Phantoms simulant un tissu pour l'évaluation du potentiel proche infrarouge Applications d'imagerie de fluorescence en chirurgie du cancer du sein

chirurgie mammaire conservatrice (BCS) suivie d'une radiothérapie est le traitement standard pour les patients atteints de cancer du sein avec T _{1-T 2} carcinome du sein ^1,2. Inexactitudes dans l'évaluation peropératoire de la mesure de résultat de la chirurgie des marges chirurgicales positives dans 20 à 40% des patients qui ont subi BCS, nécessitant une intervention chirurgicale supplémentaire ou une radiothérapie ^3,4,5. Bien résection étendue des tissus sains adjacents du sein pourrait réduire la fréquence des marges chirurgicales positives, ce sera aussi entraver le résultat esthétique et augmenter comorbidité ^6,7. De nouvelles techniques sont donc nécessaires que de fournir une rétroaction sur la position peropératoire de la tumeur primaire et l'étendue de la chirurgie. L'imagerie optique, en particulier la fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) d'imagerie, peut réduire la fréquence des marges chirurgicales positives suivantes BCS en fournissant au chirurgien un outil de localisation de la tumeur avant et en per-opératoire rEAL-temps. Récemment, notre groupe a rapporté sur le premier essai chez l'humain de l'imagerie de fluorescence de la tumeur ciblée chez les patients atteints de cancer de l'ovaire, montrant la faisabilité de cette technique pour détecter des tumeurs primaires et des métastases par voie intrapéritonéale avec une sensibilité élevée ^8. Avant de procéder à des études cliniques chez des patients atteints de cancer du sein, toutefois, la possibilité d'NIRF différentes applications d'imagerie de tumeurs ciblées dans BCS peut déjà être évaluée en utilisant des fantômes préclinique.

Le protocole de recherche suivant décrit l'utilisation de l'imagerie NIRF dans des fantômes de simulation de tissus mammaires contenant des inclusions de tumeurs fluorescentes simulant ^9. Les fantômes constituent un outil peu coûteux et polyvalent pour simuler la résection localisation de la tumeur avant et peropératoire, en temps réel NIRF-guidé tumeur, l'évaluation de l'état de la marge chirurgicale, et la détection de la maladie résiduelle. Les fantômes gélatineux ont des propriétés élastiques semblables au tissu humain et peuvent être coupés à l'aide de classiqueinstruments urgical. Au cours de la procédure chirurgicale simulé, le chirurgien est guidé par l'information tactile (dans le cas d'inclusions palpables) et l'inspection visuelle de la zone opératoire. En outre, l'imagerie NIRF est appliquée pour fournir au chirurgien un retour d'information en temps réel sur la mesure per-opératoire de chirurgie.

Il convient de souligner que l'imagerie NIRF nécessite l'utilisation de colorants fluorescents. Idéalement, les colorants fluorescents doivent être utilisés qui émettent des photons dans la plage spectrale de l'infrarouge proche (650-900 nm) afin de minimiser l'absorption et la diffusion des photons par des molécules physiologiquement abondantes dans les tissus (par exemple, l'hémoglobine, les lipides, l'élastine, le collagène, et de l'eau) ^10,11. En outre, autofluorescence (c.-à-, l'activité de fluorescence intrinsèque dans les tissus en raison de réactions biochimiques dans les cellules vivantes) est minimisé dans le domaine du proche infrarouge du spectre, ce qui entraîne des ratios optimaux ¹¹ tumeur à-fond. En conjuguant NIRF teint de tumeur targeted fragments (par exemple, des anticorps monoclonaux), l'administration ciblée de colorants fluorescents peuvent être obtenus pour des applications d'imagerie per-opératoires.

Comme l'oeil humain est insensible à la lumière dans la plage spectrale de l'infrarouge proche, un dispositif de caméra très sensible est nécessaire pour l'imagerie NIRF. Plusieurs systèmes d'imagerie NIRF pour l'utilisation peropératoire ont été développés jusqu'à présent ^12. Dans la présente étude, nous avons utilisé une coutume construire NIRF système d'imagerie qui a été développé pour une application peropératoire en collaboration avec l'Université technique de Munich. Le système permet l'acquisition simultanée des images en couleurs et des images de fluorescence. Pour améliorer la précision des images de fluorescence, un système de correction est mis en œuvre pour des variations d'intensité de lumière dans le tissu. Une description détaillée est fournie par Themelis et al ^13.

