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Article de méthode

Analyse métabolomique de cerveau de rat par la Résolution nucléaire Haute spectroscopie par résonance magnétique d'extraits de tissus

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DOI :

10.3791/51829

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21 septembre 2014

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1Centre de Résonance Magnétique Biologique et Médicale, UMR 7339 CNRS, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université, 2Centre de Recherches en Oncologie Biologique et Oncopharmacologie, UMR 911 INSERM, Faculté de Médecine, Aix-Marseille Université

Dans cet article

Résumé

La neurochimie du cerveau des mammifères est modifiée dans de nombreuses maladies neurologiques et systémiques. Des profils caractéristiques des métabolites cérébraux peuvent être obtenus efficacement à partir d’extraits bruts de tissu cérébral. À cette fin, la spectroscopie RMN à haute résolution est utilisée, permettant une analyse quantitative détaillée des concentrations de métabolites (métabolomique).

Résumé

Les études de l’expression génique au niveau de l’ARN et des protéines sont utilisées depuis longtemps pour explorer les processus biologiques sous-jacents à la maladie. Plus récemment, la génomique et la protéomique ont été complétées par une analyse quantitative complète du pool de métabolites présents dans les systèmes biologiques. Cette stratégie, appelée métabolomique, vise à fournir une caractérisation globale du complément de petites molécules impliquées dans le métabolisme. Alors que le génome et le protéome définissent les tâches que les cellules peuvent accomplir, le métabolome fait partie du phénotype proprement dit. Parmi les méthodes actuellement utilisées en métabolomique, les techniques spectroscopiques présentent un intérêt particulier car elles permettent d’analyser simultanément un grand nombre de métabolites sans sélection préalable pour des voies biochimiques spécifiques, permettant ainsi une approche large et impartiale. Ici, un protocole expérimental optimisé pour l’analyse métabolomique par spectroscopie RMN à haute résolution est présenté, qui est la méthode de choix pour une quantification efficace des métabolites tissulaires. Les points forts importants de cette méthode sont (i) l’utilisation d’extraits bruts, sans qu’il soit nécessaire de purifier l’échantillon et/ou de séparer les métabolites ; (ii) la nature intrinsèquement quantitative de la RMN, qui permet de quantifier tous les métabolites représentés par un spectre RMN avec un seul composé de référence ; et (iii) la nature non destructive de la RMN permettant l’utilisation répétée du même échantillon pour plusieurs mesures. La gamme dynamique des concentrations de métabolites pouvant être couvertes est considérable en raison de la réponse linéaire des signaux RMN, bien que les métabolites présents à des concentrations extrêmement faibles puissent être difficiles à détecter. Pour les composés les moins abondants, la méthode de spectrométrie de masse très sensible peut être avantageuse, bien que cette technique nécessite des procédures de préparation et de quantification d’échantillons plus complexes que la spectroscopie RMN. Nous présentons ici un protocole RMN adapté à l’analyse du cerveau du rat ; Cependant, le même protocole peut être appliqué à d’autres tissus avec des modifications mineures.

Introduction

Les modèles murins ont été utilisés largement dans la recherche du cerveau 1. Corrélation génotype-phénotype ont été étudiés dans le cerveau de souris et de rats par l'étude de l'expression des gènes à l'ARN et / ou les taux de protéine, d'une part, et les phénotypes morphologiques, fonctionnelles, électrophysiologiques et / ou du comportement de l'autre 6.2. Toutefois, pour bien comprendre les mécanismes liant phénotype génotype, il est impératif d'enquêter sur les événements moléculaires en aval de l'expression des protéines, c'est à dire. le métabolisme des substrats biochimiques des enzymes qui agissent sur ​​7. Cette exigence a conduit, au cours des 10 à 15 dernières années, à une renaissance de la recherche métabolique dans de nombreuses branches de la biologie 8,9. Alors que les études métaboliques classiques ont souvent été axées sur les détails de voies spécifiques, la nouvelle approche métabolomique est orientée vers une enquête englobe tout du profil métabolique global du tissu à l'étude.Une conséquence de ce concept est une nécessité évidente pour les outils d'analyse qui minimisent biais en faveur des voies et / ou classes de composés métaboliques spécifiques. Cependant, un dosage biochimique classique est basé sur une réaction chimique particulière d'un analyte spécifique qui doit être déterminée avant le dosage est effectué. En revanche, les techniques spectroscopiques telles que la résonance magnétique (RMN) nucléaire et la spectrométrie de masse (MS) (i) sont basés sur certaines moléculaires propriétés (physiques) des composés biochimiques, dont chacune donne lieu à une ou plusieurs signaux distincts dans un spectre détectées au cours d'une expérience; et (ii) détecter un grand nombre de composés différents par expérimentation.

Ainsi, chaque spectre contient les informations combinées de toute une série de métabolites. Pour cette raison, les méthodes spectroscopiques sont des outils appropriés pour la métabolomique, comme aucune sélection préalable doit être faite en ce qui concerne la nature de l'analyte à mesurer huit . En conséquence, ces techniques se prêtent naturellement à des études exploratoires car ils facilitent grandement la détection de changements métaboliques inattendues.

