Le faisceau cortico-spinal, l'un des principaux secteurs de sensori-motrices, peut être lésé unilatéralement dans le tronc cérébral des rongeurs afin de tester des thérapies de neuroplasticité induisant pour le système nerveux central. Cette intervention chirurgicale ("de pyramidotomy") et les évaluations post-opératoires sont décrits dans ce protocole.
Article de méthode
Pyramidotomy unilatérale de la cortico Tract chez le rat pour l'évaluation des thérapies de neuroplasticité induisant
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le faisceau cortico-spinal (CST) peut être complètement rompu unilatéralement dans les pyramides médullaires du tronc cérébral des rongeurs. Le CST est un appareil à moteur qui a une grande importance pour le contrôle musculaire distale chez l'homme et, dans une moindre mesure, chez les rongeurs. Une réduction unilatérale des résultats d'une pyramide en perte de CST innervation de la moelle épinière principalement sur le côté opposé de la moelle épinière entraînant transitoire handicap moteur dans les membres antérieurs et soutenue perte de dextérité. Projections ipsilatérales du faisceau cortico-spinal sont mineures. Nous avons affiné notre méthode chirurgicale pour augmenter les chances de lésion exhaustivité. Nous décrivons les soins post-opératoires. Déficits sur le test Montoya escalier culot atteindre et le test de l'échelle horizontale représentée ici sont détectés jusqu'à huit semaines postinjury. Déficits sur le test cylindre d'élevage ne sont détectés de manière transitoire. Par conséquent, le test du cylindre ne peut être adapté pour la détection de reprise à court terme. Nous montrons comment, électrophysiologiquementet anatomiquement, on peut évaluer les lésions et les changements de plastique. Nous décrivons également comment analyser les fibres du CST indemne germination travers la ligne médiane dans les zones défavorisées. Il est difficile d'obtenir> 90% des lésions complètes constamment en raison de la proximité de l'artère basilaire dans le bulbe rachidien et les taux de survie peuvent être faibles. Approches chirurgicales alternatifs et les tests de comportement sont décrites dans ce protocole. Le modèle de pyramidotomy est un bon outil pour évaluer les traitements de neuroplasticité induisant, qui augmentent la germination des fibres intactes après une blessure.
Introduction
Le faisceau cortico-spinal (CST) est une importante voie de moteur dans la moelle épinière humaine. Dommages à ce tube après les résultats de blessures de la moelle épinière à la perte considérable de la dextérité. Le CST est particulièrement important pour le mouvement de la motricité fine chez l'homme, comme le mouvement de chiffres et de contrôle musculaire distale. On le trouve aussi dans les rongeurs mais son emplacement anatomique à l'intérieur de la moelle épinière est différente de celle de l'homme et des dommages CST est inférieure désactivation 1-4.
Un modèle in vivo de lésion unilatérale CST comporte pyramidotomy, où une pyramide dans le tronc cérébral rostral ventral est coupé à la entrecroisement (figure 1). Les pyramides sont une caractéristique anatomique claire sur la face ventrale du bulbe rachidien à travers lequel le CST se exécute avant décussation. Chez le rat, la majorité des fibres (environ 95%) decussate à l'extrémité caudale du bulbe et se retrouvent par la suite dans la partie médiane dorsale de la moelle épinière. Cependant, approximatEly 10% des fibres decussated exécuté dans les colonnes dorsolatérales. Le solde de ~ 5% de fibres rester décroisé sur le côté ipsilatéral et Voyage dans la partie médiane ventrale 5,6. Après pyramidotomy la moelle épinière perd son entrée directe de la CST controlatéral (Figure 1).
Le modèle de pyramidotomy est particulièrement bonne pour tester les réponses des fibres intactes de la CST non lésé à un traitement. Il permet l'évaluation de la plasticité et de la germination des fibres intactes à travers la ligne médiane de la moelle épinière, qui innervent les zones dénervées. Le faisceau cortico-spinal a été observé à germer considérablement dans les modèles de lésions médullaires et sert de médiateur en particulier des membres antérieurs 7-10 de récupération. Un traitement pourrait viser à renforcer cette reprise des membres antérieurs. L'efficacité d'une thérapie peut être testé avec des évaluations comportementales, les techniques de traçage des voies anatomiques et non lésé expériences électrophysiologiques terminaux 3,11,12.
