en ajoutant 3,1 mg de papaïne et 1,3 mg de cystéine à 4 ml de milieu de dissociation - 98 mM de Na ₂ SO _4, 30 mM de K ₂ SO ₄ mM MgCl 5,8 _2, 0,25 mM de CaCl _2, , 1 mM HEPES (de 1 M HEPES pH 7,4 stock) 20 mM de glucose, 0,001% rouge de phénol, et NaOH 0,125 mM. L'addition de papaïneet la cystéine dans le milieu de dissociation tournera le jaune de la solution.
   2. Incuber à 37 ° C bain d'eau pendant 15 min. Mélanger par inversion périodique.
   3. Ajouter 0,1 M NaOH goutte à goutte jusqu'à ce que la solution de digestion retourne à la lumière rouge.
   4. Dans une hotte de culture de tissu, un filtre stérile de la solution de digestion à l'aide d'un filtre de seringue (0,22 um de taille de pore). Conserver la solution de digestion sur la glace.
   5. Préparer 50 ml de milieu sur les cellules souches (SMC) en mélangeant 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC supplément, 0,5 ml de pénicilline-streptomycine, 50 pi de 0,2% de l'héparine, 10 pi de 100 pg / ml d'EGF, et 10 pi de 100 pg / ml bFGF. SMC est stable pendant 1 semaine lorsqu'elles sont conservées à 4 ° C.
   6. Préparer complète HBSS (cHBSS) en mélangeant 50 ml de HBSS 10x 1,25 ml, 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml de 1 M de D-glucose, 5 ml de _CaCl2 100 mM, 5 ml de 100 mM de MgSO _4, et 2 ml d'une M NaHCO _3. Porter le volume total à 500 ml avec le trou DDH ₂ O.
   7. Filtre stériliser cHBSS espritha 0,2 um filtre à pores de taille et conserver à 4 ° C.
   8. 3.2 froisser les tissus de tâches délicates et la placer dans le fond d'un ballon contenant 70% d'éthanol. Placez ciseaux de dissection, pinces courbes, et 2 paires de pince micro droites dans ce flacon. Les tissus sont utilisés pour éviter de plier les pince micro. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 2.1.1-2.1.8 aura ~ 45 min.
2. Tissus récolte
   1. Sacrifiez néonatale (1-3 jours) chez la souris par des règlements institutionnels.
   2. Retirer des ciseaux de dissection de l'éthanol à 70%, de leur permettre de égoutter, et faire une coupe sagittale de la peau sur le crâne de la moelle épinière au nez.
   3. Faire une coupe dans le crâne le long de la suture sagittale, à partir de la moelle épinière et s'étendant au-delà des bulbes olfactifs. Prenez soin de garder les conseils de ciseaux près de la surface interne du crâne pour minimiser les lésions tissulaires de cerveau.
   4. En utilisant des pinces courbes, retirez délicatement chaque hémisphère du crâne latéralement à partir de lacerveau.
   5. Retirez délicatement l'ensemble du cerveau et dans la glace cHBSS froid.
   6. En utilisant un microscope de dissection, retirer délicatement les méninges du cerveau avec des outils de dissection fines.
   7. Placez le cerveau sur sa surface inférieure et enlever cervelet / cerveau postérieur et le bulbe olfactif / cortex frontal avec vertical (coronale) coupe avec un scalpel taille 11.
   8. Tourner le cerveau restant de 90 ° pour le placer sur la partie caudale, générant ainsi une vue coronale du cerveau. Repérez les ventricules latéraux.
   9. Découpez une section cubique contenant la zone sous-ventriculaire (SVZ).
   10. Transfert tissu SVZ contenant une boîte de culture de tissu de 60 mm avec de la glace fraîche cHBSS froid et le tissu mince de la taille 11 scalpel.
   11. Transférer le tissu haché dans un tube de 15 ml stérile. Placer le tube sur la glace.
   12. Laver la boîte de Pétri avec 1-2 ml de glace cHBSS froid. Transférer la solution de lavage dans le tube contenant le tissu.