1. créer des moules en silicone pour Inclusions tumorales simulant

1. Ramassez les objets solides de la forme désirée et la taille qui peuvent servir de modèles pour des inclusions de tumeur simulant, par exemple, des perles ou des billes.
2. Nettoyer soigneusement les modèles de tumeurs. Afin d'assurer un enlèvement facile du moule de silicone, les modèles de tumeurs peuvent être pulvérisées avec un anti-adhérent par pulvérisation ou recouverts d'une mince couche de vaseline ou la cire d'abeille.
3. Placez chaque modèle dans un carré paroi mince boîtier séparé (plastique) avec une surface lisse. Si nécessaire, fixer le modèle de la partie inférieure de la boîte pour le maintenir en position. Utilisation d'une boîte qui est légèrement plus grand que le modèle de la tumeur elle-même pour éviter de perdre des quantités excessives de silicone.
4. Verser la quantité requise de composant silicone A dans un bol à mélanger et ajouter le composant B de silicone dans un rapport de 10: 1 en poids. Bien mélanger les deux composants. Eventuellement, une pompe à vide peut être utilisé pour éliminer les bulles d'air du mélange de silicone.
5. Doucement pour le mélange de silicone dans la boîte en plastique pour éviter la formation de bulles. Le mélange de silicone doit être traité dans les 45 minutes pour obtenir des résultats optimaux.
6. Laisser le mélange de silicone pour solidifier au moins 6 heures avant de le couper et de retirer le moule du modèle de tumeur. Eventuellement, le moule en silicone peut être découpé selon un motif en zigzag pour lui permettre de s'adapter ensemble arrière proprement. La force maximale de la silicone est obtenu au bout de 3 jours.

2. Créez solution saline tamponnée au Tris

1. Créer une solution saline tamponnée au Tris (TBS) en ajoutant une solution de 6,1 g (50 mM) de Tris et 8,8 g (150 mM) de NaCl à 800 ml d'eau désionisée.
2. Ajouter 1,0 g (15 mmol) de _NaN3 pour bloquer l'oxygénation de l'hémoglobine (étape 3.3 et 4.4) et à inhiber la croissance bactérienne. ATTENTION: NaN ₃ est un poison grave. Il peut être mortel en contact avec la peau ou ingestion. La toxicité de ce composé est comparable à celle des cyanures alcalins solubles et la dose mortelle pour un être humain adulteest d'environ 0,7 g. Toujours suivre les consignes de sécurité fournies par le fabricant.
3. Ajuster le pH à 7,4 et porter le volume à 1000 ml avec de l'eau désionisée.

3 Créer fluorescentes Inclusions

1. Ajouter 2 g d'agarose à 50 ml de TBS à partir de l'étape 2 Le point de fusion plus élevé par rapport à de l'agarose gélatine (étape 4.2) empêche les inclusions de se dissoudre et de fuite de colorant fluorescent lorsqu'il est placé dans de la gélatine fondue. En option, la quantité d'agarose ajouté peut être modifiée pour une ou 3 g d'obtenir des inclusions plus tendres ou palpables tumorales, respectivement.
2. Chauffer la suspension d'agarose en utilisant un four micro-ondes jusqu'à ce que le point d'ébullition est atteint. Mélangez soigneusement jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous.
3. Ajouter 1,1 g (17 mol) et de l'hémoglobine 5 ml d'Intralipid à 20% dissous dans 50 ml de TBS au mélange sous agitation constante agarose à ressembler à des caractéristiques optiques du tissu mammaire environnant fantôme (étape 4).
4. Ajouter 20,0 mg (250,8 pmoles) du colorant fluorescent vert d'indocyanine à 83,8 ml d'eau désionisée. Assurez-vous que le colorant soit complètement dissous.
5. Pipette 5,0 ml de cette solution et l'ajouter au mélange d'agarose pour obtenir une concentration finale de 14 uM. Eventuellement, d'autres colorants fluorescents que l'ICG peuvent être utilisés si on le désire avec leur concentration optimale.
6. Remplir délicatement les moules en silicone créés à l'étape 1 avec le mélange agarose chaude à l'aide d'une seringue (figure 1A). Répétez ce processus jusqu'à ce que toutes les moules sont remplis.
7. Laissez les inclusions fluorescentes se solidifient à la température ambiante pendant environ une heure. Protéger les inclusions de la lumière en couvrant l'ensemble du moule de papier d'aluminium.
8. Après solidification, ouvrez délicatement le moule et appuyez sur l'inclusion (figure 1B). En option, utilisez la pointe de la seringue pour appliquer de petites gouttes de mélange agarose fondu sur la surface de l'inclusion. En répétant ce processus plusieurs fois sur le même emplacement, petit tuéperons mor peuvent être créés pour simuler des tumeurs infiltrantes.
9. Protéger les inclusions d'agarose de la lumière et de la déshydratation en les enveloppant dans du papier d'aluminium et les stocker dans un réservoir de stockage humide à 4 ° C.
   REMARQUE: L'utilisation de concentrations de colorant fluorescent inférieures ou supérieures à l'optimum de concentration connue sera à la fois résultat en diminution de l'intensité du signal fluorescent. La réduction apparemment paradoxal de l'intensité du signal avec l'augmentation des concentrations de colorant supérieures à la concentration optimale de colorant fluorescent est due à un phénomène connu sous le nom de trempe. Lors de l'évaluation de la profondeur de pénétration maximale d'un colorant fluorescent dans des fantômes, en utilisant la concentration optimale est obligatoire.