Bien que la spectroscopie RMN et MS peuvent être utilisés indifféremment pour l'analyse de nombreux métabolites, chaque méthode présente des avantages et des inconvénients qui ont été récemment examinés 10 spécifiques. En bref, la spectroscopie RMN peut généralement être effectuée à partir des extraits bruts et ne nécessite pas la séparation chromatographique de composés de l'échantillon avant l'analyse. En revanche, MS fonctionne avec du gaz ou la chromatographie liquide (GC ou LC) séparation, sauf pour certains développements récents tels que l'imagerie par spectrométrie de masse. Dans quelques cas particuliers, tels que l'analyse des sucres, la séparation des cristaux liquides peut devenir une nécessité pour la spectroscopie RMN et, car les lignes de résonance des différents sucres se chevauchent de manière significative au proton (1 H) Les spectres de RMN. Néanmoins, 1 H spectroscopie RMN sans chrséparation omatographic reste la méthode la plus populaire métabolomique, presque universellement appliquée RMN. En général, la préparation de l'échantillon est plus longue et complexe pour MS que pour la spectroscopie RMN. Problèmes graves en raison des effets de matrice sont beaucoup moins fréquents en spectroscopie RMN que dans les États membres où elles peuvent conduire à des signaux considérablement atténués. Métabolite quantification peut être réalisée avec les deux méthodes. Cependant, plusieurs types de composés sont nécessaires pour la MS en raison de variations dans les effets de matrice et de l'efficacité d'ionisation entre les métabolites. En revanche, une seule norme par échantillon est nécessaire pour une analyse spectroscopique RMN car dans des conditions de mesure appropriés, la dernière méthode est intrinsèquement grâce quantitatives à la réponse RMN strictement linéaire par les noyaux observés. Un inconvénient majeur de RMN est sa sensibilité relativement faible. MS, en particulier LC-MS, est plus sensible que la RMN de plusieurs ordres de grandeur; pour cette raison, la SEP est préférable à la RMN pourl'analyse des composés d'origine à des concentrations très faibles. D'autre part, la nature non destructive de l'expérience de RMN est un net avantage sur MS; de cette façon, la RMN peut être effectuée plusieurs fois sur le même échantillon, par exemple, pour les différents noyaux de RMN-actifs tels que le 1 H, du phosphore 31 (31 P), le carbone 13 (13 C), du fluor 19 (19 F) etc., étant donné qu'aucun produit est consommé par RMN, par opposition à des mesures de sclérose en plaques.

Les deux RMN et MS peuvent être utilisés dans des modes différents, chacun d'eux étant optimale pour la détection de composés possédant des caractéristiques chimiques. Par exemple, 31 P RMN est souvent mieux que 1 H RMN pour l'analyse de composés phosphorylés modérément concentrée, bien que presque tous les métabolites phosphorylés contiennent également des protons. Cependant, leurs signaux RMN 1 H peuvent être masquées par une signaux H RMN d'autres composés, non phosphorylés, tandis que le secondévidemment pas provoquer un bruit de fond dans 31 spectres RMN P. Dans une situation analogue, 19 F analyse RMN est préférable pour les composés fluorés, par exemple, les médicaments fluorés (pas de signaux de fond de métabolites endogènes), tandis que le cas particulier de RMN 13 C est d'un intérêt presque exclusivement si le sort de 13 C précurseurs métaboliques marqués exogènes doivent être suivis, en raison de la très faible abondance naturelle de l'isotope 13 C (environ 1%). Beaucoup de spectromètres de masse travaille en mode ion négatif ou en mode d'ions positifs. Par conséquent, il est important de savoir à l'avance si l'analyse des ions à observer sont chargés positivement ou négativement. Nous nous concentrons ici sur un protocole pour l'analyse du métabolome de tissu cérébral par 1 H et 31 spectroscopie RMN P parce que cette méthode donne un grand nombre de concentrations de métabolites importants à faible coût en termes de (i) le temps nécessaire pour la préparation des échantillons d'une (ii) l'effort nécessaire pour le métabolite quantification. Toutes les expériences peuvent être effectuées en utilisant l'équipement d'un laboratoire de chimie par voie humide classique et un centre de la spectroscopie RMN à haute résolution. D'autres exigences sont décrites dans la section ci-dessous de protocole.

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Protocole

REMARQUE: l'éthique animale DÉCLARATION
Les études animales sur des rats ont suivi les directives en vigueur en France, et ont été approuvés par le Comité local d'éthique (# 40.04, l'Université de l'École de médecine d'Aix-Marseille, Marseille, France).