   13. Répétez les étapes 2.2.1-2.2.12 avec neonata supplémentairesl souris si nécessaire. Transférer tous les tubes de 15 ml pour une hotte de culture de tissu pour le reste du protocole. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 2.2.1 - 2.2.13 aura ~ 45 min.
3. Homogénéisation des tissus
   1. Placer la solution de digestion (préparé à l'étape 2.1.1) dans un bain d'eau à 37 ° pendant 5 min. Aussi, chaud 2 ml SMC par le cerveau dans un bain-marie à 37 °.
   2. Retirez délicatement le surnageant du tissu haché avec une pipette de 1 ml. Ne pas aspirer.
   3. Ajouter 2 ml de solution à 37 ° C de la digestion par tube de 15 ml et mélanger soigneusement par retournement.
   4. Incuber à 37 ° C bain d'eau pendant 15 min. Mélanger par inversion toutes les 5 min.
   5. Ajouter un autre 2 ml de 37 ° C la solution de digestion de chaque tube et répétez l'étape 2.3.4.
   6. Permettre aux cellules de se déposer au fond du tube par gravité, puis éliminer le surnageant à partir de tissu digéré à l'aide d'une pipette de 1 ml.
   7. Ajouter 2 ml de 10 uM E-64 dilué dans cHBSS et mélanger soigneusement par retournement.
   8. Permettre aux cellules de se déposer au fond du tube par gravité, puis retirer le surnageant du tissu digéré.
   9. Ajouter 1 ml de 37 ° C cHBSS et homogénéiser à l'aide d'une pipette de 1 ml (~ 20 coups). Éviter d'injecter des bulles d'air au cours de l'homogénéisation des tissus.
   10. Faire passer l'homogénat de tissu à travers une cellule de taille de pore de 40 um tamis, puis rincer le filtre avec 5 ml de 37 ° C cHBSS.
   11. Centrifuger l'homogénat de tissu à 125 g pendant 5 min.
   12. Retirer 95% de surnageant avec une pipette de 1 ml sans perturber le culot cellulaire. Boulette de cellules remise en suspension avec précaution dans 200 ul de 37 ° C SMC avec une pointe de pipette de 200 pi.
   13. Ajouter 1,8 ml 37 ° C SMC et transférer la suspension cellulaire à un puits d'une plaque 6 puits stérile. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 2.3.1-2.3.14 aura ~ 75 min.
4. Neural Culture de cellules souches
   1. Reconstituer le milieu après trois jours en ajoutant encore 2 ml 37 °C SMC.
   2. Après 7 jours, transférer les neurosphères à un tube de 15 ml et laisser les neurosphères déposent par gravité pour> 5 min.
   3. Enlever le surnageant et ajouter 2 ml 37 ° C SMC.
   4. Transférer les neurosphères à un nouveau puits d'une plaque à 6 puits.
   5. Ajouter 2 ml de 37 ° C SMC tous les 3-4 jours, et changer complètement moyenne tous les 7 jours.
   6. Si neurosphères sont> 100 um de diamètre, dissocier soigneusement avec une solution de dissociation de cellules souches et Réensemencement le NSC à la densité cellulaire désirée.
5. Induction de la recombinaison génétique
   1. Ajouter 1 ml de 37 ° C SCM contenant 1 pi de> 10 ¹⁰ pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre à 2 ml de la SCM actuellement sur ​​les cellules. ATTENTION: L'utilisation BSL2 les précautions de sécurité lors de la manipulation adénovirus recombinant.
   2. Incuber pendant 6 heures à 32 ° C dans 5% _de CO2.
   3. Transfert SMC avec neurosphères dans un tube de 15 ml et laisser sphères se déposent par gravité pendant 5 min.
   4. Retirer le surnageant avec une première pipette de 1 ml, puis avec une pipette de 200 ul. ATTENTION: les mesures de sécurité lors de la manipulation BSL2 utilisation d'adénovirus recombinants et jeter les médias contenant le virus par les règlements institutionnels.
