Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

A Novel In vivo Technique Gene Transfer et In vitro Essais cellule sur la base de l'étude de la perte osseuse dans les troubles musculo-squelettiques

11.3K vues

⸱

DOI :

10.3791/51810

⸱

8 juin 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

Dans cet article

Résumé

La différenciation des cellules précurseurs en ostéoclastes est régulée par les cytokines et les facteurs de croissance. Ici, une nouvelle technique de transfert de gènes pour la différenciation des ostéoclastes in vivo et des protocoles de culture cellulaire pour différencier les cellules précurseurs en ostéoclastes in vitro comme méthode d’étude des effets des cytokines sur l’ostéoclastogenèse sont décrits.

Résumé

La différenciation et l’activation des ostéoclastes jouent un rôle clé dans le développement des maladies musculo-squelettiques, car ces cellules sont principalement impliquées dans la résorption osseuse. Les ostéoclastes peuvent être générés in vitro à partir de cellules précurseurs de monocytes/macrophages en présence de certaines cytokines, qui favorisent la survie et la différenciation. Ici, des techniques in vivo et in vitro sont démontrées, ce qui permet aux scientifiques d’étudier différentes contributions des cytokines à la différenciation, à la signalisation et à l’activation des ostéoclastes. Le système de transfert de gènes d’administration d’ADN en minicercle fournit une méthode alternative pour établir un modèle lié à l’ostéoporose est particulièrement utile pour étudier l’efficacité de divers inhibiteurs pharmacologiques in vivo. De même, les protocoles de culture in vitro pour la production d’ostéoclastes à partir de cellules précurseurs humaines en présence de cytokines spécifiques permettent aux scientifiques d’étudier l’ostéoclastogenèse dans les cellules humaines pour des applications translationnelles. Combinées, ces techniques ont le potentiel d’accélérer les efforts de découverte de médicaments pour des traitements ciblés spécifiques aux ostéoclastes, ce qui pourrait bénéficier à des millions de patients atteints d’ostéoporose et d’arthrite dans le monde.

Introduction

Maladies musculo-squelettiques affectent des millions de personnes aux Etats-Unis et actuelles de graves conséquences pour les systèmes nationaux et locaux de la santé 1. Ces troubles sont caractérisés par la perte de l'os et la fonction articulaire qui nécessitent un traitement lourd et de longues périodes de récupération. Généralement, une augmentation relative du nombre et / ou l'activité des ostéoclastes, cellules spécialisées à résorber l'os, l'ostéoporose et l'arthrite est observée 2. Dans des conditions physiologiques, le nombre et l'activité des ostéoclastes est régulée par l'activateur du récepteur du facteur nucléaire-κ B ligand (RANKL), qui est produit par les ostéoblastes. Ostéoprotégérine (OPG), un récepteur leurre pour RANKL est également produite par les ostéoblastes 3 ​​Dans les modèles animaux in vivo qui impliquent la surexpression systémique de sRANKL, ou la suppression d'OPG sont très précieux dans la recherche de l'ostéoporose.; Cependant, ces méthodes nécessitent la génération de souris transgéniques à 4,5. Ici, une nouvelle alternativeméthode de surexpression sRANKL pour l'étude des troubles musculo-squelettiques liés est décrite. Plus précisément, minicercles (MC) technologie de l'ADN et les méthodes de livraison hydrodynamiques ont été utilisés pour réaliser le transfert de gènes in vivo de sRANKL et surexpriment la souris sRANKL systémique 6.