1. récolte et de congélation de cerveau de rat

  1. Préparer les éléments nécessaires: azote liquide (N 2liq.) Dans Dewar qui est suffisamment grande pour maintenir un serrage à la congélation (au moins 2 à 3 L de volume); anesthésie (par exemple, l'isoflurane, ou de kétamine / xylazine); chambre d'anesthésie; outils de dissection stériles: ciseaux chirurgicaux, scalpel, pince; mouchoirs en papier et une bouteille d'alcool de nettoyage (éthanol); aiguilles (25 G); 1 ml et 10 ml de seringues. Feuilles étiquette d'aluminium (environ 10 x 10 cm) avec du ruban adhésif. Utilisez des feuilles pour envelopper cerveaux de rats de gel-serré individuels.
    REMARQUE: Toujours porter des gants et des lunettes de protection des yeux ou un masque lors de la manipulation de l'azote liquide!
  2. Remplissez Dewar avec N 2liq. Et placer gratuitementzing pince dans un Dewar. Assurez-vous que la quantité de N dans le 2liq Dewar est suffisante pour les procédures de congélation-clamp répétées (plusieurs litres, la quantité de N 2liq évaporation pendant chaque serrage par congélation dépend de la taille de la pince).
  3. Anesthésier des animaux (par exemple, par l'isoflurane, ou par injection intra-péritonéale d'un mélange de kétamine / xylazine). Procédez à l'euthanasie par ponction cardiaque pour prévenir les saignements lors du cuir chevelu est retiré et le crâne est ouvert. Étapes 1.4-1.7 ci-dessous décrivent la procédure standard.
    REMARQUE: Dans protocoles spéciaux nécessitant une préservation maximale de glucose et de métabolites de haute énergie, par sacrifice rat entonnoir congélation du cerveau de l'animal anesthésié avec de la N 2liq 11 après la rétraction du cuir chevelu. Ensuite, disséquer le cerveau sur le crâne sous intermittent N 2liq pour minimiser le métabolisme post-mortem 12.
  4. Humidifiez la tête de rat d'alcool de nettoyage. Utilisez des ciseaux chirurgicaux à (i) remcuir chevelu ove, et (ii) le crâne ouvert le long de sutures crâniennes.
  5. Utilisez une pince pour ouvrir le crâne plus loin, et de supprimer tout le cerveau par le dessous du crâne ouvert, le positionnement de la tête à l'envers. Retirer rapidement les traces visibles de sang à l'aide de mouchoirs en papier. Si hémisphères cérébraux et sont métaboliquement morphologiquement symétrique, il est commode d'utiliser l'un des hémisphères d'analyse métabolique après l'avoir séparé de l'autre hémisphère de l'incision avec un scalpel. Si nécessaire, utilisez l'hémisphère restant pour d'autres études sur le cerveau telles que l'histologie.
  6. Enlever rapidement le gel pince de N 2liq -filled Dewar, placez entier ou demi-cerveau de rat sur ​​une surface intérieure, pince et insérez immédiatement le gel pince en N 2liq -filled Dewar tout en maintenant fermement pince comprimé. Assurez-vous que les étapes 1.3-1.6 pas prendre plus de 60 secondes.
  7. Après 1-2 min supprimer le gel de la pince Dewar, pince ouverte, desserrer les tissus du cerveau congelé de pince, et une pelliculetissu congelé dans une feuille d'aluminium correctement étiquetés (voir 1.1 ci-dessus). Assurez-vous que l'étiquette est lisible et reste bien en place après que l'échantillon est enveloppé. Placer rapidement échantillon enveloppé dans N 2liq. Effectuez toute la procédure le plus rapidement possible pour éviter la décongélation des tissus du cerveau congelé.
  8. Rangez échantillon congelé dans N 2liq ou dans un congélateur à -80 ° C jusqu'à l'extraction de métabolites.
    REMARQUE: Chaque fois qu'un échantillon biologique doit être stocké pendant plus d'un an, stockage à température N 2liq est préférable à -80 ° C. Cela vaut également pour le reste de ce protocole.

2 Préparation du métabolite méthode d'extraction

  1. Préparer homogénéiseur de tissus et des tubes à essai correspondants (par exemple, 10 mm de diamètre interne, en fonction du diamètre de l'arbre d'homogénéisation, le plus souvent en matière plastique). Utilisez homogénéisateurs électriques plutôt que homogénéisateurs entraînés manuellement (de broyeurs de tissus). Prépare vortex et balance de laboratoire.
  2. Préparer un seau rempli de glace pilée. Gardez quantitites suffisamment de méthanol, le chloroforme et de l'eau sur la glace (4 ml chacun par 250-350 mg de tissu cérébral congelé).
  3. Préparer pipettes de transfert et des flacons.
    1. Préparer des flacons en verre (≥20 volume ml) avec bouchons à vis et les placer sur la glace (un flacon par extrait de tissu). Vis Fit caps d'un revêtement résistant au chloroforme cloisons en téflon.
    2. Préparer 5 ml pipettes en plastique pour la distribution de l'eau et du méthanol, et des pipettes en verre ou de seringues Hamilton pour la distribution de chloroforme. Préparer pipettes en plastique supplémentaires (5 ou 10 ml de volume) pour transférer des mélanges de homogénat de tissu et de méthanol.
    3. Assurez-vous que toute la verrerie est rincée avec de l'eau distillée et sécher soigneusement avant de les utiliser pour éliminer les traces d'impuretés, notamment formate détectable par RMN et l'acétate.
  4. Remplissez porcelaine mortier avec N 2liq, lieu porcelaine pilon dans le mortier et le remplir avec N 2liq. Azote s'évapore jusqu'à ce que la température de mortier et un pilon est suffisamment faible. Gardez petite quantité de N 2liq dans le mortier.