   5. Ajouter 2 ml de 37 ° C SMC sans virus de la NSC, puis les transférer sur une plaque à 6 puits. REMARQUE: Pour 5 cultures NSC, les étapes 2.5.1-2.5.5 aura ~ 15 minutes hors de l'incubation de 6 h.
   6. Le jour suivant, répéter les étapes 2.5.1-2.5.5, suivie de neurosphères passages lorsque nécessaire. Les sphères peuvent désormais être étendus pour 2-3 passages avant la caractérisation in vitro et l'injection orthotopique dans le cerveau de souris in vivo. REMARQUE: déterminer la présence de mutations suite à la recombinaison Cre par PCR avec des amorces spécifiques pour le gène recombiné ou par immunoempreintes pour soit la protéine mutée spécifique ou de ses conséquences de signalisation. Le temps nécessaire à la stabilisation phénotypique des cultures NSC-après recombinaison Cre dépendrasur les mutations utilisés et doivent être déterminées de façon empirique (figures 2 et 3).

3. injection orthotopique de cellules recombinés dans le cerveau du destinataire Iimmunocompetent souris

1. Préparation de 5% de cellulose de méthyle
   1. Dissoudre 5 g de 15 cPs méthyl cellulose dans de l'eau désionisée jusqu'à un volume final de 50 ml dans 100 ml d'un bouchon à vis bouteille. Ajouter la poudre lentement sous agitation à 4 ° C pour empêcher l'agglutination. Il peut prendre jusqu'à 24 heures d'agitation à 4 ° C pendant toute la cellulose de méthyle pour entrer solution.
   2. Peser la bouteille et noter le poids.
   3. Autoclave la solution de méthylcellulose à 5%. Une fois à l'autoclave, la cellulose de méthyle deviendra un gel semi-solide.
   4. Peser la bouteille et calculer le poids perdu pendant l'autoclavage.
   5. Ajouter stérilement 1 ml d'eau stérile pour chaque gramme de poids perdu.
   6. Placez sur la glace et ajouter 50 ml de glace froide 2x DMEM. </ Li>
   7. Mélanger la nuit à l'aide d'un agitateur magnétique à 4 ° C. Utiliser une technique stérile pour diviser la solution de méthylcellulose à 5% en parties aliquotes de 20 ml. aliquotes de conserver à 4 ° C pour un maximum de six mois ou jusqu'à ce que le 2x DMEM expire. REMARQUE: Préparation d'une solution à 5% de méthyl cellulose dans les étapes 3.1.1-3.1.7 aura ~ 2,5 jours.
2. Préparation des astrocytes corticaux pour injection
   1. Astrocytes corticaux récolte lorsque ~ 90% de confluence.
   2. Pour la récolte, aspiration DMEM complet et laver les plaques avec un volume égal de 37 ° C HBSS.
   3. Ajouter suffisamment de trypsine pour couvrir la plaque. Inclinez doucement, puis appuyez sur la plaque jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher.
   4. Inactiver la trypsine avec un volume égal de 37 ° C DMEM complet.
   5. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml et laver la plaque avec le même volume de 37 ° C dans du DMEM complet utilisé 3.2.4.
   6. Transfert de milieu de lavage dans le tube contenant les cellules. Centrifuger à 200 g pendant 3 min.
   7. Aspirer supernatant cellules et remettre en suspension dans 1 ml de 37 ° C DMEM complet.
   8. Compter la suspension de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un autre compteur de la cellule appropriée pour déterminer le nombre de cellules / pl.
   9. Transférez le nombre désiré de cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger à 200 g pendant 3 min.
   10. Resuspendre les cellules dans 800 ul de 37 ° C DMEM complet. Calculer le volume du culot cellulaire (volume total de suspension de cellules - 800 pi). NOTE: Il est essentiel de parvenir à une concentration cellulaire précis pour l'injection. Ainsi, le volume du culot cellulaire doit être déterminé dans cette étape de manière à calculer le volume de 5% de méthylcellulose à ajouter à l'étape 03.02.12.
