Article de méthode

Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

DOI :

10.3791/51763

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12 août 2014

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les astrocytes phénotypiquement sauvages et les cellules souches neurales récoltées sur des souris modifiées avec des allèles oncogéniques conditionnels floxés et transformés par recombinaison virale médiée par Cre peuvent être utilisés pour modéliser la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo par injection orthotopique de cellules transformées dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques et immunocompétents.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les modèles actuels d’astrocytome sont limités dans leur capacité à définir les rôles des mutations oncogéniques dans des types spécifiques de cellules cérébrales au cours de la pathogenèse de la maladie et leur utilité pour le développement préclinique de médicaments. Afin de concevoir un meilleur système modèle pour ces applications, des astrocytes corticaux phénotypiquement sauvages et des cellules souches neurales (NSC) provenant de souris conditionnelles génétiquement modifiées (GEM) qui hébergent diverses combinaisons d’allèles oncogènes floxés ont été récoltés et cultivés. La recombinaison génétique a été induite in vitro à l’aide de la recombinaison adénovirale médiée par Cre, entraînant l’expression d’oncogènes mutés et la délétion de gènes suppresseurs de tumeurs. Les conséquences phénotypiques de ces mutations ont été définies en mesurant la prolifération, la transformation et la réponse aux médicaments in vitro. Des modèles d’allogreffes orthotopiques, dans lesquels des cellules transformées sont injectées de manière stéréotaxique dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques immunocompétents, ont été développés pour définir le rôle des mutations oncogéniques et du type de cellule sur la tumorigenèse in vivo. Contrairement à la plupart des xénogreffes de lignées cellulaires de glioblastome humain établies, l’injection d’astrocytes corticaux transformés dérivés de GEM dans le cerveau de compagnons de portée immunocompétents a produit des astrocytomes, y compris le sous-type le plus agressif, le glioblastome, qui récapitulait les caractéristiques histopathologiques des astrocytomes humains, y compris l’invasion diffuse du parenchyme cérébral normal. L’imagerie par bioluminescence d’allogreffes orthotopiques d’astrocytes transformés modifiés pour exprimer la luciférase a été utilisée pour surveiller la croissance tumorale in vivo au fil du temps. Ainsi, les modèles d’astrocytome utilisant des astrocytes et des NSC récoltés à partir de GEM avec des allèles oncogènes conditionnels fournissent un système intégré pour étudier la génétique et la biologie cellulaire de la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo et peuvent être utiles dans le développement préclinique de médicaments pour ces maladies dévastatrices.

Introduction

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Les astrocytomes sont tumeur la plus fréquente primaire du cerveau et le glioblastome (GBM), un astrocytome de grade IV, est le sous-type le plus commun et agressif avec une survie médiane de 1,2 mois 12-15. Invasion de astrocytomes diffus, en particulier GBM, s'oppose à la résection chirurgicale complète, limite l'efficacité des traitements adjuvants, et conduit inévitablement à un post-traitement récidive 3. Les patients initialement présents soit avec de novo (primaire) GBM ou l'astrocytome de grade inférieur qui progresse inévitablement (secondaire) GBM 4. GBM est hétérogène sur le plan génomique et caractérisé par des mutations qui s'excluent mutuellement et concomitants dans trois gènes qui régissent les voies de signalisation: la base G 1 / S (Rb) de point de contrôle du cycle cellulaire, le récepteur tyrosine kinase (RTK), et TP53 cheminements de 5-7. GBM est composée de quatre sous-types génomiques avec des profils d'expression distincts qui ressemblent à différents types de cellules du cerveau, suggérant que le sous-type GBM est influtionnés par sa cellule d'origine 6,8,9. Modèles d'astrocytome de meilleure qualité sont nécessaires pour définir le rôle des combinaisons spécifiques de mutations dans certains types cellulaires au cours de l'astrocytome pathogenèse. S'appuyant sur ces modèles pour le développement préclinique de médicaments plus efficaces en fin de compte contribuer à améliorer les résultats des patients. Modèles d'astrocytome actuelles comprennent des lignées cellulaires humaines, dérivées patient xénogreffes (PDX), les astrocytes humains normaux génétiquement modifiés et les cellules souches neurales (CSN) et des souris génétiquement modifiées (GEM) 10-14. Nous avons développé une solution de rechange, GEM non germinale (nGEM) modèle 15 utilisant des cellules cérébrales primaires - astrocytes corticaux et NSC - récoltées à partir de GEM abritant diverses combinaisons d'allèles oncogènes Floxé. L'objectif était de produire des modèles d'astrocytome avec des cellules génétiquement définies que l'on pourrait qualifier phénotypique à la fois in vitro et in vivo et potentiellement utilisés pour le développement préclinique de médicaments en isouris mmune-compétentes.

Lignées établies de cellules humaines sont le modèle le plus couramment utilisé de l'astrocytome pathogenèse et la réponse aux médicaments in vitro et in vivo. Ils sont techniquement simple, largement disponibles, et ont défini la cinétique et la tumorigénicité sur la xénogreffe orthotopique chez des souris immunodéficientes 10,11,16-18 . Leurs inconvénients comprennent l'incapacité à générer des lignées cellulaires établies à partir des astrocytomes de bas grade, ce qui limite l'étude que pour les astrocytomes de haut grade; l'absence d'une cellule définie d'origine; la présence d'anomalies génomiques complexes, souvent avec des profils génomiques qui diffèrent nettement de l'échantillon du patient d'origine; et la susceptibilité à phénotypique et génotypique dérive pendant une série de culture dans le sérum 11,17,19-22. Les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques individuels dans des lignées cellulaires de glioblastome humaines établies peuvent être masquées par la multitude des anomalies qui sont effectivement présents, ce qui empêche souvent elucdation des conséquences directes génotype-phénotype.

