Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

Résumé

Nous décrivons ici un procédé efficace pour l'isolement, l'identification et la purification des cellules épithéliales du thymus de souris (CET). Le protocole peut être utilisé pour l'étude de la fonction du thymus d'un développement normal des lymphocytes T, un dysfonctionnement du thymus et de reconstitution de la cellule T.

Résumé

Le thymus est un organe vital pour le développement des lymphocytes T. Des cellules stromales thymiques, les cellules épithéliales thymiques (CET) sont particulièrement cruciales à plusieurs étapes du développement des cellules T: l'engagement des cellules T, de sélection positive et négative sélection. Toutefois, la fonction de refroidissement thermoélectriques dans le thymus reste incomplètement comprise. Dans cet article, nous proposons une méthode pour isoler des sous-ensembles TEC de thymus de souris frais en utilisant une combinaison de rupture mécanique et la digestion enzymatique. Le procédé permet aux cellules thymocytes et stromales thymiques être efficacement libérés à partir de la cellule-cellule et des connexions de la matrice extracellulaire et de cellules pour former une suspension de cellules isolées. Utilisation de cellules isolées, de cytométrie de flux à paramètres multiples peut être appliqué à l'identification et la caractérisation des TEC et des cellules dendritiques. Parce que les TEC sont une population de cellules rares dans le thymus, nous décrivons également un moyen efficace d'enrichir et de purifier les TEC en appauvrissant thymocytes, type cellulaire le plus abondant dans le thymus. Follol'aile enrichissement, le temps de tri de cellule peut être réduite de sorte que la perte de la viabilité des cellules peut être réduite au minimum au cours de la purification de TEC. Cellules purifiées sont adaptés à diverses analyses en aval comme PCR en temps réel, Western blot et profil d'expression génique. Le protocole de promouvoir la recherche de la fonction TEC et ainsi que le développement de la reconstitution in vitro des lymphocytes T.

Introduction

Au début du développement de cellules T, de la moelle osseuse souches hématopoïétiques progénitrices multipotentes dérivées de cellules sont recrutés dans le cortex du thymus, subir engagement à T lignée et de devenir des précurseurs de cellules T ^1. Dans le cortex, précurseurs des lymphocytes T CD4 et CD8 à double négatifs (DN) thymocytes se dilatent et se différencient en immatures CD4 et CD8 positif double (DP) thymocytes, la formation d'une grande piscine avec des progéniteurs très variable T récepteurs cellulaires ^1. Seul un sous-ensemble de sélection restreinte au CMH de cellules DP deviendra unique positifs (SP) thymocytes CD4 ou CD8, migrer vers la moelle du thymus, et se différencier en cellules T matures fonctionnellement compétentes, un événement qui est visé à la sélection positive ^{2 6.} En revanche, les clones de thymocytes auto-réactifs sont soumis à une sélection négative et sont évacués par l'apoptose, convertis en cellules T régulatrices pour l'auto-tolérance, ou dérivé de lymphocytes intra-épithéliaux à des fins qui ne sont pas encore clairement ^3,7-10.

Dans le thymus, les cellules stromales thymiques forment un microenvironnement unique, pour fournir des signaux destin ^5,11,12 ces différents de développement des cellules T. Les cellules stromales thymiques sont composés de cellules épithéliales thymiques (CET) - y compris TEC corticales (CTEC) et TEC médullaires (mTECs), les cellules dendritiques, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les péricytes de la crête neurale et d'autres cellules mésenchymateuses ^13-15. Parmi ceux-ci, les TEC sont essentiels aux différents stades de développement des cellules T ^1,2,16,17. Cependant, l'absence d'un moyen efficace d'isoler TEC a entravé une compréhension globale de leurs fonctions ^16. En particulier, CTEC, qui forment un réseau tridimensionnel progéniteurs dans le cortex environnant, sont essentiels pour la sélection positive ^13,18,19 pour des raisons qui ne sont pas encore claires. Des études antérieures fournies indices quant à l'hétérogénéité et le rôle des TEC, la plupart s'appuyant sur ​​des outils morphologiques et histologiques ¹³ . Récemment, les rôles uniques de sous-ensembles TEC ont été abordés par des approches génétiques dans des modèles murins ^12,20. Une façon robuste et reproductible pour isoler TEC est fondamentale pour atteindre la caractérisation objective de sous-ensembles de TEC, une évaluation quantitative et qualitative des fonctions de TEC, et la clarification des mécanismes comment CTEC soutenir la sélection positive.