   11. Transférer les cellules à un tube de 1,5 ml centrifuger stérile et puis centrifuger à 200 g pendant 3 min.
   12. Aspirer le surnageant du culot cellulaire et remettre en suspension les astrocytes corticaux dans le volume approprié de 5% de méthylcellulose glacé (volume total désiré - volume d'le culot cellulaire) afin d'obtenir le nombre désiré de cellules / pl.
   13. Placez les cellules sur la glace jusqu'à ce que l'injection.
   14. Placez une seringue en verre de 250 ul dans un antigène Distributeur Répétition puis placez une aiguille 18 G émoussé sur la seringue.
   15. Retirer lentement le piston avec l'aiguille dans la suspension des astrocytes corticale; il y aura une bulle d'air au-dessus des cellules qui doivent être éliminées, car les bulles d'air se comprimer et diminuer le volume réellement injecté dans le cerveau.
   16. Maintenez la pointe de l'aiguille juste au-dessus de la suspension des astrocytes corticaux et pousser le piston rapidement. La bulle d'air se déplace plus vite que la suspension de cellules et sera essentiellement expulsé.
   17. Répétez l'étape jusqu'à ce que tous 02/03/16 bulles d'air sont éliminées de l'aiguille.
   18. Remplir la seringue à environ ~ 200 pi, puis maintenez l'aiguille et tirez sur le piston jusqu'à ce qu'il s'arrête. Bulles d'air petits peuvent être retirés en maintenant la pointe d'aiguille et pousser rapidement le piston dans environ 50 ul puis en retirant lentement à pleine capacité.
   19. Gardez la pointe droite et répétez l'étape 3.2.18 4-5x.
   20. Jetez l'aiguille de calibre 18 et s'adapter à une aiguille 27 G sur la seringue.
   21. Appuyez sur le bouton sur le distributeur d'antigène jusqu'à ce qu'un liquide est expulsé de l'aiguille. REMARQUE: Pour une lignée cellulaire d'astrocytes, les étapes 3.2.1-3.2.21 aura ~ 60 min.
3. Préparation pour injection de NSC
   1. Lorsque neurosphères sont> 100 um de diamètre, transfert à tubes de 15 ml et laisser les neurosphères déposent par gravité pour> 5 min.
   2. Eliminer le surnageant et dissocier les neurosphères avec un réactif de dissociation douce, tels que la solution de dissociation de cellules souches ou Accutase selon les instructions du fabricant ou avec 0,05% de trypsine-EDTA comme décrit ^42.
   3. Inhiber les réactifs de dissociation selon les instructions du fabricant, sans exposer le NSC à sérum. Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
   4. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou un autre compteur de la cellule appropriée pour déterminer le nombre de cellules / pl.
   5. Transférez le nombre souhaité de NSC à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
   6. Remettre en suspension les cellules dans 800 ul de 37 ° C HBSS. Calculer le volume du culot cellulaire (volume total de suspension de cellules - 800 pi). NOTE: Il est essentiel de parvenir à une concentration cellulaire précis pour l'injection. Ainsi, le volume du culot cellulaire doit être déterminé dans cette étape de manière à calculer le volume de 5% de méthylcellulose à ajouter à l'étape 3.3.9.
   7. Transférer les cellules à un tube de 1,5 ml centrifuger stérile et puis centrifuger à 100 g pendant 5 min.
   8. Aspirer le surnageant et finir de préparer les cellules pour injection orthotopique comme dans 3.2.12-3.2.21. REMARQUE: Pour une lignée de cellules NSC, les étapes 3.3.1-3.3.9 aura ~ 60 min.