PDX sont générés par le passage sous-cutanée de cellules d'astrocytome patient isolé dans des souris immunodéficientes ou par leur culture sous forme de sphéroïdes non-adhérentes dans un milieu défini sans sérum avant l'injection orthotopique dans le cerveau de souris immunodéficientes 12,23. PDX conserver avec plus de précision le paysage génomique d'astrocytomes humains, mais proche de lignées établies de cellules humaines, l'effet phénotypique de mutations oncogéniques individuels peuvent être masquées en raison de leur complexité génomique 19,24. Pour définir les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques spécifiques, en particulier en réponse à de nouvelles thérapies, les panneaux de lignées cellulaires humaines établies ou PDX sont fréquemment utilisées pour établir des corrélations génotype-phénotype, montrer généralisation, et minimiser la probabilité d'effets spécifiques aux lignes cellulaires. Alors que PDX récapituler avec précision les caractéristiques histopathologiques de l'astrocytome humain, incLUDING invasion, xénogreffes orthotopiques de lignées établies de cellules humaines font généralement pas 21,23,25. Par ailleurs, les astrocytes humains normaux et NSC ont été modifiés par génie génétique des mutations oncogéniques définis pour modéliser astrocytome la tumorigenèse in vitro et in vivo 13,14,26. Ces cellules n'ont pas la complexité du génome de lignées cellulaires humaines établies et PDX et récapitulent précision histopathologie astrocytome humain, mais nécessitent xénogreffe chez les rongeurs immunodéprimés in vivo. Parce que tous les modèles de cellules humaines nécessitent hôtes rongeurs immunodéprimés pour prévenir le rejet de xénogreffe à médiation immunitaire, ces modèles ne permettent pas de récapituler les interactions tumeur-stroma natif d'un système syngénique et manquent d'un système immunitaire intact, ce qui limite investigation préclinique d'immuno-modulatrice du stroma ciblée et thérapies 10,11.

GEM examen du permis de les conséquences phénotypiques de combinaisons prédéterminées de muta oncogènetions in vivo au cours de la tumorigenèse in situ. Considérant que GEM non conditionnelle ont des mutations dans tous les tissus au cours du développement, GEM conditionnelle ont floxé allèles oncogènes qui permettent le ciblage des mutations en limitant la recombinaison médiée par Cre à des types spécifiques de cellules grâce à l'utilisation de cellules promoteurs spécifiques de type 10,11,15,18. Astrocytome GEM conditionnelle ont été utilisés pour élucider les rôles fonctionnels des mutations oncogéniques dans des types cellulaires distincts au sein d'un cerveau intact 11. L'utilitaire préclinique de gliomagenèse in situ en utilisant GEM conditionnelle est limitée par un certain nombre de facteurs, y compris 1) l'absence d'une corrélation in vitro, 2) la difficulté à générer de grandes cohortes de souris avec des génotypes complexes, 3) longue période de latence du développement tumoral in situ , 4) et stochastique progression tumorale. Parce que la tumorigenèse in situ manque un modèle in vitro correspondant, le test de médicament in vitro ne peut être réalisée avecmodèles conditionnels classiques vec GEM. Contrairement à d'autres cancers, les modèles GEM conditionnelles des astrocytomes sont rarement induites par des mutations oncogéniques individuelles 11. Ainsi, les programmes de sélection complexes sont nécessaires pour produire GEM conditionnelle avec de multiples mutations oncogéniques. En outre, l'astrocytome initiation se produit avec une pénétrance variable après une longue période de latence dans ces modèles, alors que la progression de l'astrocytome de haut grade se produit généralement dans un non-uniforme, stochastique manière et donne finalement naissance à des tumeurs avec des paysages génomiques complexes et de la cinétique de croissance rapide 27, 28. La pénétrance variable et la nature stochastique de la progression maligne dans les modèles GEM conditionnelles exige que les souris individuelles seront examinées par imagerie radiographique pour détecter la présence et l'emplacement des astrocytomes de haut grade avant leur inscription dans les essais de médicaments précliniques. Pris ensemble, ces limites entravent la production et les essais des grandes cohortes de GEM conditionnelle requis pour prdépistage des drogues eClinique.

Le système de GEM RCAS-tva, qui utilise rétroviraux aviaires (CR) des vecteurs d'infecter GEM modifié pour exprimer le récepteur viral (tva) sur des types spécifiques de cellules neurales, a été largement utilisé pour modéliser l'astrocytome 11 tumorigenèse. Contrairement à GEM conditionnelle, ce système modèle permet l'introduction de multiples mutations oncogènes des types de cellules spécifiques sans l'obligation pour les programmes de sélection complexes. Toutefois, il est limité par une pénétrance variable, l'exigence de cellules en division active pour réaliser l'intégration virale, et l'insertion aléatoire de transgènes dans le génome de l'hôte 29.