En raison de la rareté des TEC dans le thymus et les interactions serrés qu'ils forment dans l'organe intact, l'isolement des TEC a été difficile. Le protocole décrit ici est basé sur les découvertes précédentes, actuellement réactifs disponibles, les techniques et les connaissances de la structure du thymus et de la composition du stroma. Il ya près de deux décennies, plusieurs procédures ont été signalés à désagréger les tissus du thymus ^21-27, dans lequel les différentes enzymes ont été utilisés lors de la digestion, y compris la trypsine, la collagénase et Dispase. Gray et al. rapport ces enzymes dans leur precedure ^28, et fait état ​​d'une amélioration de la méthamphétamineod, avec une digestion multi-étape de cocktails d'enzymes ²⁹ qui sont devenus largement utilisé ^20,30. Cependant, cette méthode implique un temps de préparation longs et complexes étapes de digestion et entraîne dernière variable du nombre de cellules et les proportions des TEC, même dans la même cohorte de souris ^29,30. Il ya plusieurs années, Libérase enzyme de qualité de la recherche, hautement purifié contenant la collagénase et la protéase neutre commencé à être utilisé dans le tissu du thymus dissociation ^30. Ici, nous décrivons un protocole à base de Libérase digestion, avec des procédés de séparation mécanique optimisés, qui donne un grand nombre de dispositifs de refroidissement thermoélectriques viables à partir de tissus de thymus de souris. .

Pour enrichir les cellules stromales dissociés, des études antérieures ont utilisé soit des gradients de densité ou séparation magnétique de perles ^21,29. Cependant, les deux méthodes provoquent de graves perdu de certaines populations de cellules stromales thymiques, en particulier la population de CTEC ^29. Élimination cytotoxique et techniques panoramique 31,32 ont largement été utilisés pour l'épuisement ou la séparation des lymphocytes dans le domaine immunologique ^12,31. Après comparaison de ces techniques, nous avons établi le protocole de panoramique actuel pour l'enrichissement des TEC. La condition douce au cours de la procédure d'enrichissement conduit à moins de la mort cellulaire et impartiale et une récupération accrue de TEC.

La suspension de cellules de thymus isolé décrit dans la section 3 peut être directement appliquée à l'analyse par cytométrie de débit pour l'identification et la caractérisation des sous-populations de cellules dendritiques et TEC. La section 4 décrit une méthode simple et utile pour identifier des sous-TEC à l'aide de flux multiparamétrique cytomètre. Pour les expériences qui cherchent à obtenir CTEC purifiés ou mTECs, l'enrichissement de TEC et procédures de tri cellulaire peut être trouvé dans la section 5 et 6.

Protocole

Dans cette étude, des adultes (6-8 semaines) femelles C57BL / 6 ont été utilisés. Les souris ont été achetées auprès du National Cancer Institute et maintenues dans des conditions libres d'agents pathogènes spécifiques. L'Université de Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel Minnesota (IACUC) a approuvé toute expérimentation animale.

1 Préparation des instruments et tampons

1. Préparer la solution d'enzyme (milieu RPMI 1640 avec 0,05% [p / v] de Libérase TH et 100 U / ml de DNase I), un tampon d'albumine riche (1X PBS [Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ exempt] avec 0,5% de sérum bovin l'albumine et 2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]), un tampon FACS (PBS 1X [Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ exempt] contenant du sérum bovin fœtal à 1% [FBS] et 0,02% _{de NaN3),} tampon de tri FACS (PBS 1X [Ca2 ⁺ / Mg2 ⁺ exempt] contenant 2% de FBS) et RP10 milieu (milieu RPMI-1640 fourni avec 10% de FBS).
2. Préparer 10 plaques panoramiques. Préparer la solution de revêtement de 40 ml (0,01 mg / ml de Gavoine anti-IgG de rat dans 0,1 M de tampon NaHCO _3), et ajouter 4 ml d'une solution de revêtement dans chaque plaque de 100 x 15 mm, tourbillon et incuber à 4 ° CO / N. Verser la solution d'anticorps et rincer la plaque en utilisant 5 ml de PBS 1x pour 2 fois, agiter vigoureusement entre les rinçages. Conserver les boîtes préparées à 4 ° C.