4 Créer Phantoms mammaires

1. Obtenir un moule en forme de coupe afin de créer des fantômes mammaires de la taille désirée et le volume, par exemple, un bol en verre ou en plastique. Le moule doit avoir une surface lisse pour éviter la gélatine sous forme d'adhérer au moule. Un volum moulee de 500 ml permettra de créer des fantômes du sein de taille suffisante.
2. Pour créer un fantôme du sein avec un volume de 500 ml, ajouter 50 g de gélatine 250 fleurs pour 500 ml de TBS (étape 2). Chauffer la suspension de la gélatine à 50 ° C sous agitation constante.
3. Une fois que la gélatine soit complètement dissoute, que le mélange de gélatine et refroidir progressivement le maintenir à une température constante de 35 ° C en utilisant un bain d'eau chaude.
4. Sous agitation constante, ajouter 5,5 g (85 mmol) de l'hémoglobine bovine et 25 ml d'Intralipid à 20% pour simuler l'absorption et la diffusion des photons dans le tissu, respectivement.
5. Prérefroidissement du moule en forme de coupelle à 4 ° C pendant au moins 1 heure. Verser ensuite le mélange de gélatine dans le moule à un niveau qui correspond à la profondeur prédéterminée de l'insertion de la tumeur simulant agarose (figure 1C). Laisser le mélange de gélatine se solidifier à 4 ° C pendant 30 minutes à une heure.
6. Après solidification, positionner une inclusion agarose fluorescent simulant une tumeur à la surface de le fantôme et temporairement rivent l'inclusion avec une petite aiguille. Jusqu'à un maximum de trois inclusions fluorescentes simulant une tumeur peuvent être incorporés dans un seul fantôme du sein. Un espace suffisant (au moins 5 cm) doit être maintenue entre inclusions tumorales simulant individuels (Figure 1D).
7. Verser le reste du mélange de gélatine à chaud dans le volume restant du moule, ce qui permet l'adhérence de ces deux couches, sans créer d'artefacts de réfraction. Marquer l'emplacement des inclusions de tumeurs fluorescentes simuler sur le moule. Laissez le fantôme solidifier O / N à 4 ° C.
8. Une fois solidifié, enlever les aiguilles utilisées pour la fixation temporaire des inclusions et retirez délicatement le fantôme du sein de son moule (figure 1E). Protéger le fantôme du sein de la lumière et de la déshydratation en l'enveloppant dans une feuille d'aluminium et le stocker dans un réservoir de stockage humide à 4 ° C.