Cette méthode est également complémentaire à d'autres modèles in vivo de l'ostéoporose, tels que la modulation hormonale des ostéoclastes suivants ovariectomie 7 et l'intervention diététique par le régime alimentaire pauvre en calcium 8. Ces modèles sont très utiles pour étudier les différents aspects des troubles musculo-squelettiques liés-mais ils ont besoin d'interventions chirurgicales et peuvent prendre jusqu'à plusieurs mois, à un coût important 9. Ovariectomisées (OVX) modèle de rongeur est un modèle animal expérimental où l'enlèvement des ovaires conduit à une déficience en oestrogènes mimant ainsi l'ostéoporose post-ménopausique humaine 10. Human ostéoporose post-ménopausique, une condition où l'oestrogène Deficirence conduit à un risque accru de fractures osseuses et l'ostéoporose affecte environ huit millions de femmes aux États-Unis seulement. Bien que le modèle OVX est utile pour l'ostéoporose post-ménopausique il offre des avantages limités à l'étude de l'ostéoporose en général. L'œstrogène inhibe la perte osseuse, en induisant des ostéoclastes et en inhibant l'apoptose des ostéoblastes, donc en l'absence d'une augmentation de l'activité des ostéoclastes est observée 10 à 12. Un rapport RANKL-OPG déséquilibre qui favorise la résorption osseuse est également observée 13. Cependant, la carence en oestrogène in vivo est également accompagnée par des niveaux de transformation β du facteur de croissance (TGF β d'), l'augmentation de l'interleukine-7 (IL-7) et le TNF, IL-1 et IL-6 14,15 diminué. Comme ces cytokines ont connu des fonctions modulatrices du remodelage osseux indépendante de la voie de RANKL, il n'est pas possible d'attribuer toute activation des ostéoclastes uniquement à l'axe RANKL-RANK. Le modèle décrit dans ce document permet aux chercheurs d'étudier en vivo axe RANKL-RANK dans ostéoclastogénèse et la perte osseuse sans cytokines pro-inflammatoires par rapport aux modèles de rongeurs OVX.

En outre, les techniques in vitro ostéoclastogenèse sont des outils essentiels pour étudier l'activation des ostéoclastes pour des traitements thérapeutiques potentielles des maladies musculo-squelettiques. Des études antérieures ont également montré que la culture de macrophages de souris dérivées de la moelle osseuse (BMMS) avec des macrophages de souris colony-stimulating factor (M-CSF) et de la souris sRANKL peut conduire à la différenciation des ostéoclastes 3,16,17. Ici, les protocoles pour générer des cellules ostéoclastes multinucléés analogue à partir de moelle osseuse de souris, ainsi que de cellules mononucléaires périphériques humaines du sang périphérique (PBMC) in vitro 18 sont décrits. Les tests cellulaires nécessaires pour définir un ostéoclastes différenciation terminale et entièrement fonctionnel maturité sont aussi brièvement décrits. Ces techniques in vitro complètent la nouvelle approche in vivo et, ensemble, servent de poutils d'investigation owerful pour étudier la différenciation des ostéoclastes et activation. L'utilisation de ces systèmes, les scientifiques sont capables de générer des ostéoclastes in vivo et in vitro et de définir les stimuli et les signaux nécessaires à leur prolifération et l'activation ainsi que de tester l'efficacité des inhibiteurs pharmacologiques et biologiques.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Livraison hydrodynamique de sRANKL MC ADN

  1. Livraison hydrodynamique via souris veine de la queue
    1. Peser la souris avant l'injection dans la veine caudale. Diluer sRANKL ou la protéine fluorescente verte (GFP) dans MC solution de Ringer (pré-chauffer à 37 ° C) dans un volume total d'environ 10% du poids corporel de la souris.
    2. Réchauffez la souris dans une cage pendant 10 minutes avant l'injection afin de dilater les vaisseaux sanguins et faire nervures latérales (EFV) visibles. Surveillez attentivement la souris pour éviter la déshydratation et d'hyperthermie.
    3. Dès que les VL sont dilatés et visibles, transférer la souris pour le dispositif de retenue et insérer la fiche assez loin dans le canon pour restreindre le mouvement. Surveillance de la souris pour les activités normales comme la respiration. Réglez la prise de contention si nécessaire.
    4. Désinfecter la zone d'injection 3/4 de la pointe de la queue avec un tampon imbibé d'alcool. Utiliser une aiguille 27-30 G pour injection veine de la queue de la souris. Tenez la queue fermement d'une main et insérer l'aiguille dansà la veine de la queue. Appliquer une pression sur la seringue et compléter l'injection dans 5-7 sec.
    5. Retirez l'aiguille de la veine de la queue et appliquer une pression avec une boule de coton sur le site d'injection pour arrêter le saignement. Surveillance de la souris pendant 15-30 minutes, puis transférer la souris vers vivarium fois le taux de respiration est réduite à son taux normal.
  2. Confirmation de l'expression et la quantification de souris systémique de transfert souris Sérum TRACP5b Poster Gene
    1. Réchauffez la souris dans une cage pendant 5-10 min afin de dilater les vaisseaux sanguins et faire VL visible. Surveillez attentivement la souris pour éviter la déshydratation et d'hyperthermie.
    2. Faire une petite incision avec une lame à la queue de la souris à un site d'une suite de la pointe de la queue.
    3. Recueillir environ 100 pi de sang dans des tubes de séparation de sérum.
    4. Incuber les tubes de séparation de sérum à température ambiante pendant 30 min.
    5. Centrifuger les échantillons à 10 000 g pendant 5 min et recueillir le sérum. Store sérum à -80 ° C pour analyse ultérieure.
    6. Effectuer sRANKL ELISA et test de la souris TRACP5b de sérum sur des échantillons de sérum en utilisant un kit disponible dans le commerce.