2. récolte de Thymus tissus

1. Euthanasier souris dans une chambre de CO _2. Mettre l'animal sur son dos sur un tapis de dissection, épinglez les pieds sur le tapis et mouiller la fourrure par pulvérisation d'éthanol à 70%.
2. Faire une incision sur la ligne médiane à travers la peau, à partir d'au-dessus de l'ouverture de l'urètre vers le haut de la mâchoire inférieure avec des ciseaux et s'étendent vers le bas à l'incision du genou des deux côtés. L'incision ressemble à une tête en bas "Y". Tirez la peau lâche en arrière sur les côtés, et la broche à la natte de dissection.
3. Percer la membrane de la pointe du sternum, couper les côtes de chaque côté jusqu'à environ la clavicule, puis soulevez les côtespince et la broche à la natte de dissection. Le thymus est juste sous les côtes, et ressemble à deux lobes blancs minces recouvrant le coeur (Figure 1). Débranchez le tissu conjonctif qui entoure le thymus, tirez doucement et retirer la paire de lobes du thymus avec des pinces dentelées courbes. Lieu lobes du thymus dans une plaque à 6 puits contenant 5 ml de RPMI-1640.

3 Préparation des cellules stromales thymiques

1. Coupez tout le tissu adipeux et conjonctif environnant et transférer les lobes du thymus à un nouveau puits de la plaque de 6 puits contenant 5 ml fraîchement préparer la solution d'enzyme. Faire de petites incisions dans les lobes du thymus avec des ciseaux fins, et incuber la plaque à 37 ° C pendant 20 min.
2. Pipette doucement digérer thymus jusqu'à tissulaire et bas 2 - 3 fois avec 5 ml pipette pour la dissociation des tissus. Recueillir la fraction surnageant dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de tampon d'albumine riche froide pour neutraliser les enzymes. Garder le tube de collecte sur la glace. Ajouter 2,5ml de solution d'enzyme dans le tissu restant et incuber la plaque à 37 ° C pendant 15 min.
3. Effectuer une agitation mécanique douce avec une seringue de 3 ml et une aiguille 18 G de briser les agrégats. Piscine surnageant dans le tube de collecte. Ajouter 2,5 ml de solution enzymatique au tissu restant et incuber la plaque à 37 ° C pendant 15 min.
4. Répétez agitation mécanique douce avec une seringue de 3 ml et une aiguille G 25, et incuber la plaque supplémentaire de 5 - 10 min.
5. Après digestion complète, en commun le surnageant dans le tube de collecte. Centrifuger le tube de collecte à 400 xg, 4 ° C pendant 8 min pour recueillir les cellules. Aspirer le liquide et suspendre le culot cellulaire dans 10 ml de tampon d'albumine riche et filtrer l'échantillon à 100 mm maille. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Puis effectuer l'analyse des flux cytometic (section 4) ou à l'enrichissement TEC (section 5).

4 Identification des TEC par cytométrie en flux

1. Préparer les cellules à une concentration finale de 4 x 10 ⁶ cellules par 100 pi de tampon pour FACS pour la coloration dans une plaque de puits d'essai à fond rond de 96 et de maintenir la plaque sur de la glace. Ajouter 20 ul de solution de bloc Fc (anti-CD16 / CD32 anticorps à 10 pg / ml dans du tampon FACS) aux cellules et on incube les cellules pendant 10 min sur de la glace. Faire tourner la plaque à 400 x g, 4 ° C pendant 3 min. Jeter le liquide des puits en tapotant la surface de la plaque vers le bas dans un évier.
2. Suspendre le culot cellulaire dans 100 pi de cocktail d'anticorps (anti-CD45, -EpCAM, classe -MHC II, et -Ly51 anticorps, et l'UEA-1 lectine marquées avec des fluorochromes à recommandé par le fabricant ou testé des concentrations optimales de chaque anticorps dans un tampon FACS ), et incuber les cellules sur de la glace pendant 20 min dans l'obscurité. Pour la compensation, tacher 1 x 10 ⁶ cellules avec chaque fluorochrome.
3. Ajouter 100 ul de tampon FACS à chaque puits et faire tourner la plaque à 400 x g, 4 ° C pendant 3 min. Répétez la seule étape de lavagetemps, puis remettre en suspension les cellules dans du tampon FACS 100 ul. Transférer les cellules dans un tube à fond rond de FACS 12 x 15 mm remplie avec 300 pi de tampon FACS. Acquérir des échantillons sur cytomètre en flux et analyser les données en utilisant un logiciel d'analyse FACS. TEC stratégie de déclenchement est représentée sur la Figure 2.

