Amélioration de la détection du Nord Blot des petits ARN espèces en Drosophila melanogaster

Résumé

Le but de cette publication est de visualiser et de discuter des étapes opérationnelles d'un protocole Northern Blot améliorée sur l'ARN extrait de Drosophila melanogaster embryons, des cellules et des tissus. Ce protocole est particulièrement utile pour la détection efficace de petites espèces d'ARN.

Résumé

Les dernières décennies ont vu l'explosion de l'intérêt scientifique autour des mécanismes de contrôle de l'expression des gènes au niveau de l'ARN. Cette branche de la biologie moléculaire a été fortement alimentée par la découverte de non codantes des ARN comme des acteurs majeurs dans la régulation post-transcriptionnelle. Une telle perspective révolutionnaire a été accompagnée et déclenchée par le développement de technologies puissantes pour le profilage des ARN courte expression, à la fois au niveau haut débit (identification du génome entier) ou analyse d'un seul candidat (accumulation de l'état d'équilibre des espèces spécifiques). Bien que plusieurs stratégies état de l'art sont actuellement disponibles pour le dosage ou la visualisation de ces molécules fuyant, analyse Northern Blot reste l'approche droit dans la biologie moléculaire pour l'évaluation immédiate et précise de l'expression de l'ARN. Il constitue une première étape vers l'application de technologies coûteuses, plus sophistiqués et, dans de nombreux cas, reste une méthode préférentielle pour gagner facilement des idéesARN en biologie. Ici, nous aperçu un protocole efficace (Enhanced Northern Blot) pour détecter les microARN faiblement exprimés (ou d'autres espèces de petits ARN réglementaires) de Drosophila melanogaster embryons entiers, disséqué manuellement tissus / adultes larvaires ou dans des cellules cultivées in vitro. Une quantité très limitée de l'ARN est nécessaire et l'utilisation du matériel de flux cellules cytométrie isolées peuvent être également envisagée.

Introduction

ARN biochimie a connu progrès spectaculaires au cours des dernières années ^1. Notre compréhension du potentiel de l'ARN dans le contrôle de l'expression génique a été éclaté par l'identification des puissants ribo-régulateurs non codants ^2, par la découverte de nouveaux mécanismes de régulation à base d'ARN ^3,4 et par une caractérisation détaillée des événements post-transcriptionnelle déjà connues ^5. Tous biologie de l'ARN ensemble, ces études ont permis de faire considérablement la scène, devenant un important sujet de recherche dans le paysage scientifique actuel. En particulier, au cours des dernière....

Protocole

Collection 1 de l'échantillon

1. Détachez 2 cellules de semi-adhérent, Schneider (1-5 x 10 ⁶ cellules en moyenne), à la pipette et les récolter par centrifugation (100 g pendant 1 min). Dans le cas de cellules adhérentes en culture in vitro, trypsiniser eux dans des conditions standard ou directement à percevoir ces plaques dans une quantité convenable d'ARN réactif d'extraction, par l'aide d'un grattoir à cellules.
2. Pour la collecte des embryons, développer des souches de drosophile dans des cages à mouches et laisser embryons s'accumulent sur ​​des plaques de ponte. Essuyez embryons hors d'un....

Résultats

En suivant la procédure générale décrite dans le texte et représentés schématiquement sur ​​la figure 1, nous avons évalué l'expression de petits ARN à partir d'échantillons d'ARN complexes de différentes origines. Dans l'expérience présentée à la figure 1, l'ARN a été isolé à partir de 2 cellules de Drosophila Schneider par extraction à la protéinase K, vérifiés pour l'intégrité (étape optionnelle: dénaturation agarose fractionnement de gel) et chargé dans le double. La moitié.......