Non germinales GEM (nGEM) modèles, qui utilisent les cellules récoltées à partir de GEM, sont de plus en plus important car ils surmonter bon nombre des limitations d'autres systèmes modèles 15. Le rôle d'initiateur de type cellulaire et des mutations concomitants dans l'astrocytome pathogenèse sont difficiles à dissuaderla mine en utilisant des lignées de cellules humaines de glioblastome ou PDX parce qu'ils sont issus de tumeurs en phase terminale qui ont accumulé de vastes mutations génétiques dans des types cellulaires définis au cours de la progression maligne. En revanche, toutes les qualités de astrocytomes peuvent être modélisés à l'aide nGEM en induisant défini mutations génétiques dans les types de cellules du cerveau purifiés spécifiques 11,30. Ainsi, l'influence de mutations génétiques spécifiques et le type de cellule sur des phénotypes cellulaires et moléculaires peut être déterminée in vitro et in vivo. Similaires à des lignées de cellules de glioblastome humaines établies, le test initial de médicament in vitro à l'aide nGEM peut être utilisé pour établir des priorités des médicaments pour les essais in vivo en utilisant les mêmes cellules. Tumorigenèse in vivo peut être déterminée par allogreffe de cellules nGEM orthotopique dans le cerveau de la même portée syngéniques immunocompétentes 30. Ces modèles d'allogreffe orthotopique permettent donc de tester in vivo non seulement de classique cytotoxique unee thérapies ciblées, mais immuno-modulateur et les thérapies ciblées stroma ainsi. Enfin, le rôle du micro-environnement sur l'initiation et la progression de la tumeur peut être déterminée par la comparaison des résultats entre les modèles et nGEM GEM classiques en utilisant les mêmes mutations dans les mêmes types de cellules.

Nous et d'autres avons développé astrocytome nGEM utilisant des cellules primaires - les astrocytes, NSC, ou de cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) - récoltées à partir de GEM 30-34. La raison d'être de l'élaboration d'un astrocytome nGEM était de créer un modèle pour déterminer les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques dans des types cellulaires spécifiques qui pourraient être utilisés pour les essais préclinique in vitro et in vivo chez l'animal immuno-compétentes. Nous avons récolté les astrocytes phénotype WT corticales et NSC à partir du non-Cre exprimant, GEM conditionnelle maintenu sur un> 94% C57 / BL6 fond avec la voie RB floxé - Rb1 loxP / loxP, ou TgGZT121 - et Floxé RTK / RAS / PI3K voie - Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP - gènes dans diverses combinaisons 35-39. Nous avons provoqué la recombinaison génétique in vitro en utilisant des vecteurs adénoviraux codant pour la recombinase Cre. Étant donné que les récoltes d'astrocytes corticaux contiennent un mélange de types de cellules, nous avons utilisé des vecteurs ou des transgènes Ad5GFAPCre oncogènes dominants, tels que TgGZT 121 entraîné par le promoteur de la GFAP humain, pour enrichir GFAP pour les astrocytes corticaux + dans ces cultures. Nous avons défini les conséquences phénotypiques de G 1 / S (Rb), MAPK, et les mutations de la voie de la PI3K dans les astrocytes corticaux et NSC in vitro et in vivo. MAPK et PI3K activée par voie G1 / S défectueux astrocytes moléculaire imitée de glioblastome humain proneural et, lors de l'injection orthotopique, tumeurs formées dans un endroit pré-défini avec une cinétique de croissance uniformes, des latences courtes, et la histopathologiquescaractéristiques al de GBM humain 30. Surveillance longitudinale de la croissance tumorale in vivo facilite le dépistage des drogues à travers la normalisation préclinique de cohortes de traitement et d'analyse quantitative de la croissance de la tumeur en réponse à un traitement 40. Nous avons déterminé la cinétique de croissance de la tumeur par imagerie par bioluminescence longitudinal de souris injectées avec les astrocytes corticaux exprimant la luciférase. Par conséquent, les astrocytes corticaux et NSC dérivées de GEM conditionnelle fournissent un système de modèle souple pour la définition des conséquences fonctionnelles des mutations d'astrocytome-associé et un système de modèle potentiel pour le développement préclinique de médicaments.

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Protocole

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Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par l'Université de Caroline du Nord institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.

