Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

Résumé

Suite à une exposition à des facteurs de stress environnementaux spécifiques, le nématode Caenorhabditis elegans subit une plasticité phénotypique extensive pour entrer dans un stade juvénile 'dauer' résistant au stress. Nous présentons des méthodes pour l’induction contrôlée et l’imagerie de la neuroplasticité au cours de la dauer.

Résumé

Les mécanismes qui contrôlent le stress induit par la plasticité phénotypique chez les animaux sont souvent complexes et difficiles à étudier in vivo. Un exemple classique de la plasticité induite par le stress est l'étape dauer de C. elegans. Dauers sont un stade de développement larvaire alternatif formé dans des conditions de faibles concentrations de produits alimentaires et de bactéries de fortes concentrations d'une phéromone de dauer. Dauers afficher vaste plasticité développementale et comportementale. Par exemple, un ensemble de quatre quadrants intérieure-labial (IL2Q) neurones subissent un remodelage réversibles lors de la formation de dauer. Utilisant l'entrée voies environnementales régulation dauer bien connu, une méthode précédemment établie pour la production de brut dauer phéromone de cultures de nématodes liquide à grande échelle est démontrée. Avec ce procédé, une concentration de 50 000 - 75 000 nématodes / ml de culture liquide est suffisante pour produire un brut très puissant dauer phéromone. La puissance de la phéromone brut est determined par un bio-essai dose-réponse. Enfin, les méthodes utilisées pour in vivo time-lapse imagerie des IL2Qs pendant la formation de dauer sont décrits.

Introduction

Plasticité phénotypique, y compris la plasticité développementale et comportementale, est important pour l'adaptation à des conditions environnementales défavorables et est considéré comme une force motrice dans l'évolution ^1. C. elegans est un organisme modèle fréquemment utilisé pour les études en matière de développement et de la neurobiologie. Dans des conditions idéales, C. elegans se développe à travers quatre stades larvaires avant d'entrer dans le stade de la reproduction des adultes. Cependant, dans des conditions de faible disponibilité de la nourriture et de fortes densités de population, C. elegans peut subir un commutateur de développement et entre dans une phase de longue durée et résistant au stress dauer ^2. Dauers présentent plusieurs différences morphologiques et comportementales des non-dauers qui interviennent probablement cette résistance au stress. Les signaux de l'environnement et des voies génétiques régulant l'entrée dauer ont été largement décrits ^{3, 4, 5, 6, 7.} Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les changements phénotypiques individuelles qui se produisent; dformation dauer ors sont moins bien compris.

L'examen des phénotypes spécifiques Dauer nécessite la production d'animaux de Dauer. Ceci peut être réalisé de trois façons: 1) Choisir à partir d'une culture de faim de C. elegans, 2) Utilisation de formation dauer constitutive (daf-c) mutants, 3) l'induction de la formation de dauer par phéromone purifiée. Il est relativement simple à prendre dauers partir d'une plaque NGM standard avec un C. population elegans qui a épuisé son approvisionnement alimentaire bactérienne. Dans nos mains, une plaque NGM standard, initialement ensemencé avec 50 pi de OP50 Escherichia coli, a permis de croître pendant 3 jours, puis inoculés avec 3 - hermaphrodites 4 adultes maintenue à 25 ° C sera épuiser l'approvisionnement alimentaire dans la semaine et de produire plusieurs milliers de dauers dans 3 jours supplémentaires (en plus de nombreux non-dauers affamés). Cependant, ce procédé n'est pas satisfaisant pour les processus se produisant pendant l'examen mue en dAuer. Il est difficile de déterminer lequel de plusieurs milliers d'animaux sur une plaque affamés typique entrent dans dauer. En outre, l'utilisation d'une plaque de faim n'offre aucune possibilité de synchronisation. L'utilisation de mutants daf-c permet la synchronisation et la génération fiable de dauers. Cependant, il n'existe aucune garantie qu'une mutation daf-c particulier n'affectera pas les autres phénotypes spécifiques Dauer seul ou en combinaison avec d'autres mutations.

