Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

Résumé

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Résumé

Une partie importante du développement post-embryonnaire chez la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a lieu au sein d'un ensemble de structures de sac-comme les appelés disques imaginaux. Ces disques donnent lieu à un pourcentage élevé de structures adultes qui se trouvent à l'intérieur de la mouche adulte. Nous décrivons ici un protocole qui a été optimisé pour récupérer ces disques et de les préparer pour l'analyse avec des anticorps, des journalistes de la transcription et les pièges de protéines. Cette procédure est plus adapté pour les tissus légers tels que les disques imaginaux, mais peut être facilement modifié pour une utilisation avec des tissus plus épais tels que le cerveau adulte et larvaire ovaire. Le protocole écrit et la vidéo qui accompagne va guider le lecteur / spectateur à travers la dissection de troisième stade larvaire, fixation de tissu, et le traitement des disques imaginaux avec des anticorps. Le protocole peut être utilisé pour disséquer les disques imaginaux de jeunes larves de premier et deuxième stade aussi. L'avantage de ce protocole est qu'il est relativement court et il a êtrefr optimisé pour la préservation de haute qualité du tissu disséqué. Un autre avantage est que la procédure de fixation qui est utilisé fonctionne bien avec la très grande majorité des anticorps qui reconnaissent des protéines de Drosophila. Dans notre expérience, il ya un très petit nombre d'anticorps sensibles qui ne fonctionnent pas bien avec cette procédure. Dans ces situations, le remède semble être d'utiliser une fixation cocktail autre tout en continuant à suivre les lignes directrices que nous avons définies pour les étapes de dissection et les incubations d'anticorps.

Introduction

Depuis plus d'un siècle, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été un principal système pour étudier le développement, le comportement et la physiologie. Développement de la mouche peut être divisé en deux grandes étapes: embryonnaires et post-embryonnaires avec beaucoup de celle-ci ayant lieu au sein de l'épithélium monocouche appelés disques imaginaux ^1-3. Dessins de disques imaginaux ont d'abord été publiés en 1864 par Août Weismann dans le cadre de son vaste monographie sur le développement des insectes ^1. Ces disques commencent leur développement au cours de l'embryogenèse, sont motifs ....

Protocole

1 Préparation de larves

1. Remplissez une boîte de 35 mm de Pétri avec un tampon de dissection.
2. Placez les larves en boîte de Petri et leur permettre de nager pendant quelques minutes (étape d'auto-nettoyage).
3. Transférer les larves à un pool de mémoire tampon de dissection sur une plaque de dissection à base de silicone. Cette piscine doit être à un bord de la plaque. La plaque de dissection se compose d'une solution de silicone qui a été coulé et durci dans une boîte de Pétri en verre.
4. L'utilisation d'un pasteur-pipette, placer un plus grand bassin de tampon de dissection au milieu de la plaque de dissection.

Résultats

La méthode décrite ci-dessus de manière fiable produit du matériel de haute qualité pour l'analyse des sondes in situ, les journalistes de la transcription, les pièges de protéines et d'anticorps. Dans la figure 1, nous affichons œil-antenne, génitales, ailes, haltère et jambes disques qui sont systématiquement récupérés avec cette méthode. Ces disques ont été traités avec un fluorophore de la phalloïdine-conjugué, qui se lie à l'actine F et décrit par conséquent chaque cellule. Si le tissu a é.......

Discussion

Bien que cette procédure ait surtout porté sur l'isolement et le traitement ultérieur des disques eye-antennaire, il est susceptible d'être utilisé pour isoler et analyser l'aile, haltère, la jambe et les disques génitales (figure 4). La seule modification nécessaire du protocole pour isoler ces disques (par opposition au disque eye-antennaire) est la méthode de dissection grossière (de l'article 2 du protocole). La première branche (T1) thoracique paire se trouve à la partie antérieure .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5 KG	Utilisé pour créer une base pour la plaque de dissection
Boîte de Pétri en verre Pryex 150 x 20 mm	Dow Corning	3160-152CO	Utiliser le couvercle pour la plaque de dissection
#5 Pince de dissection	Ted Pella	525	La pince doit être maintenue très affûtée
9 bien regarder le verre	Vairous Fournisseurs		Utilisé pour la fixation de complexes de disques imaginaux
Fiole Erlenmeyer 50 ml	Divers fournisseurs
Petite barre d’agitation	Divers fournisseurs		Assez petit pour s’adapter à la fiole Erlenmeyer
50 ml Tubes coniques	Divers fournisseurs
Tubes Microfuge 1,5 ml Divers	fournisseurs		Clair ou foncé selon l’application
Rack	à microfugeDivers fournisseurs
Rotateur de paillasse	Divers fournisseurs		100 μ ; l le volume ne doit pas éclabousser à basse température
Paraformaldéhyde	Macron Chemicals	2-26555-1	Sert de fixateur
Phosphate de sodium Monobasique	Sigma Chemical Co	S-3139	Utilisé pour faire des tampons de dissection et de lavage
Phosphate de sodium	Dibasic Sigma Chemical Co	71636	Utilisé pour faire des tampons de dissection et de lavage
Lysine	Acros Organics	125221000	Utilisé dans la solution fixatrice
Sodium Periodate	Sigma Chemical Co	S-1878	Utilisé dans la solution fixatrice
Triton X-100	EMD Chemicals	MTX1568-1	Utilisé pour perforer les disques imaginaux
Sodium Hydroxide	EM Science	SX0593-3	Utilisé pour dissoudre le paraformaldéhyde
100 % Normal Goat Serum	Jackson Laboratories	005-000-121	Sert de solution bloquante
Anticorps primaires	Divers fournisseurs		Diluer dans du sérum de chèvre à 10 % selon les instructions du fabricant
Anticorps secondaires Divers	fournisseurs	Diluer dans du sérum de chèvre à 10 % selon les directives du fabricant
Plaques de protection en verre 18 x 18 mm	Fischer Scientific	12-542A
Kimwipe	Tissue Divers fournisseurs		Empêche les lames de verre d’adhérer à la base en silicone
Panit Brush 000	Divers fournisseurs Utiliser		pour abaisser doucement la lamelle sur les échantillons

Sondes moléculaires Vectashield H-1000 Empêche le blanchiment des échantillons Lames de microscope Fischer Scientific 48312-003