1 Culturing corticale astrocytes de souris néonatale

  1. Préparation
    1. 3.2 froisser les tissus de tâches délicates et la placer dans le fond d'un ballon contenant 70% d'éthanol. Placez ciseaux de dissection, pinces courbes et 2 paires de pince micro droites dans ce flacon. Les tissus sont utilisés pour éviter de plier les pince micro.
    2. Ajouter 1 ml de HBSS à une boîte de culture tissulaire de 60 mm. Préparer un plat séparé pour chaque animal et de maintenir les plats sur la glace.
    3. Anesthésier les animaux par les règlements institutionnels.
    4. Chaud 7 ml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine (milieu DMEM complet) pour chaque animal dans un bain d'eau à 37 °. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 1.1.1-1.1.4 aura ~ 15 min.
  2. Tissus récolte
    1. Sacrifier la souris néonatale (jour 1-3) par institutiréglementation onal.
    2. Retirer des ciseaux de dissection de l'éthanol, de leur permettre de égoutter, et faire une coupe sagittale de la peau sur le crâne de la moelle épinière au nez.
    3. Faire une coupe dans le crâne le long de la suture sagittale, à partir de la moelle épinière et s'étendant au-delà des bulbes olfactifs. Prenez soin de garder les conseils de ciseaux près de la surface interne du crâne pour minimiser les lésions tissulaires de cerveau.
    4. En utilisant des pinces courbes, retirez délicatement chaque hémisphère du crâne latéralement loin du cerveau.
    5. En utilisant les micro pince droites, pincez doucement la partie dorsale de chaque hémisphère cortical et le placer dans la boîte de culture de tissu contenant HBSS. Prenez soin d'éviter le cervelet et le bulbe olfactif. Ne prenez pas n'importe quel tissu en dessous du corps calleux.
    6. En utilisant un microscope à dissection et 2 paires de pince micro, retirez délicatement les méninges de chaque hémisphère cortical. Retour la boîte de culture de tissus à la glace jusqu'à début homogenizatio de tissun.
    7. Répétez les étapes 1.2.1 par 1.2.6 pour chaque animal supplémentaire. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 1.2.1-1.2.7 aura ~ 30 min.
  3. Homogénéisation des tissus
    1. En utilisant une lame de rasoir propre, dés finement hémisphères corticaux et déplacer la plaque à une hotte de culture de tissu.
    2. Transférer le tissu coupé en dés dans un tube de 15 ml conique stérile. Laver la plaque avec 1 ml de HBSS glacé et transférer dans le tube contenant le tissu.
    3. Attendez jusqu'à ce que le tissu se dépose au fond du tube, puis retirez soigneusement l'excès de HBSS aide d'une pipette.
    4. Ajouter 2 ml de la température ambiante de la trypsine / EDTA. Pipette ~ 10x avec une pipette de 1 ml de dissocier en outre des cellules.
    5. Incuber la suspension de cellules à 37 ° C pendant 15 - 20 min. Mélanger soigneusement par inversion toutes les 5 min.
    6. Ajouter 3 ml de DMEM complet pour inhiber la trypsine. Pipette ~ 10x avec une pipette de 1 ml pour mélanger la solution.
    7. Centrifuger à 200 g pendant 5 min à température ambiante.
    8. Supprimerle surnageant avec une pipette de 1 ml. Ne pas aspirer le milieu car la pastille peut être lâche.
    9. Reprendre le culot dans 37 ml de 4 ° C DMEM complet. Transférer la suspension cellulaire à une vis de 75 cm de haut fiole de culture de tissu. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 1.3.1-1.3.9 aura ~ 50 min.
    10. Environ 16 heures après la récolte des astrocytes, laver le flacon avec 4 ml de HBSS 37 ° C, puis ajouter 4 ml de 37 ° C DMEM complet. Maintenir les astrocytes corticaux à 37 ° C dans 5% de CO2. NOTE: L'étape de lavage est importante pour éliminer les cellules non-adhérentes et les débris à partir de la boîte de culture.
    11. Lorsque la culture est d'environ 95% de confluence, agiter une nuit à 37 ° C dans 5% de CO 2, retirez le support contenant les cellules individuelles, puis lavez le ballon avec 4 ml de 37 ° C HBSS. Ajouter 4 ml de 37 ° C compléter DMEM et maintenir les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2. REMARQUE: Cette étape est importante pour enrichir les cultures pour les astrocytes corticaux, comme la contamination et la microgliedes cellules progénitrices d'oligodendrocytes se détachent de cette procédure et sont éliminés de la culture 41.
    12. Répéter les étapes 1.3.1-1.3.11 pour chaque animal.
  4. Induction de la recombinaison génétique
    1. 24 h après la fin de l'étape 3.1.11, remplacer le milieu avec 2 ml de 37 ° C DMEM complet. Ajouter 1 ml de 37 ° C SCM contenant 1 ul de> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre. Incuber pendant 6 heures à 32 ° C dans 5% de CO 2 .CAUTION: les mesures de sécurité lors de la manipulation utilisation BSL2 adénovirus recombinant.
    2. Retirez le support contenant le virus et ajouter 37 ° C DMEM complet sans virus aux astrocytes corticaux. ATTENTION: les mesures de sécurité lors de la manipulation BSL2 utilisation d'adénovirus recombinants et jeter les médias contenant le virus par les règlements institutionnels. REMARQUE: Pour 5 cultures d'astrocytes, les étapes 1.4.1 - 1.4.3 aura ~ 15 minutes hors de l'incubation de 6 h.
    3. Développer des cultures d'astrocytes corticaux dansvitro et in vivo caractérisation. REMARQUE: déterminer la présence de mutations suite à la recombinaison Cre par PCR avec des amorces spécifiques pour le gène recombiné ou par immunoempreintes pour soit la protéine mutée spécifique ou de ses conséquences de signalisation. Le temps nécessaire à la stabilisation phénotypique des cultures d'astrocytes corticaux après recombinaison Cre-va dépendre des mutations utilisés et doit être déterminée de manière empirique (figure 2).