La présence d'une phéromone dauer a été impliqué par Cassada et Russell et a démontré plus tard par Golden et Riddle. La phéromone dauer a depuis été caractérisé chimiquement ^{2, 8, 9, 10.} L'phéromone purifiée est constitué d'un mélange complexe de ascarosides, qui sous différentes formes réguler les processus comportementaux et de développement ^{9, 11.} Utilisation d'un extrait de phéromone brut dauer permet induction fiable contrôlée de dauers synchronisés dans un fond de type sauvage.

Le système nerveux et des cellules gliales associées subissent remodelage pendant dauer larve formation ^{12, 13, 14.} Certains de ces changements sont irréversibles, tels que la rénovation de cellules gliales au cours dauer ^{13, 14.} Cependant, d'autres événements de remodelage sont réversibles à un retour à favorable conditions environnementales. Par exemple, un ensemble de quatre neurones IL2Q neuronal subit un remodelage rapide et réversible lors de la formation de dauer comprenant: arborisation dendritique, un commutateur unique à partir de neurones à dendritique multidendritic remodelage axonal et ^12. Les présents procédés permettent l'imagerie in vivo fiable de la plasticité synaptique induite par le stress dans un organisme modèle. Les méthodes présentées pour la production et les essais de brut dauer phéromone sont décrits précédemment et compilées à partir de plusieurs sources ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocole

1. brut Dauer phéromone production

1. Cultivez OP50 E. coli à partir d'une seule colonie O / N à 37 ° C sous agitation dans 100 ml de bouillon LB, à 200 tpm. NOTE: Cette culture O / N peut être fait à l'avance et conservé à 4 ° C.
2. Cultivez N2 C. elegans à 15 au 20 juin cm boîtes de Pétri avec de la gélose NGM (voir la recette dans le tableau 1) ensemencé avec 50 ul de E. OP50 coli jusqu'à ce que les bactéries est presque épuisée ^19.
3. Assurez-5x 250 ml de S médias (voir la recette dans le tableau 1) dans 1 L Erlenmeyer ^19. NOTE: Cette solution peut être fait à l'avance.
4. Développer une culture de la OP50 E. coli dans 4 L de bouillon LB O / N par inoculation avec 1 ml de OP50 dans E. coli et agitation à 37 ° C pendant 16 heures.
5. Laver les nématodes à partir de plaques (étape 1.2) avec 1 ml de solution S de base (Voir la recette dans le tableau 1) et les nématodes de transfert 4-5 plaques dans chacune des 4 flacons 1 L Erlenmeyer avec les médias S préparés à l'étape 1.3 (4 5 plaquespour chaque flacon) ^19.
6. Centrifuger le OP50 de l'étape 1.4 à 650 g pendant 10 min et retirer le surnageant. Remettre en suspension chaque culot bactérien dans 10 ml de solution S basale. Transférer des quantités égales de bactéries remises en suspension à chaque flacon de nématodes.
7. Les flacons sont placés sur un agitateur orbital à température ambiante (20-25 ° C) et 100 à 150 tours par minute pendant 4-5 jours jusqu'à ce que la solution commence à se dégager, ce qui indique une diminution de l'alimentation.
8. Une fois que la nourriture est épuisée, développer une autre O / N culture de OP50 E. coli en 4x 1 L de bouillon LB. Centrifuger les bactéries à 650 xg pendant 10 min et ajouter une pastille d'un flacon de chacun des flacons de médias de S par les nématodes. Remettre les flacons de médias S à l'agitateur orbital, comme à l'étape 1.7, pour une période supplémentaire de 3 à 4 jours jusqu'à ce que la nourriture est épuisée encore une fois.
9. Il suffit de ~ 1 ml de solution aliquote de chaque fiole et estimer la concentration des nématodes par sous-échantillonnage 1 pl de chaque fraction aliquote de 1 ml et en comptant le nombre de nématodes. NOTE: L'population de nématodes devrait être 50.000 - 75.000 nématodes / ml. A cette concentration, la majorité des nématodes sont dauers.
10. Jeter les flacons contaminés. NOTE: La contamination se manifeste souvent que hyphes vu lors de l'étape 1.9.
11. Nématodes à centrifuger à 4000 g pendant 10 min à 4 ° C. Éliminer le culot de nématodes et conserver le surnageant. Sinon, voir la discussion sur l'utilisation de ces animaux pour faire une phéromone de faible puissance.
12. Filtrer le surnageant à travers ° 1 un papier filtre Whatman. REMARQUE: Une fiole à vide permettra d'accélérer ce processus.
13. Filtrer davantage le surnageant de 0,45 um vide stérile unités de filtration. REMARQUE: Le filtrat peut être conservé O / N à 4 ° C ou procéder à 1,14.
14. Ajouter le filtrat à un bécher de 2 L avec une barre d'agitation. Placez-les dans une hotte sur une plaque de chauffage d'agitation. Porter à ébullition en remuant et évaporer à environ 200 ml. Transférer la solution dans un bécher de 500 ml. Poursuivre l'ébullition jusqu'à environ 50 ml sont left. NOTE: Il faut faire attention lors de cette étape car il est possible pour la solution à déborder. La couleur des 50 derniers ml est un brun foncé. A tout moment pendant le processus de cuisson, la chaleur peut être désactivé et le filtrat stocké O / N à la température ambiante ou à 4 ° C.
15. Laisser refroidir et centrifuger pendant 5 min à 1000 x g. Verser le surnageant dans un bécher de 100 ml et jeter le culot.
16. Faire bouillir le surnageant jusqu'à une croûte brune. Retirer du feu et casser la croûte avec une spatule. Ajouter une quantité suffisante de l'éthanol 200 proof pour couvrir la croûte. Couvrir le bécher avec du parafilm et laisser reposer O / N à la température ambiante. Verser de l'éthanol dans un bécher propre et mettre sur le côté. Ajouter de l'éthanol frais pour couvrir la croûte. Répétez O / N extractions 3 fois. Réunir les extraits.
17. Utilisation d'une pompe à vide pour sécher les extraits éthanoliques. Si une pompe à vide n'est pas disponible, ajouter l'extrait à l'éthanol dans un bêcher propre et chauffée à 50 ° C sous agitation dans une hotte. REMARQUE: Une fois de l'éthanol s'est évaporé un résidu collant de lcouleur brun ight doit rester. Si le chauffage est utilisé, il faut prendre soin de ne pas brûler la solution par chauffage pendant trop longtemps.
18. Dissoudre résidu dans 10 ml d'eau distillée stérile. Stériliser par filtration de cette solution avec un filtre à seringue de 0,22 um et de conserver à -20 ° C en aliquots de 1 ml. NOTE: 1 ml d'eau est utilisé pour dissoudre le résidu par 100 ml de la culture de nématodes liquide d'origine. Par exemple, si l'un des flacons de culture liquide est rejetée en raison de la contamination, puis ajuster la quantité d'eau utilisée pour dissoudre le résidu.

2 Détermination de la réponse de la dose de phéromone

1. Préparez dauer phéromone en faisant 6x 5 ml de NGM médias avec de l'agar Noble, sans peptone, et additionné de 50 pg / sulfate de streptomycine ml et une gamme de dauer phéromone (voir la recette dans le tableau 1) ^{4, 19.} Mélanger les composants dans un 13x100 mm tube de culture en verre, faire bouillir sur un bec Bunsen, puis verser dans 3 cm des boîtes de Pétri.
2. Peser hTube icrocentrifuge. Ajouter 1 ml de O / N culture de E. coli OP50 sur le tube et centrifuger à 17 000 xg ~ dans un tube à centrifuger. Retirez tout le surnageant. Peser à nouveau le tube et déterminer le poids du culot bactérien. Reprendre le culot avec du tampon M9 (voir la recette dans le Tableau 1) pour une concentration finale de 4% ^(p / _v). Aliquote de 10 pl de la suspension bactérienne sur le centre de chaque plaque de phéromone ^4. plaques de magasin O / N à la température ambiante.
3. Choisissez 10-15 gravides N2 hermaphrodites de type sauvage un jour après la mue à l'âge adulte sur les plaques de phéromones ^4. Stocker les plaques à 25 ° C pour les 3 - 4 heures.
4. Ramassez tous les hermaphrodites adultes. Notez le nombre d'œufs pondus pour chaque plaque. Sceller les plaques avec du parafilm et retour à 25 ° C pendant 3 jours ^17.
5. Comptez le pourcentage de dauers (Figure 2). Remarque: Pour les deux méthodes, il est important de noter que dauers (et dans une moindre extente non-dauers) va grimper sur les murs et sur le couvercle de boîtes de Pétri. Il est donc important d'examiner toutes les surfaces de la vaisselle pour les nématodes.
6. Monter les données à une courbe dose-réponse et estimer la concentration de phéromone CE ₉₀ (phéromone suffisante pour induire 90% des animaux pour former dauers) comme le montre la figure 3. Remarque: On utilise typiquement un modèle de régression logistique pour évaluer la CE ₉₀ , mais différents logiciels statistiques peuvent avoir des méthodes alternatives qui produisent des estimations similaires.