4. Préparation pour injection de souris
   1. Anesthésier l'animal receveur par une injection IP de 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoéthanol) ou 100 mg / kg de kétamine plus 10 mg / kg de xylazine, conformément aux directives institutionnelles IACUC. REMARQUE: Utilisé dans ce document sont des souris à 3-6 mois d'âge comme hôtes d'allogreffes. Souris à différents âges peut être utilisée pour étudier l'impact de microenvironnement de l'âge du cerveau de développement sur la tumorigenèse.
   2. Raser le cuir chevelu sur le site de l'incision avec une tondeuse ou des ciseaux.
   3. Stériliser le site chirurgical avec 3 tampons en alternance de 70% d'éthanol et de la bétadine.
   4. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter tout dommage dû à la perte de réflexe de clignement.
   5. Évaluer la profondeur de l'anesthésie par le retrait de la pédale (pincement de l'orteil) réflexe. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 3.4.1-3.4.5 aura ~ 15 min.
5. Implantation orthotopique
   1. Fixez l'animal dans le cadre stéréotaxique.
   2. Make une incision sur la suture sagittale environ 0,5 cm de long entre les oreilles et les yeux.
   3. Localiser l'intersection des sutures coronale et sagittale (Bregma), ainsi que le point d'intersection des fils de suture lambdoïde et sagittale (lambda). Assurez-vous que Bregma et Lambda sont dans le même plan horizontal.
   4. Fixer la seringue contenant la suspension de cellules et la répétition de l'antigène distributeur sur le cadre stéréotaxique sur la tête. Apportez la pointe de l'aiguille 27 G en contact avec Bregma. Ceci est à l'origine qui sera utilisé pour la manipulation de coordonnées tridimensionnelles.
   5. Relevez l'aiguille légèrement la surface du crâne et se déplacer de 2 mm latérales et 1 mm rostral de Bregma.
   6. Abaissez l'aiguille avec soin à travers le crâne de son mm ventrale de Bregma destination 4. NOTE: Nous avons utilisé ces coordonnées stéréotaxiques de cibler les ganglions de la base. Coordonnées stéréotaxiques différents peuvent être utilisés pour étudier l'impact de microenvironnement de différentsrégions du cerveau sur la tumorigenèse.
   7. Injecter 5 ul de la suspension cellulaire par l'activation de l'antigène distributeur répétitif une fois. Laissez l'aiguille en place pendant 2 min pour permettre la pression intracrânienne s'équilibrer.
   8. Retirer l'aiguille lentement sur une période de 30 secondes. Utilisez un coton-tige pour appliquer une pression sur tout saignement qui peut survenir.
   9. Rapprocher les bords de la plaie et fermer l'incision avec de la colle tissu. Administrer 20 ul de la lidocaïne par voie sous cutanée au niveau du site d'incision. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 3.5.1-3.5.9 aura ~ 50 min. L'UNC IACUC approuvé l'utilisation post-opératoire de l'anesthésie locale seulement. Consultation avec IACUC institutionnel local est recommandé concernant les exigences pour l'utilisation d'analgésiques postopératoires après cette procédure.
6. Soins post-chirurgicaux
   1. Placer les animaux dans une cage propre chaude pour récupérer. Animaux ne devraient pas être placés directement dans la literie, comme l'aspiration accidentelle peut se produire.
   2. Observez laanimaux pour la reprise d'un comportement normal comme la toilette, manger, et la défécation. NOTE: Reprise du comportement normal peut prendre ~ 60 min.