2. La culture de neurones des cellules souches de souris néonatale

  1. Préparation
    1. Avant de commencer la dissection, préparer 4 ml de solution de digestion par le cerveau en ajoutant 3,1 mg de papaïne et 1,3 mg de cystéine à 4 ml de milieu de dissociation - 98 mM de Na 2 SO 4, 30 mM de K 2 SO 4 mM MgCl 5,8 2, 0,25 mM de CaCl 2, , 1 mM HEPES (de 1 M HEPES pH 7,4 stock) 20 mM de glucose, 0,001% rouge de phénol, et NaOH 0,125 mM. L'addition de papaïneet la cystéine dans le milieu de dissociation tournera le jaune de la solution.
    2. Incuber à 37 ° C bain d'eau pendant 15 min. Mélanger par inversion périodique.
    3. Ajouter 0,1 M NaOH goutte à goutte jusqu'à ce que la solution de digestion retourne à la lumière rouge.
    4. Dans une hotte de culture de tissu, un filtre stérile de la solution de digestion à l'aide d'un filtre de seringue (0,22 um de taille de pore). Conserver la solution de digestion sur la glace.
    5. Préparer 50 ml de milieu sur les cellules souches (SMC) en mélangeant 44,5 ml NSC Basal Medium, 5 ml NSC supplément, 0,5 ml de pénicilline-streptomycine, 50 pi de 0,2% de l'héparine, 10 pi de 100 pg / ml d'EGF, et 10 pi de 100 pg / ml bFGF. SMC est stable pendant 1 semaine lorsqu'elles sont conservées à 4 ° C.
    6. Préparer complète HBSS (cHBSS) en mélangeant 50 ml de HBSS 10x 1,25 ml, 1 M HEPES (pH 7,4), 15 ml de 1 M de D-glucose, 5 ml de CaCl2 100 mM, 5 ml de 100 mM de MgSO 4, et 2 ml d'une M NaHCO 3. Porter le volume total à 500 ml avec le trou DDH 2 O.
    7. Filtre stériliser cHBSS espritha 0,2 um filtre à pores de taille et conserver à 4 ° C.
    8. 3.2 froisser les tissus de tâches délicates et la placer dans le fond d'un ballon contenant 70% d'éthanol. Placez ciseaux de dissection, pinces courbes, et 2 paires de pince micro droites dans ce flacon. Les tissus sont utilisés pour éviter de plier les pince micro. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 2.1.1-2.1.8 aura ~ 45 min.
  2. Tissus récolte
    1. Sacrifiez néonatale (1-3 jours) chez la souris par des règlements institutionnels.
    2. Retirer des ciseaux de dissection de l'éthanol à 70%, de leur permettre de égoutter, et faire une coupe sagittale de la peau sur le crâne de la moelle épinière au nez.
    3. Faire une coupe dans le crâne le long de la suture sagittale, à partir de la moelle épinière et s'étendant au-delà des bulbes olfactifs. Prenez soin de garder les conseils de ciseaux près de la surface interne du crâne pour minimiser les lésions tissulaires de cerveau.
    4. En utilisant des pinces courbes, retirez délicatement chaque hémisphère du crâne latéralement à partir de lacerveau.
    5. Retirez délicatement l'ensemble du cerveau et dans la glace cHBSS froid.
    6. En utilisant un microscope de dissection, retirer délicatement les méninges du cerveau avec des outils de dissection fines.
    7. Placez le cerveau sur sa surface inférieure et enlever cervelet / cerveau postérieur et le bulbe olfactif / cortex frontal avec vertical (coronale) coupe avec un scalpel taille 11.
    8. Tourner le cerveau restant de 90 ° pour le placer sur la partie caudale, générant ainsi une vue coronale du cerveau. Repérez les ventricules latéraux.
    9. Découpez une section cubique contenant la zone sous-ventriculaire (SVZ).
    10. Transfert tissu SVZ contenant une boîte de culture de tissu de 60 mm avec de la glace fraîche cHBSS froid et le tissu mince de la taille 11 scalpel.
    11. Transférer le tissu haché dans un tube de 15 ml stérile. Placer le tube sur la glace.
    12. Laver la boîte de Pétri avec 1-2 ml de glace cHBSS froid. Transférer la solution de lavage dans le tube contenant le tissu.
    13. Répétez les étapes 2.2.1-2.2.12 avec neonata supplémentairesl souris si nécessaire. Transférer tous les tubes de 15 ml pour une hotte de culture de tissu pour le reste du protocole. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 2.2.1 - 2.2.13 aura ~ 45 min.
  3. Homogénéisation des tissus
    1. Placer la solution de digestion (préparé à l'étape 2.1.1) dans un bain d'eau à 37 ° pendant 5 min. Aussi, chaud 2 ml SMC par le cerveau dans un bain-marie à 37 °.
    2. Retirez délicatement le surnageant du tissu haché avec une pipette de 1 ml. Ne pas aspirer.
    3. Ajouter 2 ml de solution à 37 ° C de la digestion par tube de 15 ml et mélanger soigneusement par retournement.
    4. Incuber à 37 ° C bain d'eau pendant 15 min. Mélanger par inversion toutes les 5 min.
    5. Ajouter un autre 2 ml de 37 ° C la solution de digestion de chaque tube et répétez l'étape 2.3.4.
    6. Permettre aux cellules de se déposer au fond du tube par gravité, puis éliminer le surnageant à partir de tissu digéré à l'aide d'une pipette de 1 ml.
    7. Ajouter 2 ml de 10 uM E-64 dilué dans cHBSS et mélanger soigneusement par retournement.
    8. Incuber pendant 3 min à température ambiante.
    9. Permettre aux cellules de se déposer au fond du tube par gravité, puis retirer le surnageant du tissu digéré.
    10. Ajouter 1 ml de 37 ° C cHBSS et homogénéiser à l'aide d'une pipette de 1 ml (~ 20 coups). Éviter d'injecter des bulles d'air au cours de l'homogénéisation des tissus.
    11. Faire passer l'homogénat de tissu à travers une cellule de taille de pore de 40 um tamis, puis rincer le filtre avec 5 ml de 37 ° C cHBSS.
    12. Centrifuger l'homogénat de tissu à 125 g pendant 5 min.
    13. Retirer 95% de surnageant avec une pipette de 1 ml sans perturber le culot cellulaire. Boulette de cellules remise en suspension avec précaution dans 200 ul de 37 ° C SMC avec une pointe de pipette de 200 pi.
    14. Ajouter 1,8 ml 37 ° C SMC et transférer la suspension cellulaire à un puits d'une plaque 6 puits stérile. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 2.3.1-2.3.14 aura ~ 75 min.
  4. Neural Culture de cellules souches
    1. Reconstituer le milieu après trois jours en ajoutant encore 2 ml 37 °C SMC.
    2. Après 7 jours, transférer les neurosphères à un tube de 15 ml et laisser les neurosphères déposent par gravité pour> 5 min.
    3. Enlever le surnageant et ajouter 2 ml 37 ° C SMC.
    4. Transférer les neurosphères à un nouveau puits d'une plaque à 6 puits.
    5. Ajouter 2 ml de 37 ° C SMC tous les 3-4 jours, et changer complètement moyenne tous les 7 jours.
    6. Si neurosphères sont> 100 um de diamètre, dissocier soigneusement avec une solution de dissociation de cellules souches et Réensemencement le NSC à la densité cellulaire désirée.
  5. Induction de la recombinaison génétique
    1. Ajouter 1 ml de 37 ° C SCM contenant 1 pi de> 10 10 pfu / ml de Ad5CMVCre ou Ad5GFAPCre à 2 ml de la SCM actuellement sur ​​les cellules. ATTENTION: L'utilisation BSL2 les précautions de sécurité lors de la manipulation adénovirus recombinant.
    2. Incuber pendant 6 heures à 32 ° C dans 5% de CO2.
    3. Transfert SMC avec neurosphères dans un tube de 15 ml et laisser sphères se déposent par gravité pendant 5 min.
    4. Retirer le surnageant avec une première pipette de 1 ml, puis avec une pipette de 200 ul. ATTENTION: les mesures de sécurité lors de la manipulation BSL2 utilisation d'adénovirus recombinants et jeter les médias contenant le virus par les règlements institutionnels.
    5. Ajouter 2 ml de 37 ° C SMC sans virus de la NSC, puis les transférer sur une plaque à 6 puits. REMARQUE: Pour 5 cultures NSC, les étapes 2.5.1-2.5.5 aura ~ 15 minutes hors de l'incubation de 6 h.
    6. Le jour suivant, répéter les étapes 2.5.1-2.5.5, suivie de neurosphères passages lorsque nécessaire. Les sphères peuvent désormais être étendus pour 2-3 passages avant la caractérisation in vitro et l'injection orthotopique dans le cerveau de souris in vivo. REMARQUE: déterminer la présence de mutations suite à la recombinaison Cre par PCR avec des amorces spécifiques pour le gène recombiné ou par immunoempreintes pour soit la protéine mutée spécifique ou de ses conséquences de signalisation. Le temps nécessaire à la stabilisation phénotypique des cultures NSC-après recombinaison Cre dépendrasur les mutations utilisés et doivent être déterminées de façon empirique (figures 2 et 3).