3 Extraction des métabolites

  1. Retirer échantillon de tissu du cerveau congelé de stockage (N réservoir de 2liq ou -80 ° C congélateur). Ensuite, transférer immédiatement échantillon de tissu au mortier partiellement rempli de N 2liq.
  2. Utilisez le N de pilon -cold de briser le tissu cérébral congelé en morceaux plus petits qui s'insèrent facilement dans les tubes à essai utilisés pour l'homogénéisation des tissus. Pour éviter que des morceaux de tissus congelés d'être projetée hors du mortier dans le processus, diviser le tissu, tout en étant enveloppés dans une feuille d'aluminium. Ne pas broyer les tissus congelés en poudre car cela rendrait le transfert de l'éprouvette plus difficile (augmentation des risques de condensation de l'eau). IMPORTANT: Tout au long de la procédure, ajouter N 2liq au mortier comme nécessaire pour maintenir l'échantillon à l'état surgelé.
  3. Mix spièces de centres commerciaux de tissu cérébral congelé à fond, pèsent sur 250-350 mg et transférer dans un tube à essai rempli de méthanol glacé (4 ml pour les tissus du cerveau 250-350 mg). Chaque fois que les morceaux de tissu congelé sont ajoutés, homogénéiser ces immédiatement à l'homogénéiseur de tissus.
    REMARQUE: Terminez toute cette procédure rapidement pour éviter (i) la condensation d'eau importante sur l'échantillon qui conduirait à une surestimation du poids de l'échantillon, et (ii) le chauffage et la décongélation de l'échantillon. Morceaux de tissu individuels doivent être à l'état congelé au début du processus d'homogénéisation.
  4. Après la dernière pièce de l'échantillon de cerveau de rat congelé a été ajouté au tube à essai et on l'homogénéise, transférer le produit d'homogénéisation à une ≥20 ml flacon en verre d'un volume, à proximité bouchon à vis et laisser reposer sur de la glace pendant 15 min. Si le volume de l'éprouvette n'est pas suffisamment grande pour la ≥4 de methanol, en utilisant un petit volume de methanol pour homogénéiser une partie du tissu cérébral congelé, transférer le mélange de l'flacon de verre et continuer à homogénéiser les morceaux de tissu résiduels avec du methanol frais. Assurez-vous que le volume de méthanol totale est de 4 ml par 250-350 mg de tissu cérébral.
  5. Ajouter le même volume de chloroforme refroidi à la glace (par exemple, 4 250 à 350 ml par mg de tissu cérébral) d'homogénat, vortex et laisser reposer complètement sur ​​de la glace pendant 15 min.
    REMARQUE: Toujours utiliser ventilé hotte chimique lors de la manipulation des solvants volatils, notamment le chloroforme!
  6. Ajouter le même volume d'eau (soit 4 ml par 250-350 mg de tissu cérébral) à homogénat, vortex soigneusement et laisser reposer à -20 ° C pendant la nuit.

4 Préparation de la phase de séparation et l'évaporation du solvant

  1. Préparer centrifugation à froid (4 ° C, 13 000 x g à rayon maximum) et des tubes de centrifugation. Faire en sorte que ceux-ci sont ≥20 ml de volume, résistant au chloroforme, et peut résister à des forces centrifuges de 13 000 x g. Utilisez des tubes à centrifuger en verre dédiés mais rincer (comme toute la vaisselle de verre) avec de l'eau distillée êtreutilisation avant (voir 2.3).
  2. Préparez soigneusement rincés pipettes Pasteur en verre et un propipettor approprié (ampoule, pompe à pipette manuelle, automatique pipette aide / pipette, etc.).
  3. Préparer deux tubes supplémentaires soigneusement rincés (≥15 volume ml) par échantillon de cerveau, dont l'un doit être résistant au chloroforme (en verre ou en téflon), l'autre au méthanol (en résistant au méthanol, ou un verre en plastique).
  4. Préparer solvant appareil d'évaporation (disponible dans le commerce ou de fabrication artisanale). Assurez-vous que ce dispositif fournit un flux finement contrôlée de gaz d'azote sec qui est dirigé sur la surface d'une solution d'extrait contenant des solvants volatils (methanol, chloroforme).
  5. Préparer deux plateaux ou des seaux remplis de glace supplémentaires: un pour le transport de l'échantillon sur la glace, et un autre pour garder les échantillons froids au cours du processus d'évaporation.
  6. Préparer lyophilisateur (sèche-gel) et les matériaux nécessaires pour la lyophilisation: (i) un 50ml tube de centrifugeuse ou vide ballon à fond rond par extrait, et (ii) N 2liq de geler la phase aqueuse des échantillons (≤0.3 L par exemple). Si tube de centrifugation est utilisée, préparer aussi à col large bouteille approprié pour lyophilisateur de filtre à vide.