Nous avons développé un système modèle nGEM avec des astrocytes corticaux et NSC récoltées à partir néonatale GEM l'hébergement floxé allèles oncogènes conditionnels qui peuvent être caractérisées phénotypiquement in vitro et in vivo (figure 1). Afin d'étudier les conséquences de mutations oncogéniques spécifiquement dans les astrocytes corticaux in vitro, il est essentiel de d'abord enrichir pour les astrocytes. Récoltes astrocytes corticaux contiennent un mélange de la microglie, les astrocytes, les oligodendrocytes, et des neurones, OPC, mais des moyens mécaniques et génétiques peuvent aider à l'enrichissement de l'astrocyte. Tandis que les neurones meurent dans des conditions normales de culture, la microglie et les oligodendrocytes peuvent être enlevés en secouant la nuit 41,43. En outre, la recombinaison génétique, de floxé allèles cibles oncogéniques pour les astrocytes GFAP + en utilisant un Ad5GFAPCre peut enrichir en astrocytes. Nous avons utilisé cette méthode pour infecter les récoltes corticales de chiots Rb1 loxP / loxP GEM avec floxe Nf1 loxP / loxP et / ou PTEN loxP allèles / loxP. Ad5GFAPCre infection causée un avantage prolifératif dans la GFAP + recombiné astrocytes, ce qui a augmenté la pureté de l'astrocyte de 59% à> 90% après 5-9 passages en culture (Figures 2A et 2B). En variante, nous avons enrichi pour les astrocytes en exprimant T 121 sous le contrôle du promoteur de la GFAP pour induire un avantage prolifératif dans les astrocytes récoltées à partir de souris TgGZT 121 (figure 2C). Bien que les astrocytes corticaux poussent adhérente à la boîte de culture (figure 2C), NSC croître comme neurosphères non adhérentes in vitro (figure 3A). Les deux WT NSC et NSC avec recombiné, Floxé allèles oncogènes - TgGZT 121 (T), Kras G12D (R), et de suppression PTEN homozygote (P - / -), dénommé TRP- / - - Exprimer le marqueur Sox2 NSC, alors que seulement NSC récolté de GEM contenant TgGZT 121 express T 121 après recombinaison médiée par Cre (figure 3B).

Pour déterminer le G 1 / S (Rb), MAPK et / ou la voie de la PI3K modifications affectent la croissance de la GFAP + astrocytes in vitro, la prolifération a été examinée à l'aide de deux méthodes. MTS et le comptage des cellules a montré que l'expression de T 121 et Kras G12D augmente la prolifération des astrocytes corticaux (figures 4A et 4B). De même, homozygote Rb1 (Rb) et Nf1 (N), délétion hétérozygote combiné avec PTEN (P +/-) suppression également augmentation de la prolifération des astrocytes corticales (figure 4C). Les cellules transformées ont une capacité proliférative illimitée. Les effets de transformation de mutations peuvent être mesurées in vitro en utilisant coltests de formation ony. Nous avons donc testé les effets de transformation T de 121 et Kras G12D expression et de suppression PTEN homozygote dans TRP - / - astrocytes corticaux par un essai de formation de colonies comme décrit précédemment 44. Considérant que les astrocytes WT ne forment des colonies, T astrocytes forment des colonies à 1,03% de rendement. Notamment, TRP - / - astrocytes ont la plus haute efficacité de la formation de colonie à 6,40% (tableau 1). Afin d'être adapté pour le test préclinique de médicament, il est important que dans des modèles de tumeur in vitro être facilement manipulée génétiquement. Altérations génétiques supplémentaires peuvent être introduits de façon stable dans les astrocytes corticaux par plasmide ou des vecteurs viraux. A titre d'exemple, on transduites de manière stable le gène de la luciférase dans TRP - / - astrocytes (TRP - / - luc) à l'aide d'un vecteur rétroviral pseudotypé VSV-pMSCV. Expression de la luciférase a augmenté luminescence ~ 1000 fois par rapport aux cellules parentales ( in vitro. Nous avons montré précédemment que le traitement avec une faible dose PI-103, un inhibiteur de mTOR double / PI3K, inhibe la signalisation de PI3K, sans affecter la viabilité des cellules 30. Cependant, les effets cytostatiques / cytotoxiques élevées de PI-103 doses n'ont pas été déterminées. Ainsi, nous avons testé si PI-103 peut réduire TRP - la croissance des astrocytes in vitro - /. PI-103 a provoqué une réduction maximale de 88% du TRP - la croissance des astrocytes (Figure 4E) - /. Nous avons déjà utilisé allogreffes orthotopique de TRP - / - astrocytes de tester d'autres agents thérapeutiques cliniquement pertinentes in vivo (Schmid et al, manuscrit soumis.) 45,46. Ces données suggèrent que les astrocytes corticaux transformées récoltées à partir de GEM conditionnelle peuvent fournir un système de modèle flexible dans lequel effectuer les essais préclinique micro compétente immunitairee.