3. injection orthotopique de cellules recombinés dans le cerveau du destinataire Iimmunocompetent souris

  1. Préparation de 5% de cellulose de méthyle
    1. Dissoudre 5 g de 15 cPs méthyl cellulose dans de l'eau désionisée jusqu'à un volume final de 50 ml dans 100 ml d'un bouchon à vis bouteille. Ajouter la poudre lentement sous agitation à 4 ° C pour empêcher l'agglutination. Il peut prendre jusqu'à 24 heures d'agitation à 4 ° C pendant toute la cellulose de méthyle pour entrer solution.
    2. Peser la bouteille et noter le poids.
    3. Autoclave la solution de méthylcellulose à 5%. Une fois à l'autoclave, la cellulose de méthyle deviendra un gel semi-solide.
    4. Peser la bouteille et calculer le poids perdu pendant l'autoclavage.
    5. Ajouter stérilement 1 ml d'eau stérile pour chaque gramme de poids perdu.
    6. Placez sur la glace et ajouter 50 ml de glace froide 2x DMEM.
    7. Mélanger la nuit à l'aide d'un agitateur magnétique à 4 ° C. Utiliser une technique stérile pour diviser la solution de méthylcellulose à 5% en parties aliquotes de 20 ml. aliquotes de conserver à 4 ° C pour un maximum de six mois ou jusqu'à ce que le 2x DMEM expire. REMARQUE: Préparation d'une solution à 5% de méthyl cellulose dans les étapes 3.1.1-3.1.7 aura ~ 2,5 jours.
  2. Préparation des astrocytes corticaux pour injection
    1. Astrocytes corticaux récolte lorsque ~ 90% de confluence.
    2. Pour la récolte, aspiration DMEM complet et laver les plaques avec un volume égal de 37 ° C HBSS.
    3. Ajouter suffisamment de trypsine pour couvrir la plaque. Inclinez doucement, puis appuyez sur la plaque jusqu'à ce que les cellules commencent à se détacher.
    4. Inactiver la trypsine avec un volume égal de 37 ° C DMEM complet.
    5. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml et laver la plaque avec le même volume de 37 ° C dans du DMEM complet utilisé 3.2.4.
    6. Transfert de milieu de lavage dans le tube contenant les cellules. Centrifuger à 200 g pendant 3 min.
    7. Aspirer supernatant cellules et remettre en suspension dans 1 ml de 37 ° C DMEM complet.
    8. Compter la suspension de cellules en utilisant un hémocytomètre ou un autre compteur de la cellule appropriée pour déterminer le nombre de cellules / pl.
    9. Transférez le nombre désiré de cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger à 200 g pendant 3 min.
    10. Resuspendre les cellules dans 800 ul de 37 ° C DMEM complet. Calculer le volume du culot cellulaire (volume total de suspension de cellules - 800 pi). NOTE: Il est essentiel de parvenir à une concentration cellulaire précis pour l'injection. Ainsi, le volume du culot cellulaire doit être déterminé dans cette étape de manière à calculer le volume de 5% de méthylcellulose à ajouter à l'étape 03.02.12.
    11. Transférer les cellules à un tube de 1,5 ml centrifuger stérile et puis centrifuger à 200 g pendant 3 min.
    12. Aspirer le surnageant du culot cellulaire et remettre en suspension les astrocytes corticaux dans le volume approprié de 5% de méthylcellulose glacé (volume total désiré - volume d'le culot cellulaire) afin d'obtenir le nombre désiré de cellules / pl.
    13. Placez les cellules sur la glace jusqu'à ce que l'injection.
    14. Placez une seringue en verre de 250 ul dans un antigène Distributeur Répétition puis placez une aiguille 18 G émoussé sur la seringue.
    15. Retirer lentement le piston avec l'aiguille dans la suspension des astrocytes corticale; il y aura une bulle d'air au-dessus des cellules qui doivent être éliminées, car les bulles d'air se comprimer et diminuer le volume réellement injecté dans le cerveau.
    16. Maintenez la pointe de l'aiguille juste au-dessus de la suspension des astrocytes corticaux et pousser le piston rapidement. La bulle d'air se déplace plus vite que la suspension de cellules et sera essentiellement expulsé.
    17. Répétez l'étape jusqu'à ce que tous 02/03/16 bulles d'air sont éliminées de l'aiguille.
    18. Remplir la seringue à environ ~ 200 pi, puis maintenez l'aiguille et tirez sur le piston jusqu'à ce qu'il s'arrête. Bulles d'air petits peuvent être retirés en maintenant la pointe d'aiguille et pousser rapidement le piston dans environ 50 ul puis en retirant lentement à pleine capacité.
    19. Gardez la pointe droite et répétez l'étape 3.2.18 4-5x.
    20. Jetez l'aiguille de calibre 18 et s'adapter à une aiguille 27 G sur la seringue.
    21. Appuyez sur le bouton sur le distributeur d'antigène jusqu'à ce qu'un liquide est expulsé de l'aiguille. REMARQUE: Pour une lignée cellulaire d'astrocytes, les étapes 3.2.1-3.2.21 aura ~ 60 min.
  3. Préparation pour injection de NSC
    1. Lorsque neurosphères sont> 100 um de diamètre, transfert à tubes de 15 ml et laisser les neurosphères déposent par gravité pour> 5 min.