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Figure 1: les étapes séquentielles consistant à créer des fantômes mammaires tumorales contenant des inclusions simulant fluorescents. Après la création des moules en silicone de la forme et de la taille désirée, les moules sont remplis avec le mélange fondu d'agarose à l'aide d'une seringue (A). inclusions de tumeur simulant de taille et de forme différentes ont été produites dans la présente étude (B). Ensuite, une mince couche de mélange de gélatine fondue est coulée dans un moule revêtu de mesure du sein en bois (C). Après solidification, les inclusions de tumeurs simulant sont positionnés, obsédés temporairement, et recouverts d'une couche de mélange de gélatine fondue (D). Après solidification, le fantôme du sein est doucement retiré de son moule (E). Le spectre peut alors être appliquée pour simuler diverses applications d'imagerie NIRF (F).ref = "/ files / ftp_upload / 51776 / 51776fig1highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

5 Réglez le système de caméra NIRF

1. Système d'appareil photographique pour une application intra-opératoire NIRF est nécessaire pour simuler l'imagerie par NIRF ciblée dans la chirurgie du cancer du sein. Plusieurs systèmes d'imagerie pour NIRF en temps réel NIRF peropératoire imagerie sont actuellement disponibles pour utilisation expérimentale. Bien qu'il existe certaines différences entre ces dispositifs, ils contiennent tous une source de lumière d'excitation (l'excitation des inclusions de tumeurs fluorescentes) et un dispositif d'imagerie hautement sensible pour la détection des photons émis.
2. Assurez-vous d'utiliser une source de longueur d'onde suffisante de lumière d'excitation. Pour les inclusions simulant une tumeur contenant l'ICG, utiliser une source de lumière d'excitation (par exemple laser) qui émet des photons entre 750 et 800 nm. Si un colorant fluorescent alternative est utilisée, la longueur d'onde d'excitation doit être ajustée conforme la ma les instructions du fabricant concerné.
3. Dans le cas où le système de caméra NIRF contient un filtre d'émission pour filtrer les bruits de fond indésirables, assurez-vous que le bon filtre est utilisé. Pour inclusions tumorales simulant contenant ICG, utiliser un filtre d'émission entre 800 et 850 nm. Colorants fluorescents alternatifs peuvent nécessiter filtres d'émission différentes, selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE: Assurez-vous qu'il existe un chevauchement nul entre l'excitation et la longueur d'onde d'émission pour éviter les images trop saturées. En outre, le temps d'acquisition d'image peut être ajustée pour obtenir des images fluorescentes optimales. Dans le cas des inclusions fluorescentes profondément enracinés ou des signaux fluorescents faibles, l'image du temps d'acquisition peut être augmentée jusqu'à plusieurs secondes à min. Dans le cas d'inclusions superficielles ou des signaux fluorescents solides, le temps d'acquisition peut être réduit à quelques millisecondes pour tenir compte du taux vidéo imagerie de fluorescence en temps réel.

1. Prendre le sein fantôme simulant un tissu de son récipient et placez-le sur une surface plane non fluorescent. Ensuite, placer le dispositif de formation d'image au-dessus de la NIRF fantôme du sein, en laissant une distance de travail suffisant pour l'excision des inclusions de tumeurs simuler.
2. Localiser l'inclusion fluorescent tumeur simulant NIRF utilisant l'imagerie et / ou la palpation du sein fantôme. Dans le cas où aucun signal de fluorescence peut être détectée, l'inclusion est soit placé trop profondément dans le fantôme pour la détection ou le temps d'acquisition d'image doit être augmentée.
3. Une fois que l'inclusion est localisée, inciser le fantôme du sein et enlever l'inclusion de la tumeur simulant sous en temps réel NIRF d'orientation à l'aide d'instruments chirurgicaux classiques. Alternativement, l'inclusion peut être excisé guidé uniquement par inspection visuelle et palpation du fantôme du sein pour simuler la norme des soins.
4. Directement après l'enlèvementde l'inclusion de la tumeur simulant, l'image de la cavité chirurgicale pour toute activité fluorescent restant indiquant excision insuffisante.
5. Dans le cas d'une activité fluorescente restant, exciser le reste de l'inclusion, sous la direction de NIRF directe jusqu'à aucun signal fluorescent est à gauche.
6. L'image des fragments de fantômes excisées pour simuler macroscopique évaluation de l'état de la marge NIRF guidée. Présentes, coupez le tissu fantôme en 3 - 5 plaques mm et l'image des plaques en conséquence. Le signal de fluorescence atteint dans les marges chirurgicales indique l'existence de marges chirurgicales positives.