5. séparation de phase et l'évaporation du solvant

  1. Pour la séparation de phases complète, transférer le broyat de tissu de méthanol / chloroforme / eau / cerveau (voir 3.6) dans un tube de centrifugeuse résistant chloroforme (volume ≥20 ml) et centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 40 min.
    REMARQUE: Les deux phases se forment, séparés par une couche de protéine précipitée. La phase (plus lourds) inférieur est constitué de méthanol, le chloroforme et les lipides dissous, tandis que la phase (plus légère) supérieure est constituée d'eau, de methanol et dissous métabolites solubles dans l'eau.
  2. Utiliser une pipette de Pasteur pour transférer la phase supérieure dans un tube approprié de ≥15 ml (résistant à methanol en plastique ou en verre). Gardez sur iCE.
  3. Utiliser une pipette Pasteur frais de transférer la phase inférieure à un tube ≥15 ml approprié (en verre ou en téflon). Garder sur la glace.
  4. Stocker la couche de protéine précipitée à -80 ° C si elle doit être utilisée pour la détermination des protéines totales; ou bien le jeter.
  5. Garder le tube avec la phase eau / méthanol (voir 5.2) sur de la glace et évaporer le méthanol en dirigeant un courant d'azote sec sur la surface de la solution d'extrait. En variante, doucement barboter de l'azote à travers la solution d'extrait. Mettre fin au processus d'évaporation lors de barbotage d'azote ne provoque plus la réduction de volume dans la solution d'extraction. A ce moment, passez à la lyophilisation (voir 5.7), ou le congeler et conserver l'échantillon à -80 ° C avec le tube fermé (bouchon à vis ou parafilm) avant d'être prêt pour la lyophilisation.
  6. Placer le tube à la phase de méthanol / chloroforme (voir 5.3) sur de la glace et évaporer le méthanol en dirigeant un courant d'azote sec sur le surface de la solution d'extrait. Quand tout le solvant est évaporé, mettre fin au processus et de garder l'échantillon à -80 ° C avec le tube fermé (bouchon à vis ou parafilm) jusqu'au moment de l'analyse par RMN.
  7. Préparer la phase aqueuse pour lyophilisation
    1. Après la fin de l'évaporation du méthanol (voir 5.5), transférer l'échantillon dans un tube à centrifuger de 50 ml soigneusement rincés (si l'échantillon est congelé, décongeler avant transfert). Sinon, le transfert à un vide ballon à fond rond.
    2. Congeler la solution d'extrait en faisant tourner le tube de centrifugeuse (ou ballon à fond rond) partiellement inséré dans 2liq N de telle sorte que la surface intérieure du tube ou flacon est progressivement recouverte par le liquide congelé. Assurez-vous qu'aucun N 2liq. Peuvent entrer dans le réceptacle.
    3. Lorsque tout le liquide est gelé, couvrir le tube avec un couvercle percé ou bouchon à vis pour permettre à la vapeur de s'échapper, et placer le tube dans un filtre à vide bouteille à large col.
    4. Lancer lyophilisation après l'attaChing le flacon ou bouteille à lyophilisateur l'.
  8. Mettre fin au processus de lyophilisation lorsque l'échantillon est entièrement sec. Conserver l'échantillon à -80 ° C dans un tube fermé (avec un capuchon étanche!) Jusqu'à son utilisation pour l'analyse RMN.
    REMARQUE: Généralement pas plus de 24 heures sont nécessaires pour la lyophilisation. Plusieurs échantillons peuvent être lyophilisés en même temps, en fonction de la conception du lyophilisateur, et du fait que des tubes de centrifugation dans des bouteilles à col large ou flacons à fond rond sont utilisées.