    2. Eliminer le surnageant et dissocier les neurosphères avec un réactif de dissociation douce, tels que la solution de dissociation de cellules souches ou Accutase selon les instructions du fabricant ou avec 0,05% de trypsine-EDTA comme décrit 42.
    3. Inhiber les réactifs de dissociation selon les instructions du fabricant, sans exposer le NSC à sérum. Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
    4. Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 37 ° C à cHBSS générer une suspension de cellules isolées.
    5. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou un autre compteur de la cellule appropriée pour déterminer le nombre de cellules / pl.
    6. Transférez le nombre souhaité de NSC à un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
    7. Remettre en suspension les cellules dans 800 ul de 37 ° C HBSS. Calculer le volume du culot cellulaire (volume total de suspension de cellules - 800 pi). NOTE: Il est essentiel de parvenir à une concentration cellulaire précis pour l'injection. Ainsi, le volume du culot cellulaire doit être déterminé dans cette étape de manière à calculer le volume de 5% de méthylcellulose à ajouter à l'étape 3.3.9.
    8. Transférer les cellules à un tube de 1,5 ml centrifuger stérile et puis centrifuger à 100 g pendant 5 min.
    9. Aspirer le surnageant et finir de préparer les cellules pour injection orthotopique comme dans 3.2.12-3.2.21. REMARQUE: Pour une lignée de cellules NSC, les étapes 3.3.1-3.3.9 aura ~ 60 min.
  4. Préparation pour injection de souris
    1. Anesthésier l'animal receveur par une injection IP de 250 mg / kg Avertin (2,2,2 tribromoéthanol) ou 100 mg / kg de kétamine plus 10 mg / kg de xylazine, conformément aux directives institutionnelles IACUC. REMARQUE: Utilisé dans ce document sont des souris à 3-6 mois d'âge comme hôtes d'allogreffes. Souris à différents âges peut être utilisée pour étudier l'impact de microenvironnement de l'âge du cerveau de développement sur la tumorigenèse.
    2. Raser le cuir chevelu sur le site de l'incision avec une tondeuse ou des ciseaux.
    3. Stériliser le site chirurgical avec 3 tampons en alternance de 70% d'éthanol et de la bétadine.
    4. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter tout dommage dû à la perte de réflexe de clignement.
    5. Évaluer la profondeur de l'anesthésie par le retrait de la pédale (pincement de l'orteil) réflexe. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 3.4.1-3.4.5 aura ~ 15 min.
  5. Implantation orthotopique
    1. Fixez l'animal dans le cadre stéréotaxique.
    2. Make une incision sur la suture sagittale environ 0,5 cm de long entre les oreilles et les yeux.
    3. Localiser l'intersection des sutures coronale et sagittale (Bregma), ainsi que le point d'intersection des fils de suture lambdoïde et sagittale (lambda). Assurez-vous que Bregma et Lambda sont dans le même plan horizontal.
    4. Fixer la seringue contenant la suspension de cellules et la répétition de l'antigène distributeur sur le cadre stéréotaxique sur la tête. Apportez la pointe de l'aiguille 27 G en contact avec Bregma. Ceci est à l'origine qui sera utilisé pour la manipulation de coordonnées tridimensionnelles.
    5. Relevez l'aiguille légèrement la surface du crâne et se déplacer de 2 mm latérales et 1 mm rostral de Bregma.
    6. Abaissez l'aiguille avec soin à travers le crâne de son mm ventrale de Bregma destination 4. NOTE: Nous avons utilisé ces coordonnées stéréotaxiques de cibler les ganglions de la base. Coordonnées stéréotaxiques différents peuvent être utilisés pour étudier l'impact de microenvironnement de différentsrégions du cerveau sur la tumorigenèse.
    7. Injecter 5 ul de la suspension cellulaire par l'activation de l'antigène distributeur répétitif une fois. Laissez l'aiguille en place pendant 2 min pour permettre la pression intracrânienne s'équilibrer.
    8. Retirer l'aiguille lentement sur une période de 30 secondes. Utilisez un coton-tige pour appliquer une pression sur tout saignement qui peut survenir.
    9. Rapprocher les bords de la plaie et fermer l'incision avec de la colle tissu. Administrer 20 ul de la lidocaïne par voie sous cutanée au niveau du site d'incision. REMARQUE: Pour 5 souris, les étapes 3.5.1-3.5.9 aura ~ 50 min. L'UNC IACUC approuvé l'utilisation post-opératoire de l'anesthésie locale seulement. Consultation avec IACUC institutionnel local est recommandé concernant les exigences pour l'utilisation d'analgésiques postopératoires après cette procédure.
  6. Soins post-chirurgicaux
    1. Placer les animaux dans une cage propre chaude pour récupérer. Animaux ne devraient pas être placés directement dans la literie, comme l'aspiration accidentelle peut se produire.
    2. Observez laanimaux pour la reprise d'un comportement normal comme la toilette, manger, et la défécation. NOTE: Reprise du comportement normal peut prendre ~ 60 min.