5. enrichissement des TEC par Panoramique

1. Isoler les cellules du thymus (préparés à la section 3) à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min. Aspirer le liquide et en suspension les culots cellulaires dans du tampon de tri FACS à une concentration de 2 x 10 ⁸ cellules par ml dans un tube conique de 15 ml ou 50 ml. Ajouter l'anticorps anti-CD90.2 (clone H12-30) (ou anti-CD45) à une concentration finale de 2,5 pg / ml de suspension de cellules et incuber les cellules doucement sur un agitateur rotatif à 4 ° C pendant 30 min. Après l'incubation, laver avec un 5 - le volume 10x de milieu RP10 et centrifuger le tube à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min.
2. Aspirer le liquide et remettre en suspension le culot cellulaire dansmilieu RP10 à une concentration de 1 x 10 ⁷ par ml. Ajouter 5 ml de suspension de cellules à chaque plaque revêtue de panoramique (préparé à l'étape 1.3), tourbillon et incuber pendant 30 min à température ambiante. Agiter vigoureusement; transférer les surnageants dans un tube conique. Rincer la plaque deux fois en utilisant un milieu de RP10 et mettre en commun les surnageants dans le tube de collecte.
3. Centrifuger le tube de prélèvement à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min. Aspirer le liquide et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de RP10. Ajouter la suspension cellulaire à une nouvelle plaque panoramique, agiter et incuber pendant 30 min à température ambiante. Recueillir les cellules rincer la plaque et mettre en commun les dans un tube conique. Une fois que les TEC sont enrichis, centrifuger les cellules à 400 xg, 4 ° C pendant 5 min et suspendre les cellules dans 5 ml FACS tampon de tri.

6 Purification des TEC par Tri cellulaire

1. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et préparer la suspension de cellules à une concentration de 4 x 10 ⁷ cellules dans du tampon de tri FACS. Ajouter des anticorpsdécrite à l 'article 4.4 en solution de cellules et incuber les cellules doucement sur un agitateur rotatif à 4 ° C pendant 30 min. Après la coloration, les cellules laver et suspendre à une concentration de 10 x 10 ⁶ cellules par ml de tampon de tri FACS.
2. Trier les sous-ensembles TEC à travers une buse 100 uM en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé. Cellules triées sont collectées dans 30% (v / v) de FBS dans du RPMI-1640). Une fois que le tri de cellules, des cellules se fait de centrifugation à 400 xg, 4 ° C pendant 5 minutes et la préparation pour l'analyse en aval.

Résultats

En utilisant ce protocole, un organe thymus a été enlevée d'une souris adulte (section 2) et une suspension de cellules du thymus a été préparé comme décrit à la section 3 La suspension cellulaire obtenue est composée de thymocytes, les cellules stromales hématopoïétiques dérivés et les cellules stromales non-hématopoïétiques. CD45 est un marqueur pan-hématopoïétique exprimé sur les thymocytes et les cellules stromales hématopoïétiques telles que les macrophages et les cellules dendritiques. En revanche, les TEC sont pa...

Discussion

Dans le protocole, les étapes critiques sont la préparation de cellules stromales thymiques (section 3) et l'enrichissement des TEC (section 4). Il est fortement recommandé que la solution de l'enzyme fraîche est préparée à chaque fois et le tissu est traité dès que possible. Pour thymus commun, l'optimisation du volume de solution d'enzyme est nécessaire, selon le nombre de thymus. Si un résidu de tissu est laissé après le traitement, en ajoutant davantage de solution d'enzyme et l'extension du ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-souris EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
Anti-souris MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
Anti-souris Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Cytomètre en flux	BD Biosciences  ;	LSRFortessa
Trieur de cellules à flux	BD Biosciences  ;	FACSAria
TUBES FACS	BD Biosciences	352052
Logiciel d’analyse par cytométrie en flux	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX varie en fonction du fluorochrome et YY varie en fonction de la taille du flacon.