Xénogreffes de lignées cellulaires humaines établies et PDX exigent hôtes immunodéficients. Contrairement à PDX, de nombreuses lignées de cellules de glioblastome humaines établies n'ont pas récapitulent les caractéristiques histopathologiques de la GBM. Par exemple, U87MG xénogreffes orthotopiques formés tumeurs circonscrites qui ne envahissent le cerveau normal (figure 5A). En revanche, l'injection de TRP - / - astrocytes dans le cerveau de souris immunitaires compétentes, syngéniques donné tumeurs invasives que récapitulées les caractéristiques histologiques de leurs homologues humains, en particulier l'invasion de cerveau normal (figure 5B). Pour quantifier longitudinalement TRP - / - croissance d'allogreffe, les souris ont été sacrifiées tous les 5 jours après l'injection des cellules et la charge tumorale a été déterminée en quantifiant la zone de tumeur sur des coupes de cerveau H & E colorées. zone de la tumeur a augmenté de façon exponentielle au fil du temps (figure 5C). Injection orthotopique de 10 5 TRP - / - astrocytes dans recipient cerveau conduit à une morbidité neurologique, avec une survie médiane de 22 jours (Figure 5D). En plus de astrocytes corticaux, nous avons effectué des injections orthotopiques utilisant TRP - / - NSC. TRP - / - tumeurs NSC dérivées étaient 121 T positif, de prolifération, et maintenu l'expression du marqueur Sox2 NSC (Figure 6). Fait à noter, l'injection d'astrocytes corticaux et NSC récoltés dans WT souris C57Bl / 6 ainsi que les astrocytes corticaux phénotype WT ou NSC non recombiné, floxé allèles oncogènes de GEM conditionnelle n'a pas réussi à obtenir la tumorigenèse pendant ce laps de temps (données non présentées). Imagerie longitudinale in vivo a été utilisé pour surveiller la cinétique de croissance de la tumeur en réponse à des traitements médicamenteux 40. Ainsi, TRP - / - luc astrocytes ont été injectées dans le cerveau de la même portée syngéniques immunocompétentes et la croissance tumorale a été déterminée par l'imagerie série de bioluminescence. Bioluminescence a augmenté de 15 fois sur 16 jours(Figures 7A et 7B). Nous avons démontré que les astrocytes corticaux et NSC récoltées à partir de GEM conditionnelle peuvent être génétiquement modifiés et caractérisées phénotypiquement in vitro et in vivo pour la définition de la génétique et de biologie cellulaire de l'astrocytome pathogenèse et potentiellement utilisés pour le développement préclinique de médicaments.

Figure 1: Schéma d'astrocytes corticaux et récolte NSC à partir nGEM. Phénotype WT astrocytes corticaux et NSC ont été récoltées à partir de GEM avec allèles oncogènes conditionnelles. La recombinaison génétique a été induite in vitro avec un vecteur d'AdCre. Les cellules transformées ont été caractérisés phénotypiquement in vitro par divers procédés et in vivo par injection orthotopique dans le cerveau des immuno-compétent,littermates syngéniques.