Les résultats de cette étude ont été rapportés ailleurs 9.

Nos données montrent que l'imagerie NIRF peut être appliquée pour détecter les inclusions de tumeurs fluorescentes en simulant des fantômes de tissu mammaire simulant, en simulant une chirurgie mammaire conservatrice NIRF guidée chez les patients atteints de cancer du sein. L'utilisation de notre modèle fantôme, nous avons trouvé localisation peropératoire de la tumeur, la résection de la tumeur NIRF guidée, l'évaluation peropératoire des bords de la cavité chirurgicale, et la détection d'une maladie résiduelle réalisable (figure 2). En bref, un total de quatre seins fantômes ont été produites, contenant tous deux inclusions fluorescentes avec des dimensions et / ou de la morphologie (tableau 1) distinctes.

Inclusions de tumeurs simulant fluorescentes ont été retirés par voie chirurgicale à partir de la première et deuxième fantôme du sein en utilisant des instruments chirurgicaux classiques. L'excision des inclusions a été guidée par la palpation et l'inspection visuelle de la opératdomaine ive. On a demandé au chirurgien d'opérer sur la poitrine fantôme jusqu'à ce que les inclusions de tumeurs simulant ont été complètement enlevés. Ensuite, l'appareil de mesure de fluorescence a été appliqué pour balayer la cavité chirurgicale pour des signaux fluorescents restants. Dans le cas d'une exérèse incomplète, indiqué par une forte signal de fluorescence reste, le chirurgien a été invité à exciser le reste de l'inclusion dans en temps réel NIRF d'orientation. Dans les deux fantôme # 1 et # 2, l'excision des inclusions sur deux simulant une tumeur était incomplète, comme en témoigne un signal restant solide de fluorescence provenant de la cavité chirurgicale. Dans le cas d'excision incomplète après la première tentative chirurgicale, le chirurgien détecté excisé et l'inclusion reste sous contrôle au cours de la même NIRF (dite théranostic) procédure. Reexcision sous la direction de NIRF directe a entraîné une élimination complète du reste de l'inclusion à la deuxième tentative chirurgicale dans tous les cas, alors qu'il n'était pas nécessaire d'exciser grand volumes fantôme de tissu.

Dans les troisième et quatrième fantôme du sein, de la localisation et de l'ablation chirurgicale des inclusions fluorescentes NIRF guidée a été effectuée lors de la première tentative chirurgicale. En approchant les inclusions fluorescentes simulant une tumeur, le chirurgien a un moniteur à sa disposition sur laquelle le signal de fluorescence a été projetée en temps réel. Dans la quatrième fantôme du sein, une tumeur de l'inclusion simulant positionné à 3,0 cm de profondeur n'est détectable après l'incision du tissu fantôme environ 1 cm. Dans le troisième fantôme du sein, les inclusions de tumeurs ont été simulant radicalement éliminés lors de la première tentative chirurgicale, tandis que la suppression d'un infiltrant inclusion dans la quatrième fantôme a été jugée incomplète. Reexcision sous NIRF-conseils directs a entraîné une élimination complète du reste de la tumeur dans ce fantôme.

Après l'opération, des fragments de tissus fantômes excisées ont été découpées en 3 toboggans mm et imagées par les sys caméra NIRFsystème pour simuler ex vivo évaluation macroscopique de l'état de la marge chirurgicale. Dans tous les cas, l'imagerie de NIRF postopératoire clairement représenté les frontières des inclusions de tumeurs simulation et d'indiquer si la tumeur reste était présent aux marges chirurgicales (figure 2C).

Figure 2 NIRF simulation de formation d'image dans des fantômes mammaires. Des fantômes mammaires simulant un tissu contenant des inclusions de tumeurs simulant fluorescentes ont été appliquées pour la simulation de la localisation de la tumeur intra-opératoire (A), l'élimination NIRF guidée tumeur (B), et l'évaluation de la marge chirurgicale NIRF-guidé l'état (C). Modifié à partir de:.. Pleijhuis et al, EJSO (2011) Plfaciliter cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tableau 1 Présentation de la composition de fantôme.
Un total de 4 fantômes ont été produites, contenant deux inclusions chaque de taille et de forme différentes fluorescentes tumeurs simulation.

Les auteurs n'ont rien à divulguer.