2. Ostéoclastes in vitro génération de BMMS souris

  1. Isolement et culture des BMMS
    1. L'isolement du tibia et du fémur os: Euthanasier la souris donneuse avec du CO 2, et à désinfecter les jambes avec 70% d'éthanol. Disséquer de l'os pubien à l'os du calcanéum, de supprimer fémur et du tibia os intact.
    2. Retirez soigneusement la peau et les muscles sans endommager l'os. Placez fémur et du tibia traitées os dans une boîte de Petri contenant un tampon phosphate salin (PBS).
    3. Prélèvement de moelle osseuse: Couper le bout sur un côté du fémur et du tibia os et débusquer la moelle osseuse dans un tube de 50 ml à l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille 25 G, chargé de α-MEM contenant 1% de pénicilline / streptomycine (ostéoclastes milieu de culture / OCM).
    4. Procédé de moelle osseuse: mélanger et transférer la suspension de moelle osseuse pour un nouveau tube de 50 ml en la faisant passer à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 pm. Centrifuger les cellules à 300 xg et remettre en suspension dans α-MEM contenant 1% de pénicilline / streptomycine et 10% de FBS (milieu ostéoclastes Culture / OCM (+)).
  2. Culture de macrophages
    1. Compter les cellules en utilisant un hématimètre ou compteur de cellules automatique.
    2. Plate 1 x 10 6 cellules par puits pour une plaque à 6 puits ou 3 x 10 5 cellules de lamelles de verre (5 mm) ou des tranches de dentine placés en plaque de 96 puits et incuber à 37 ° C.
    3. Aspirer tous les médias contenant des cellules non-adhérentes et incuber les cellules à 37 ° C avec frais OCM (+) contenant 25 ng / ml souris M-CSF pendant 48 heures.
    4. Aspirer tous les médias et incuber les cellules à 37 ° C avec frais OCM (+) des milieux contenant 25 ng / ml souris M-CSF, et 30 ng / ml sRANKL de la souris pour lancer ostéoclastogénèse. Reconstituer des médias tous les 3 jours selon les besoins.
    5. Cultiver des cellulespour environ 6-8 jours pour former des cellules multi-nucléaires géants capables de résorption osseuse. Dès que les cellules multinucléées apparaissent, effectuer TRAP (tartrate de la phosphatase acide résistant) coloration en utilisant un kit disponible dans le commerce, et à pleine maturité, effectuer des tests fonctionnels. Visualiser les anneaux F-actine sur des lamelles à l'aide de la phalloïdine tache et de l'image des cellules attachées à la dentine tranches par microscopie électronique à balayage (MEB), comme décrit précédemment 19.