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Résultats

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Nous avons développé un système modèle nGEM avec des astrocytes corticaux et NSC récoltées à partir néonatale GEM l'hébergement floxé allèles oncogènes conditionnels qui peuvent être caractérisées phénotypiquement in vitro et in vivo (figure 1). Afin d'étudier les conséquences de mutations oncogéniques spécifiquement dans les astrocytes corticaux in vitro, il est essentiel de d'abord enrichir pour les astrocytes. Récoltes astrocytes corticaux contiennent un mélange de la micro...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les étapes les plus critiques pour assurer la récolte et la culture d'astrocytes corticaux sont 1) le bon d'exciser le cortex sans prendre le tissu situé sous le corps calleux, 2) pour enlever les méninges, 3) de dissocier complètement les cellules, et 4) pour enrichir pour GFAP + astrocytes. Bien que nous utilisions mécanique (agitation) et génétiques (restriction d'une recombinaison génétique avec un vecteur d'Ad5GFAPCre ou l'utilisation d'un transgène de transformation dominant ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRM est un investigateur clinique Damon Runyon-Genentech. Ce travail a été soutenu, en partie, par des subventions à la CRM de la Fondation Damon Runyon pour la recherche sur le cancer (CI-45-09), du ministère de la Défense (W81XWH-09-2-0042) et du Fonds de recherche sur le cancer de l’Université de l’Université de Caroline du Nord (UCRF). Les auteurs souhaitent remercier Daniel Roth pour son aide dans l’élevage des souris. Les auteurs souhaitent également remercier Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette et Susannah Krom pour leur aide en matière de culture tissulaire et d’immunofluorescence.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM peut également être acheté auprès d’autres fournisseurs, notamment GIBCOSigma et Cellgro
Fetal Bovin Serum, RegularCellgro35-010-CV
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
Ciseaux de dissection à pointes acéréesFisher Scientific08-395
Pince à cartilage pour le pouce, incurvéeFisher Scientific1631
Miltex 17-301 Style 1 Pince de style bijoutier, fine, 4Miltex17-301
Éthanol (200 proof)Decon Labs2710
Lames de rasoirVWR55411-050
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) (1x), liquideInvitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol RedInvitrogen12605-010D’autres solutions de trypsine conviennent également pour l’avarie et la culture d’astrocytes corticaux
Boîte de culture, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
15 ml TubesBD Biosciences352096
50 ml TubesBD Biosciences352070
Stock d’adénovirusTransfert de gènes Vector Core, U. IowaAd5CMVCreStore en 5 & micro ; l aliquotes à -80 ° ;C. Dangereux. Sulfate
de sodium (Na2SO<>4)  ;Sigma-Aldrich238597
Sulfate de potassium (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
Chlorure de magnésium (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
Chlorure de calcium (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES selde potassiumSigma-AldrichH0527
D-(+)- GlucoseSigma-AldrichG8270  ;
Rouge phénoliqueSigma-AldrichP3532
Hydroxyde de sodium (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Cystéine-HClSigma-AldrichC1276
Filtre à seringue (0,22 & micro ; m taille des pores)MilliporeSLGP033NS
Neurocult kit de prolifération, sourisStemcell Technologies5702Ce kit contient le milieu basal NeuroCult NSC et le supplément NeuroCult NSC nécessaires pour la culture NSC
0,2 % solution d’héparineStemcell Technologies7980
EGF  ;InvitrogenPMG8041
bFGF  ;InvitrogenPHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Sulfate de magnésium (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Faire 10 mM de stock en DMSO, stocker à -20 ° ; C
Plaques à 6 puitsFisher Scientific07-200-83
Passoire à cellules (40 & micro ; m taille des pores)Corning352340
Solution de dissociation des cellules souchesStemcell Technologies5707Alternativement, utilisez des solutions enzymatiques douces telles que l’accutase
méthylcellulose 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco’s Modified Eagle’s Media 2xMilliporeSLM-202-BPour faire une solution de méthylcellulose à 5 %
1,7 ml Snap Cap Tube de microcentrifugationCorning3620
Seringue Hamilton, 250 & micro ; l LT sans aiguilleFisher Scientific14-815-92
PB600-1 Distributeur d’antigèneHamilton  ; 83700
Aiguilles jetables de 18 gFisher ScientificNC9015638
27 ga 1/2" Aiguille à pointe luerFisher Scientific14-826-48
2,2,2-tribromoéthanol (Avertin)Sigma-AldrichT48402
BétadineFisher ScientificNC9386574
Puralube Pommade ophtalmiqueFisher Scientific Fisher Scientific
Modèle 900 Cadre stéréotaxiqueKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532  ;Adhésif tissulaire  ;
Lidocaïne  ;ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifération Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-Sox2MilliporeAB5603
Polyclonal Rabbit Anti-glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)DakoZ0334  ;
IVIS KineticPerkinElmerPour l’imagerie in vivo
D-Luciferin - K+ Salt Substrat bioluminescentPerkinElmer122796Pour in vivo Imagerie par bioluminescence
EdU Imaging KitInvitrogenC10340
MSCV Luciferase PGK-hygroAddgene18782
NC9689910

Références

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