Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

Résumé

Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.

Résumé

Le thymus est un organe vital pour le développement des lymphocytes T. Des cellules stromales thymiques, les cellules épithéliales thymiques (CET) sont particulièrement cruciales à plusieurs étapes du développement des cellules T: l'engagement des cellules T, de sélection positive et négative sélection. Toutefois, la fonction de refroidissement thermoélectriques dans le thymus reste incomplètement comprise. Dans cet article, nous proposons une méthode pour isoler des sous-ensembles TEC de thymus de souris frais en utilisant une combinaison de rupture mécanique et la digestion enzymatique. Le procédé permet aux cellules thymocytes et stromales thymiques être efficacement libérés à partir de la cellule-cellule et des connexions de la matrice extracellulaire et de cellules pour former une suspension de cellules isolées. Utilisation de cellules isolées, de cytométrie de flux à paramètres multiples peut être appliqué à l'identification et la caractérisation des TEC et des cellules dendritiques. Parce que les TEC sont une population de cellules rares dans le thymus, nous décrivons également un moyen efficace d'enrichir et de purifier les TEC en appauvrissant thymocytes, type cellulaire le plus abondant dans le thymus. Follol'aile enrichissement, le temps de tri de cellule peut être réduite de sorte que la perte de la viabilité des cellules peut être réduite au minimum au cours de la purification de TEC. Cellules purifiées sont adaptés à diverses analyses en aval comme PCR en temps réel, Western blot et profil d'expression génique. Le protocole de promouvoir la recherche de la fonction TEC et ainsi que le développement de la reconstitution in vitro des lymphocytes T.

Introduction

Au début du développement de cellules T, de la moelle osseuse souches hématopoïétiques progénitrices multipotentes dérivées de cellules sont recrutés dans le cortex du thymus, subir engagement à T lignée et de devenir des précurseurs de cellules T ^1. Dans le cortex, précurseurs des lymphocytes T CD4 et CD8 à double négatifs (DN) thymocytes se dilatent et se différencient en immatures CD4 et CD8 positif double (DP) thymocytes, la formation d'une grande piscine avec des progéniteurs très variable T récepteurs cellulaires ^1. Seul un sous-ensemble de sélection restreinte au CMH de cellules DP deviendra unique positifs (SP) thymocytes CD4 ou CD8,....

Protocole

Dans cette étude, des adultes (6-8 semaines) femelles C57BL / 6 ont été utilisés. Les souris ont été achetées auprès du National Cancer Institute et maintenues dans des conditions libres d'agents pathogènes spécifiques. L'Université de Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel Minnesota (IACUC) a approuvé toute expérimentation animale.

1 Préparation des instruments et tampons

1. Préparer la solution d'enzyme (milieu RPMI 1640 avec 0,05% [p / v] de Libérase TH et 100 U / ml de DNase I), un tampon d'albumine riche (1X PBS [Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ exempt] avec 0,5% de sérum bovin....

Résultats

En utilisant ce protocole, un organe thymus a été enlevée d'une souris adulte (section 2) et une suspension de cellules du thymus a été préparé comme décrit à la section 3 La suspension cellulaire obtenue est composée de thymocytes, les cellules stromales hématopoïétiques dérivés et les cellules stromales non-hématopoïétiques. CD45 est un marqueur pan-hématopoïétique exprimé sur les thymocytes et les cellules stromales hématopoïétiques telles que les macrophages et les cellules dendritiques. En revanche, les TEC sont pa.......

Discussion

Dans le protocole, les étapes critiques sont la préparation de cellules stromales thymiques (section 3) et l'enrichissement des TEC (section 4). Il est fortement recommandé que la solution de l'enzyme fraîche est préparée à chaque fois et le tissu est traité dès que possible. Pour thymus commun, l'optimisation du volume de solution d'enzyme est nécessaire, selon le nombre de thymus. Si un résidu de tissu est laissé après le traitement, en ajoutant davantage de solution d'enzyme et l'extension du .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-souris EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-souris MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-souris Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Cytomètre en flux	BD Biosciences  ;	LSRFortessa
Trieur de cellules à flux	BD Biosciences  ;	FACSAria
TUBES FACS	BD Biosciences	352052
Logiciel d’analyse par cytométrie en flux	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varie en fonction du fluorochrome et YY varie en fonction de la taille du flacon.