3. imagerie en direct de Dauer IL2 neurones

1. Préparer les boîtes dauer de phéromones que dans le protocole 2 en utilisant la valeur CE ₉₀ déterminée dans l'étape 2.6.
2. Provoquer dauers en utilisant les méthodes dans le protocole 2 avec une souche portant une IL2 reporter transgène intégré (myIs13 [P _klp-6 :: gfp], myIs14 [P _klp-6 :: gfp], myIs16 [P _klp-6 :: tdTomato] ou qIs56 [P _retard-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} REMARQUE: Si q Is56 est utilisée, l'expression de la GFP ne sera pas visible dans les IL2Qs jusqu'à plusieurs heures dans la mue dauer et certains des événements de remodelage initiaux ne seront pas visibles. En outre, alors que le signal de fluorescence de la _{P-lag 2} :: gfp transgène est finalement plus lumineux dans les IL2s pendant dauer que les P _KLP-6 rapporteurs fluorescents, le _{P-lag 2} :: transgène GFP exprime aussi faiblement dans les muscles de la tête qui peut masquer les branches de fines IL2.
3. Après la ponte, retirer les hermaphrodites adultes, sceller les plaques avec du parafilm et incuber pendant 34 h à 25 ° C ^17. REMARQUE: La longueur du temps de la mue dauer varie légèrement entre les individus. La période la plus rapide des dendrites arborisation commence 4 - 5 heures après le début de la mue dauer (39-44heures après la ponte à 25 ° C) ^12.
4. Le jour avant l'imagerie, de préparer une solution de 10% ^(p / _v) d'agarose dans du tampon M9 avec dauer phéromones à la concentration _CE90. Aliquote d'environ 100 pi de agarose sur une lame de microscope et rapidement, mais doucement, placer une autre diapositive sur le dessus pour créer une surface de la gélose plat. Après l'agarose solidifié, envelopper les lames dans une pellicule transparente et stocker dans une chambre humide (boîte de pointe de la pipette avec des serviettes en papier humide).
5. Après la période d'incubation de 34 h, examiner plaques de phéromones contre les nématodes qui ont cessé pharyngée pompage. Séparer les diapositives de telle sorte que seulement une surface de glissement présente une agarose sur elle. Choisir un ou plusieurs nématodes sur un bloc d'agarose à 10% et 1 μ l de 0,1 micron ²² billes de polystyrène. NOTE: Avec une population bien synchronisé, la majorité des nématodes sur la plaque va entrer dans la mue de L2d à dauer. Cependant, il peut y avoir des différences entre ies personnes. Il est donc important de noter fonctionnalités supplémentaires (stomie occlusion, du pharynx remodelage) pour estimer la quantité de temps que les animaux ont été dans la mue dauer (voir résultats représentatifs par exemple).
6. Déterminer l'orientation (gauche / droite, dorsale / ventrale) du nématode. Capturez des images Z-stack d'une dendrite IL2Q à 100x de grossissement avec la plus faible intensité de fluorescence possible toutes les 15 minutes ou selon les besoins de l'expérience spécifique. Continuer la capture d'images jusqu'à ce que le nématode a séparé de la cuticule L2d et l'immobilisation est impossible ou si l'animal se remet de dauer (pharynx commence pompage). Quand il n'est pas d'imagerie active, placer la lame dans une chambre humide. NOTE: Nous utilisons un microscope à épifluorescence avec un motorisé interférences stade et différencié contraste (DIC) de l'optique.