Discussion

Bien que notre appréciation de l'entrelacement sophistiqué par lequel l'ARN régule la neurogenèse est en constante augmentation, les implications mécanistiques de circuiteries à base d'ARN qui affectent neurones biologie des cellules souches, la différenciation neuronale / intégration fonctionnelle, le développement de pathologies et cancers de neurones restent inexplorées. Le maintien de ces réseaux par les royaumes rend le potentiel des systèmes génétiques Drosophila melanogaster contribué à éluci.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
COMPOSITION FINALE/NOM	DE L’ENTREPRISE	(Stock)	COMMENTAIRES
EXIGENCES GÉNÉRALES
Centrifugeuse, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Décontaminant, RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	Appliquer sur verre/plastique, essuyer et rincer
Inhibiteur de RNase, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Dangereux //// 1609-47-8
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS
Stéréomicroscope, M60	Leica  ;
1x tampon
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5  ;   ;
2,7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7  ;
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4  ;
1,8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0  ;
ARN
Thermo	Scientific	Nanodrop 2000
Imageur, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Électrophorèse horizontale, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
	Life Technologies	15596026	Dangereux
PCA (25:24:1), 1:1 pour l’extraction	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 pour	l’extraction Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3  ;   ;
EtOH, 2,5 vol. pour les précipitations, 70 % pour le lavage	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5  ;
Règle de gène 1Kb Échelle d’ADN	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x RSB Solution
2 % dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Ne jamais refroidir FDS pour éviter  ; précipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Protéinase K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Tampon étalon de réticulocytes (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1  ;   ;
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5  ;   ;
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
			d’agarose dénaturant
1,2 % Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Laisser le gel se solidifier pendant au moins 1 h //// 9012-36-2
10X Tampon
0,2 M Sel de sodium MOPS, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Ne pas confondre le sel de sodium MOPS avec MOPS //// 71119-22-7
Agarose Colorant
1x tampon
3 % formaldéhyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dangereux //// 50-00-0
50 % formamide	Sigma-Aldrich	47670	Dangereux //// 75-12-7
Bromure d’éthidium (EtBr) 30 &mu ; g/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Dangereux //// 1239-45-8
Bleu de bromophénol  ;	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9  ;
FRACTIONNEMENT DE L’ARN
Petit Charges de gel plates Life	Technologies	LC1002
Savant SpeedVac	Concentrator Thermo Scientific  ;	de l’ADN120
, mini-PROTEAN Tetra Cell  ;	Biorad	165-8000
			d’acrylamide dénaturant
10 % acrylamide/bis-acrylamide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Dangereux. Laisser polymériser le gel pendant 45 min avant utilisation
1x tampon TBE (ou 1x tampon MOPS)
7 M urée	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0,1 % persulfate d’ammonium	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0  ;
0,1 % TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Règle de gène Échelle d’ADN ultra basse gamme (10 pb-pas)	Thermo Scientific	SM1211	Label 0.1 &mu ; g, comme décrit dans la réaction de « marquage de la sonde »
Colorant bleu d’acrylamide  ;
50 % formamide	Sigma-Aldrich	47670	Dangereux //// 75-12-7
Bleu de bromophénol	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9  ;
Tampon d’exécution (RB)
1x tampon MOPS  ;
Alternative RB : 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1  ;
445 mM d’acide borique	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4  ;   ;
			de coloration en gel
Bromure d’éthidium 0,5 &mu ; g/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Dangereux //// 1239-45-8
1x RB			Tache pendant 15 min avec EtBr, décoloration pendant 15 min sans EtBr
BLOT
3MM Papier Whatman	Sigma-Aldrich	Z270849
Membrane en nylon neutre, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Photosensitive
CROSSLINKING
Solution de réticulation (XLS)
1 % 1-méthylimidazole (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Préparez toujours une nouvelle aliquote de XLS //// 616-47-7
12,5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Dangereux //// 7647-01-0
3,1 % EDC (p/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8  ;   ;
(PRE)-HYBRIDIZATION
Compteur de scintillation liquide  ;	Beckmann	LS 6500
Sperme de saumon cisaillé, 0,1 mg/ml  ;	Life Technologies	AM9680
sonde			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-sonde
		anti-sens ARNr	5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279
sonde			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286
sonde			5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Purification
Kit, Illustra MicroSpin G-25 Colonnes	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pré)-Hybridization Solution (HS)
0,5 % SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3  ;
5x Denhardt’s Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5  ;   ;
0,2 M phosphate de sodium	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9  ;   ;
20 mM d’EDTA (pH 8,0)	Sigma-Aldrich	EDS	; 60-00-4  ;   ;
50x Denhardt’s Solution
1 % Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1 % Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1 % BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8  ;   ;
1X Tampon
10 mM Tris-Cl (pH 8,0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1  ;
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5  ;   ;
1 mM d’EDTA (pH 8,0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4  ;   ;
			de la sonde
0.4 &mu ; Oligonucléotide
M 1,5 &mu ; l Ci/&mu ; l [&gamma ;-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	Dangereux //// 51963-61-2
1x T4 Polynucléotide kinase Tampon	Biolabs	B0201
T4 Polynucléotide kinase 0,5 unités/&mu ; l	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
LAVAGE
Détecteurs Geiger Mueller	Canberra Industries	MCB2/CPS &ndash ;
tampon de lavage (WB), 2x tampons de lavage stricts
0,2x SSPE
2x SSPE, 0,5 % SDS
0,2x SSPE, 0,5 % SDS
DÉTECTION DE SIGNAL
Système PharosFX Plus	Biorad	170-9460
Image J	Disponible gratuitement
Quantité Un	radiographique Biorad
, BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	photosensible
pour films radiographiques	Sigma-Aldrich	P7042
Fixateur pour films radiographiques	Sigma-Aldrich	P7167
STRIPPING
Solution
10 mM Tris-HCl pH 8,8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1  ;
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4  ;   ;
0,1 % SDS	Sigma-Aldrich	71736	Ajouter SDS après ébullition pour éviter la formation de mousse //// 151-21-3

CATALOGUE PBS, , , Réactif TRIzol, Gel MOPSde chargementMOPSÉlectrophorèse verticale Gel Solution anti-sens rasi4 anti-sens anti-sens TENÉtiquetage EM77021 SSPE film Révélateur de décapage