6 Préparation des échantillons RMN

  1. Séché magasin et extraits lyophilisés à très basse température (≤ -80 ° C). Re-dissoudre lyophilisats pour la préparation d'échantillons RMN immédiatement avant l'expérience RMN.
    REMARQUE: L'enregistrement des échantillons en solution et / ou proche de la température ambiante peut conduire à une dégradation de l'échantillon!
  2. Préparer une solution aqueuse 200 mM de l'agent chélateur, l'acide trans-1,2-cyclohexyldiaminetetraacetic (CDTA), comme suit:
    1. Ajouter de l'eau pure (par exemple, 20 ml) dans un tube de centrifugeuse de tube ou de test, et ajouter la quantité de poudre nécessaire pour générer CDTA une solution 200 mM.
      REMARQUE: Une proportion importante de CDTA ne sera pas soluble, parce que le pH est très faible, car la forme acide du CDTA a été utilisé plutôt qu'un sel CDTA.
    2. Ajouter avec précaution, étape par étape, des quantités croissantes de poudre CsOH à la solution CDTA, et vortex soigneusement après chaque addition.
      REMARQUE: La fraction soluble CDTA va augmenter avec l'augmentation de la teneur CsOH dans la solution aqueuse. Éviter "surtitrage", c'est à dire ajouter inférieure à la quantité stoechiométrique de CsOH à la solution CDTA.
    3. Lorsque la quasi-totalité de la poudre CDTA est dissous, commencer à mesurer le pH après chaque addition CsOH et vortex approfondie. Terminate CsOH addition lorsque le pH final est atteinte (tableau 1).
      NOTE: A cette époque, tout le CDTA sera dissoute. L'utilisation de Cs + en tant que contre-ion à CDTA est generallié préféré sur Na + ou K +. Cs + est un acide de Lewis doux en raison de son grand rayon ionique, par opposition aux Na + et K + qui ont de plus petits rayons ioniques et sont des acides forts. Par conséquent, Cs + forme des complexes avec les phosphates (bases dures) moins facilement que Na + et K +. Ceci est avantageux pour 31 P spectroscopie RMN des métabolites phosphorylés parce complexation tend à augmenter largeurs de raies de RMN, notamment dans des conditions de faible à échange d'ions intermédiaire.
  3. Par analyse RMN du 31 P des phospholipides (PL), dissolvent les lipides séchés (voir 5.6) dans 700 ul d'un mélange de solvants constitué par du chloroforme deutérié (CDCl 3), le méthanol et la solution CDTA préparé comme décrit en 6.2 (5: 4: 1 rapport en volume). Transférer l'échantillon dans un tube à centrifuger. Utilisez directe déplacement (ou volumétrique) micropipette avec du chloroforme-résisterconseils de fourmis dans les deux étapes.
    REMARQUE: Gardez à l'esprit que toute modification des paramètres suivants affecte l'aspect (déplacement chimique et des largeurs de ligne) de PL 31 P spectres RMN 13-17:
    (I) le rapport de volume CDCl3: solution CDTA: MeOH
    (Ii) le volume total de solvant utilisé
    (Iii) le pH du composant aqueux du solvant
    (Iv) CDTA concentration du composant aqueux du solvant.
    REMARQUE: En général, réglage fin de ces paramètres de l'échantillon (tableau 1) n'est pas nécessaire, et doit être effectuée avec un soin extrême, si désiré dans des cas particuliers. Modification du rapport en volume entre les solvants facilement en résulte la formation d'un système constitué de deux phases au lieu d'une phase homogène! Le système à une phase a été jugée plus pratique que le système à deux phases dans la plupart des applications 13,14.
  4. Pour une analyse RMN de métabolites hydrosolubles, dissoudre lyophilisat (voir 5.8) en 700 ul de l'oxyde de deutérium (D 2 O), contenant de 3 (triméthylsilyle) de sel de sodium de l'acide propionique-2,2,3,3-d4 (TSPD 4) dans la plage millimolaire (D 2 O contenant 0,05% TSPD 4 est disponible dans le commerce) . Transférer l'échantillon dans un tube à centrifuger.
  5. Ajuster le pH de la solution d'extrait aqueux obtenu à 7,3 par addition de petites quantités (environ 2 pi) de chlorure de deuterium (DCL) et des solutions deutéroxyde de sodium (NaOD). Tout d'abord, commencer par 0,02 N solutions DCL ou NaOD. Si 2 ou 3 ajouts ultérieurs ne provoquent pas de changement de pH suffisant, passez à 0,2 N solutions DCL ou NaOD. Veillez à ne pas overtitrate.
    NOTE: Le montant global de la solution SLCD ou NaOD nécessaire dépend de la quantité de tissu cérébral extrait; noter cette valeur pour la quantification précise métabolite. Dans la plupart des cas, les volumes combinés des solutions DCL et NaOD ajoutés devraient être pratiquement négligeable (près de 1% du volume de l'échantillon RMN).
itre "> 7. Performance de l'expérience RMN 31 P pour Brain phospholipides Analyse 13,14