Résultats

La production de brut résultats dauer de phéromones dans un liquide jaune (figure 1) qui est à la fois chaleur et froid stable. Des aliquotes de phéromone brut sont stockés à -20 ° C indéfiniment sans perte évidente de l'activité. Après la production de phéromone, une seule étude dose-réponse est suffisante pour une estimation approximative de la puissance. Cependant, pour la plupart des expériences, il est nécessaire de répéter l'essai biologique 2 - 3 fois et prendre une moyenne de chaque expérience. ...

Discussion

Un examen de la neuroplasticité spécifique dauer et d'autres changements morphologiques Dauer associée nécessite le contrôle et la formation fiable de dauers soit par mutation génétique (c.-à-mutants, daf-c) ou par l'exposition d'animaux de type sauvage à la phéromone. Bien que l'utilisation d'une mutation génétique pour induire dauers est commode, on peut confondre résultats. Par conséquent les données collectées à des mutations daf-c doit être confirmée par la suite avec des anima...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6 ::gfp] III	Sur demande du laboratoire
PT2762 myIs14[Pklp-6 ::gfp] V	Sur demande du laboratoire
JK2868 qIs56[Plag-2 :: gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center Boîtes
de Pétri	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Divers		3 g de NaCl, 17 g de gélose, 2,5 g de peptone dans 975 ml H2O autoclavé refroidi à 55° ; C suivi de 1 ml de cholestérol 5 mg/ml dans de l’éthanol, de 25 ml de tampon 1 M KPO4 (pH 6,0), de 1 ml de 1 M de CaCl2, de 1 ml de 1 M de milieu MgSO4
S	Divers		milieux S sont constitués d’une solution basale de S (1,46 g de NaCl, 0,25 g de K2HPO4, 1,5 g de KH2PO4, 0,25 ml de cholestérol 5 mg/ml dans de l’éthanol et du H2O à 250 ml. Ajouter à la solution basale S 2,5 ml de citrate de potassium pH 6,0 (2 g d’acide citrique monohydraté, 29,4 g de citrate tripotassique monohydraté, H2O à 100 ml, autoclave), 2,5 ml de solution d’oligo-métaux (1,86 g d’EDTA disodique, 0,69 g de FeSO4 ; et taureau ; 7 H2O, 0,2 g MnCl2&bull ; 4 H2O, 0,29 g de ZnSO4 et taureau ; 7 H2O, 0,025 g CuSO4 et taureau ; 5 H2O, H2O à 1 L. autoclavé et stocké à l’obscurité), 0,75 ml de 1 M de CaCl2 et 0,75 ml de 1 M de MgSO4.
Plaques de phéromones Dauer pour le dosage dose-réponse	Divers		Mix 0,085 g de gélose Noble, 0,5 ml de 0,513 M NaCl et 5 µ ; l de 5 mg/ml de cholestérol dissous dans de l’éthanol dans chacun des 6 tubes de culture de 15 ml. Ajoutez suffisamment de phéromones brutes dans chaque tube pour créer une gamme de concentrations. Ajouter H2O pour porter le volume à 4,725 ml. Faire bouillir sur un bec Bunsen jusqu’à ce que la gélose soit dissoute, puis refroidir à 55 ° ;C. Ajouter 125 µ ; l 1 M Tampon KPO4 (pH 6,0), 50 µ ; l 0,1 M CaCl2, 50 & micro ; l 0,1 M MgSO4 et 50 µ ; l de 5 mg/ml de sulfate de streptomycine dans chaque tube. Versez le contenu de chaque tube dans une boîte de Pétri de 35 mm de diamètre. Laissez la gélose se solidifier à température ambiante pendant la nuit (si elle est plus longue, conservez-la dans un récipient fermé pour éviter un dessèchement excessif).
Perles microsphères 0,1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 Tampon	Divers		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O à 1 litre. Stériliser par autoclave

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