Figure 2: Enrichissement de la GFAP + astrocytes sur passages en série in vitro. Images d'immunofluorescence représentatifs montrant GFAP + astrocytes récoltés dans Rb1 loxP / chiots loxP GEM avec Nf1 loxP / loxP et / ou PTEN loxP / loxP dans lequel la recombinaison génétique a été induite avec Ad5GFAPCre et les cellules à des passages X fois (PX) (A). Quantification de l'enrichissement de la GFAP + astrocytes dans le panneau A. Les barres représentent l'erreur standard 3-24 répétitions (B). Immunofluorescence représentant (en haut) et le contraste de phase (en bas) des images d'astrocytes corticaux adhérentes récoltées à partir TgGZT 121 chiots de GEM qui expriment T 121 à partir du promoteur GFAP au passage9 ans après recombinaison avec Ad5CMVCre in vitro (C). Les astrocytes ont été quantifiées par le nombre de GFAP + (cellules vertes) divisé par le nombre total de noyaux colorés au DAPI (bleu) à chaque autre passage. Les images ont été prises à un grossissement de 10X d'origine (A, C). Les barres d'échelle représentent 100 um (A, C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 WT et recombiné NSC récoltées à partir de TRP - / - GEM. Représentant des images à contraste de phase de phénotype WT (en haut) et TRP - / - (en bas) NSC cultivées comme neurosphères in vitro (A). Représentatif coloration par immunofluorescence T 121 (vert) et Sox2(Rouge) expression dans le document WT (en haut) et TRP - / - (en bas) neurosphères (B). Les barres d'échelle représentent 100 um (A, B). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 Caractérisation des astrocytes corticaux in vitro. La croissance de WT et TR astrocytes corticaux a été déterminée par comptage des cellules aux jours 1-7 (A). Densité optique relative (DO) des astrocytes corticaux WT et TR a été déterminée par MTS (B). Croissance relative de WT et Rb1 recombiné - / -; Nf1 - / -; PTEN +/- (RbNP +/-) astrocytes a été déterminée par MTS (C). Luminescence de TRP parental - / - et luciferase exprimer TRP - / - astrocytes (TRP - / - luc) (D). OD relative de TRP - / - traitées par les astrocytes PI103 pendant 5 jours comme déterminé par MTS (E). Prolifération et la dose réponse a été calculé en utilisant l'équation de la croissance exponentielle de GraphPad Prism 5. barres représentent l'erreur standard à partir de 6 répétitions par condition. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

En figure 5 gliomagenèse in vivo. Représentatif section H & E teinté d'une xénogreffe U87MG montre marges tumorales discrètes (A). H & E représentatif teinté d'un TRP - / - allogreffe montre invasion diffuse de cerveau normal (B). Barres d'échelle dans les images gauche et droite représentent H & E 1 mm et 100 pm, respectivement. zone de la tumeur a été déterminée par l'analyse sections H & E colorées de formol fixe, inclus en paraffine cerveau de la même portée, syngéniques immunitaires compétentes injectés avec 10 5 TRP - / - astrocytes et sacrifié à 5 jours intervalles post-injection. (C). Kaplan-Meier analyse de la survie de TRP - / - souris allogreffe âgés de morbidité montre une survie médiane de 22 jours (D).

Figure 6 immunofluorescence de TRP +/- allogreffes NSC. Images d'immunofluorescence représentatifs montrent que TRP +/- NSC injecté dans le cerveau de la même portée, syngéniques immunitaires compétentes exprimer T 121 (vert) et Sox2 (blanc) et proliférer, tel que déterminé par Edu (rouge) incorporation. Les souris ont été perfusés avec Edu et sacrifiés 6 semaines après l'injection et leurs cerveaux perfusés avec du paraformaldéhyde. La barre d'échelle représente 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7 imagerie longitudinale de TRP - / - allogreffes luc. Des images représentatives de bioluminescence (A) et la quantification des flux luciférase dans le temps (B) montre une croissance de TRP - / - allogreffes chez des souris immuno-compétentes, syngéniques injectés avec 10 5 TRP - / - astrocytes corticaux luc et imagés aux jours indiqués post injection.g "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1 colonie de formation d'astrocytes corticaux. WT, T et TRP - / - astrocytes corticaux ont été étalées en triple exemplaire à 4000, 2000, et de 250 cellules / puits respectivement. Les colonies ont été colorées avec du cristal violet 14 jours après placage, imagées, et coUnted ImageJ. Placage efficacité a été calculée comme le nombre de colonies, divisé par le nombre de cellules étalées.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.