  1. Pour de meilleurs résultats, utilisez un spectromètre de RMN à haute résolution polynucléaires (≥9.4 Tesla champ, correspondant à 162 MHz 31 P, ou 1 400 MHz les fréquences de résonance H). En plus de la bobine 31 P, veiller à ce que le P RMN sonde 31 possède une bobine 1 H pour découplage des protons. Régulation de la température de consigne de la sonde de RMN à une valeur cible désirée (généralement 25 ° C).
    REMARQUE: la température de la sonde peut avoir besoin de 10-20 min à stabiliser!
  2. Solution Centrifugeuse PL extrait dans un tube à centrifuger (voir 6.3) à 4 ° C et 11 000 g pendant 30 min à ralentissent résidus solides dans l'échantillon. Transférer 600 pl de surnageant dans un tube de RMN de haute qualité (de diamètre extérieur de 5 mm).
  3. Préparer la tige d'insert coaxial approprié rempli d'une solution aqueuse à 20 mM méthylènediphosphonate (MDP) à un pH de 7,0 pour le référencement déplacement chimiqueet la quantification. Placer cet insert dans le tube de RMN rempli d'une solution d'extrait de PL.
  4. Monter le tube RMN avec le spinner approprié et le transfert à l'aimant de RMN. Maintenant tourner l'échantillon à 15-20 Hz et attendre jusqu'à ce que l'échantillon s'est adapté à la température de consigne (environ 10 min).
  5. Minimiser soigneusement inhomogénéité de champ magnétique dans l'échantillon en ajustant sur ​​l'axe et hors axe courants de bobine de cale 18.
  6. Réglez RMN paramètres d'acquisition du spectre de valeurs optimales, qui peuvent varier en fonction de l'intensité du champ magnétique (pour un système 9.4 T, voir le tableau 1 pour les valeurs des paramètres recommandés).
  7. Définir le nombre de transitoires par expérience (= NS).
    1. Situé à environ 80 NS (durée totale de l'acquisition de données d'environ 20 min), si seulement les MDD plus répandues doivent être quantifiés avec précision (phosphatidylcholine (PtdCho), la phosphatidyléthanolamine (PtdEtn), l'éthanolamine plasmalogène).
    2. Situé à environ 100-200 NS (durée totale de dacquisition ata 1-2 h) si les MDD sont moins concentrées à être quantifiée (alkyl-acyl-phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, la phosphatidylsérine, l'acide phosphatidique).
    3. Situé à environ NS 1500-2000 (durée totale de l'acquisition de données 7-10 h; expérience la nuit) si PL très faible concentration doivent être quantifiée, par exemple mono phosphatidylinositol et diphosphates (PtdIP et PtdIP 2), la cardiolipine, lyso-PL , alkyl-acyl-phosphatidyléthanolamine, et parfois d'autres.
  8. Après la fin de l'acquisition du spectre, procédé décroissance d'induction libre (FID) à l'aide des paramètres optimisés. Les valeurs de ces paramètres varient en fonction de la force de champ magnétique, la qualité de la cale, et le signal PL à quantifier.
    1. Pour obtenir les meilleurs résultats pour l'ensemble de la gamme des MDD, répéter (au moins deux) des procédures de filtrage différentes de traitement utilisant multiple. Utilisez amélioration de la résolution forte pour les signaux fortement se chevauchent, par exemple., Pour PtdCho et PtdEtnrégions.
    2. Utilisez filtrage puissant (faible ou nulle amélioration de la résolution) pour les signaux faibles.
    3. Filtre signaux très faibles et larges sans chevauchement significatif par apodisation (par exemple, LB = 3 Hz) afin d'augmenter le rapport signal sur bruit, par exemple PtdIP PtdIP et 2. Voir le tableau 1 pour les paramètres de traitement caractéristiques.
  9. Quantifier la zone de chaque signal PL par rapport à la surface sous le signal du composé de référence (MDP) dans le même spectre.
  10. Calibrer le signal du composé de référence (PDM) dans une expérience séparée, au moyen d'un tube RMN de 5 mm rempli avec (i) un composé de concentration connue de phosphore, et (ii) de la même tige d'insert coaxial utilisé dans PL 31 expériences P RMN ( voir 7.3 et 7.9).
  11. Calculer les concentrations PL individuels en fonction des domaines relatifs des signaux PL d'une part (voir 7.9), et sur ​​la valeur de calibrage obtenue pour MDP deinsert coaxial sur l'autre (voir 7.10). Prendre en compte le fait que le nombre de noyaux de phosphore qui contribuent à un signal particulier de 31 P RMN peut varier en fonction de l'origine moléculaire de ce signal.
    REMARQUE: Le signal de phosphonate MDP (généralement référencé à 19.39 ppm) représente deux noyaux de phosphore, de même que le signal de phosphate de cardiolipine. Tous les autres signaux PL 31 P RMN détectés dans des extraits de cerveau représentent un noyau de phosphore chacun.
  12. Utiliser un logiciel de statistiques que nécessaire pour comparer les niveaux PL cerveau entre les groupes d'animaux.

8 Performance de l'Expérience 1 H RMN pour l'analyse de l'eau soluble métabolites du cerveau

  1. Régulation de la température de consigne de la sonde de RMN 1 H à la valeur cible souhaitée (généralement 25 ° C). Voir aussi les remarques 7.1.
  2. Centrifuger la solution aqueuse de l'extrait dans le tube à centrifuger (voir 6.5) à 4 ° C et 11 000x g pendant 30 min à tourner vers le bas des résidus solides de l'échantillon. Transférer 600 pl de surnageant dans un tube de RMN de haute qualité (de diamètre extérieur de 5 mm).
  3. Transfert tube de RMN à l'aimant de RMN, cale et fixés spectre RMN paramètres d'acquisition de valeurs optimales, comme expliqué dans 7,4-7,6. Voir aussi le tableau 1 pour les valeurs des paramètres recommandés.
  4. Définissez le nombre de transitoires par expérience à environ NS = 32 (durée totale de l'acquisition de données environ 13 min). Pour obtenir de bons rapports signal-bruit pour des signaux très faibles, notamment dans la région aromatique, utiliser NS = 64 (durée totale d'acquisition de données environ 26 min) ou plus.
  5. Après la fin de l'acquisition du spectre, procédé décroissance d'induction libre (FID) à l'aide des paramètres optimisés. Les valeurs de ces paramètres varient légèrement en fonction de la force de champ magnétique, la qualité de la cale, et le signal de métabolite à quantifier.
    REMARQUE: Dans la plupart des cas, il suffit de traiter chaque spectre fois, En utilisant un ensemble de paramètres de traitement qui présentent un bon compromis pour tous les signaux de métabolites. Voir le tableau 1 pour les paramètres de traitement caractéristiques.
  6. Quantification de l'aire de chaque signal de métabolite (souvent un multiplet, qui se chevauchent parfois avec d'autres singulets ou multiplets provenant de différentes molécules) par rapport à la surface sous le signal du composé de référence (TSP-d 4) dans le même spectre.
  7. Calculer les concentrations de métabolites individuels basés sur TSP-d4 concentration (voir 6.4). Prendre en compte le fait que le nombre de protons qui contribuent à un signal particulier 1 H RMN peut varier en fonction de l'origine moléculaire de ce signal. Le signal TSP-d4 triméthyl (par rapport à 0,0 ppm) représente neuf protons.
  8. Utiliser un logiciel de statistiques que nécessaire pour comparer les niveaux de métabolites du cerveau entre les groupes d'animaux.