3. Ostéoclastes in vitro génération à partir de PBMC humaines

  1. Isolement de cellules PBMC humaines
    1. Ajouter 10 ml d'Histopaque-1077 pré-chauffé dans un tube de 50 ml.
    2. Filtre de leucocytes vide obtenu à partir de la banque de sang avec du PBS stérile dans un tube de 50 ml (rapport 1:1 de sang avec de la PBS). Couche du sang dilué sur la solution de histopaque très lentement, faire en sorte que le sang ne se mélange pas avec le histopaque.
    3. Centrifuger les échantillons à 1000 g pendant 20 min à 18 ° C. Suivrement centrifugation, isoler soigneusement la couche leuco-plaquettaire blanc contenant les globules blancs et transférer dans un nouveau tube de 50 ml.
    4. Diluer les cellules avec du PBS et on centrifuge à nouveau à 650 x g pendant 5 minutes pour recueillir les cellules.
    5. Retirer le surnageant et remettre les cellules en OCM (-) les médias et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules.
  2. Placage et la culture des PBMC
    1. Remettre en suspension les cellules dans l'OCM (+) des médias et plateau de 8 x 10 6 cellules / ml par puits dans une plaque à 6 puits ou 1 x 10 6 cellules / ml par puits dans une plaque de 96 puits. Cellules de la plaque sur des lamelles de verre (5 mm) tel que requis pour l'imagerie par immunofluorescence, ainsi que sur des tranches osseuses appropriées pour des dosages de la résorption osseuse tels que décrits précédemment 20.
    2. Changer de milieux de culture, la reconstitution des cellules avec M-CSF humain tous les 2-3 jours ou au besoin. Ensuite, passez à l'étape de différenciation au jour 5 par addition de 30 ng / ml de sRANKL humain avec 25 ml de M-CSF humain / ng dans OCM (+) médias pour lancer osteoclastogenesest.
    3. Cultiver des cellules d'environ 14 à 21 jours pour former des cellules multi-nucléaires géants. Dès que les cellules multinucléées apparaissent, ces cellules peuvent ensuite être étiquetés pour TRAP, et à pleine maturité, les essais fonctionnels peuvent être effectuées. Anneaux F-actine peuvent être visualisées sur des lamelles à l'aide phalloidin tache. La morphologie des cellules peut être examinée dans des cellules attachées à la dentine tranches par SEM.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Ici, une technique de transfert de gène selon l'invention pour la différenciation des ostéoclastes in vivo et des protocoles de culture de cellules pour la différenciation des cellules précurseurs des ostéoclastes in vitro en tant que méthode pour étudier les effets des cytokines sur l'ostéoclastogenèse sont décrits. Sur la figure 1, les résultats représentatifs de transfert de gène réussie de GFP et de la souris sRANKL MC chez la souris sont présentées. Dans la figure 2,

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Troubles musculo-squelettiques sont les principales causes de morbidité et d'invalidité et sont constitués de plus de 150 maladies et syndromes; affectant environ 90 millions d'Américains aujourd'hui. L'inflammation des articulations et la destruction osseuse sont des caractéristiques prédominantes de troubles musculo-squelettiques, dont l'arthrite et l'ostéoporose. L'ostéoporose est une maladie qui fragilise l'intégrité de l'os, ce qui conduit souvent à des fractures de l'os. L&#...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La recherche a été en partie soutenue par les subventions de recherche R01 AR062173 et SHC 250862 à l’IEA. ES est le récipiendaire de la bourse prédoctorale NIH T32 CTSC.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
alpha-MEMLife Technologies  ;12561-056
Humain M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
Souris M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
Humain RANK-Ligand - solubleMiltenyi Biotec130-094-631
Souris RANK-Ligand - solubleMiltenyi Biotec130-094-076
Tailveiner Restrainer pour sourisBraintreeTV-150 STD
Souris TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit  ;R& D systemsMTR00
Phosphatase acide, leucocytaire (TRAP) KitSigma387A
MouseTRAP assay  ;systèmes d’immunodiagnosticSB-TR103

Références

  1. Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
  2. Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
  3. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
  4. Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
  5. Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
  6. Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
  7. Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
  8. Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
  9. Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
  10. Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
  11. Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
  12. Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
  13. Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
  14. Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
  15. Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
  16. Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
  17. Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
  18. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
  19. Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
  20. Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
  21. Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
  22. Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
  23. Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
  24. Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
  25. Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
  26. Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
  27. Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
  28. Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
  29. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
  30. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
  31. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  32. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
  33. Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
  34. Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
  35. Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Diff renciation des ost oclastestransfert de g nes hydrodynamiquemod le d ost oclastes in vivog n ration d ost oclastes in vitromacrophages de la moelle osseuseost oclastes issus de PBMC humainsmini cercle du ligand RANKsuppl mentation en MCSFcellules TRAP positivesformation de l anneau de F actine
A Novel In vivo Technique Gene Transfer et In vitro Essais cellule sur la base de l'étude de la perte osseuse dans les troubles musculo-squelettiques
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.