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Résultats

Pour obtenir une meilleure résolution dans les spectres RMN métabolique de cerveau et d'autres extraits de tissus, il a longtemps été une pratique courante pour enlever ou ions masque de métal (le plus important: les ions paramagnétiques) présents dans des solutions d'extraction. Ceci a été réalisé soit en ajoutant un agent chélateur tel que l'EDTA ou le CDTA à l'extrait 19, ou par passage de l'extrait à travers une résine échangeuse d'ions telle que Chelex-100 20. Les résultats présentés dans

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Discussion

La spectroscopie de RMN est une méthode efficace pour mesurer les concentrations des composés chimiques en solution d'une manière très reproductible et précise. Cependant, pour obtenir des données de haute qualité, il est nécessaire de respecter certaines règles concernant la préparation et l'analyse des échantillons. Dans la détermination de concentrations de métabolites par spectroscopie RMN, ni la production ni la réception du signal de RMN domine l'erreur de quantification, à moins que l'intensité d&...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Soutien du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 et 7339) est vivement remercié.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IsofluraneVirbacVetfluraneAnesthésique pour animaux
Vaporisateur IsofluraneOhmedaIsotec 3Nouveau modèle disponible : Isotec 4
Scalpel, ciseaux, pinces, pincesHarvard Apparatus
Fisher Scientific		divers
divers		Matériel chirurgical pour animaux
Outil de congélationhomebuiltn/aPince avec plaques en aluminium, à insérer
dans l’azote liquide pour le refroidissement
DewarNalgene4150-4000
Azote liquideAir Liquiden/a
Azote gazeuxAir Liquiden/a
Évaporateur d’azoteOrganomation AssociatesN-EVAP 111Peut être remplacé par un appareil de construction artisanale
Mortier Sigma-Aldrich
PilonSigma-AldrichZ247510
Homogénéisateurde tissus KinematicaPolytronAvec tubes à essai adaptant l’arbre de l’homogénéisateur
Balance électroniqueSartoriusn/a
MéthanolSigma-AldrichM3641
ChloroformeSigma-Aldrich366910
Tubes à centrifuger en verreKimble45500-15, 45500-30Kimax 15 ml, tube de 30 ml
Tubes à microcentrifugerKimble45150-2Kimax tube de 2 ml ; doit remplacer le tube « Eppendorf » s’il est compatible avec le rotor de la centrifugeuse
Pipettes en polystyrèneCostar CorningStripettes Volumes de 5 et 10 ml
DeutérochloroformeSigma-Aldrich43191599,96 % deutéré
Oxyde de deutériumSigma-Aldrich42345999,96 % deutéré
Chlorure de deutériumAlpha Aesar4240620 % dans l’oxyde de deutérium Deutéroxyde
sodiumSigma-Aldrich16448830 % dans l’oxyde de deutérium
LyophiliseurChristAlpha 1-2
Centrifugeuse à froidHeraeusMegafuge 16R
pH-mètreEutech CyberneticsCyberscan
CDTASigma-AldrichD0922
Hydroxyde de césiumSigma-Aldrich516988
tubes RMNWilmad528-PP
Insert coaxial de tige RMNSigma-AldrichZ278513By Wilmad
Pipettes RMNSigma-AldrichZ255688
PipettesEppendorfResearchAvec pointes pour des volumes de 0,5 à 1 000 &mu ; l
Spectromètre RMN Pipet-AidDrummondXP
BrukerAVANCE 400avec sonde et autres accessoires
Logiciel RMNBrukerTopSpin 1.3version plus récente disponible : Topspin 3.2
Composés étalons solubles dans l’eauSigma-Aldrichdivers
composésétalons phospholipidiquesAvanti Polar Lipids
Doosan Serdary
Sigma-Aldrich		divers
divers
diverses		Source de plasmalogènes, mais peut être < Pureté de 70 à 80 %
MéthylènediphosphonateSigma-AldrichM9508
TSP-d4Sigma-Aldrich269913
Z247472 de

Références

  1. Manger, P. R., et al. Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction. Front Neuroanat. 2, 5(2008).
  2. Buxbaum, J. D., et al. Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features. Mol Autism. 3, 1(2012).
  3. Papaioannou, V., Behringer, R. R. Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).
  4. Yu, F. H., et al. Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy. Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).
  5. Mallolas, J., et al. A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke. The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).
  6. Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).
  7. Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model. PLoS ONE. 2, e157(2007).
  8. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. Methodologies for Metabolomics. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  9. Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. Metabolomics in drug target discovery. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).
  10. Wishart, D. S. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  11. Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats. Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).
  12. Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel. NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).
  13. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution. Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).
  14. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation. Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).
  15. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Methodologies for Metabolomics. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).
  16. Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study. PLoS ONE. 8, e56101(2013).
  17. Lutz, N. W., Cozzone, P. J. Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy. Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).
  18. Pearson, G. A. Shimming an NMR magnet. , University of Iowa. Iowa City. (1991).
  19. Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. Biophysical tools for biologists. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).
  20. Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats. Stroke. 20, 633-640 (1989).

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