L'avantage par rapport à la plupart des autres modèles précliniques de blessures de la colonne vertébrale, ce est qu'il affecte spécifiquement une des voies par rapport à d'autres traumatismes médullaires touchent souvent de multiples voies. Un seul appareil dans un endroit anatomique claire, superficielle est lésé. Un autre avantage est que le pyramidotomy est un modèle de lésion reproductible. Ce est une ressource appropriée dans vivo pour les chercheurs de tester l'effet des thérapies de neuroplasticité induisant potentiels, qui visent à la récupération de la fonction motrice après des blessures ou troubles affectant le système moteur 13,14.
Protocole
Déclaration éthique: Toutes les procédures étaient conformes aux lignes directrices de l'Home Office britannique et Animaux (Scientific Procedures) Act de 1986.
1. Chirurgie et blessures
Remarque: L'utilisation rats plus lourds que 220 g peuvent aider à la récupération post-opératoire si le chirurgien trouve animaux perdent souvent plus de 10% de leur poids corporel préopératoire.
- Avant la chirurgie, tester les animaux pour leur préférence de patte avec le test cylindre d'élevage 15 ou le test de Montoya 24. De préférence, coupé la pyramide / CST correspondant à la patte dominante.
REMARQUE: Pendant deux jours avant la chirurgie, placer les éléments suivants dans les cages, de sorte que les rats se familiariser avec les produits alimentaires qui seront bénéfiques lors de la récupération de la chirurgie: les packs hydrogel, purée humide et compléments alimentaires caloriques élevés. Versions stériles de ces compléments alimentaires sont disponibles auprès de divers fournisseurs. - Anesthésier femme LIster rats à capuchon (pesant entre 200 et 250 g) avec de l'isoflurane (5% pour l'induction et 1 à 2% pour la maintenance) dans de l'oxygène (débit: 1,5 L / min). NOTE: Le choix de l'anesthésique est important. Anesthésique par inhalation permet pour la régulation rapide de la profondeur de l'anesthésie à la kétamine, qui est également couramment utilisée. Isoflurane permet un meilleur contrôle de la fréquence de la respiration et de la profondeur. Le choix de l'anesthésique est isoflurane. Remarque: L'utilisation rats plus lourds que 220 g peuvent aider à la récupération post-opératoire si le chirurgien trouve animaux perdent souvent plus de 10% de leur poids corporel préopératoire.
- Administrer Carprofen voie sous-cutanée comme analgésique lorsque les animaux sont anesthésiés à réduire l'inflammation et de fournir une analgésie. Note: Le carprofène est donnée lors de la chirurgie de pyramidotomy dans notre laboratoire selon les conseils de notre vétérinaire. Les opioïdes peuvent causer davantage de dépression respiratoire pendant la chirurgie.
- Maintenir les animaux à 37 ° C pendant la chirurgie en utilisant une maisonSystème de couverture othermic et une sonde de température rectale.
- Confirmez anesthésie générale en vérifiant la patte pincée réflexe de retrait et de réflexe de clignement.
Remarque: Facultatif: Pour lutter contre les problèmes respiratoires pendant la chirurgie, intubation et la ventilation pourrait être réalisable. Cependant, gardez à l'esprit que la trachée doit être déplacé pendant la chirurgie. - Une fois anesthésié, placez le rat en décubitus dorsal, raser le cou ventral et stériliser avec une lingettes% de chlorhexidine et / ou des lingettes alcoolisées. Appliquer une couverture chirurgicale stérile sur l'animal et de garder la zone stérile à tout moment.
- Une fois anesthésié, placez le rat en décubitus dorsal, de se raser le cou ventral et stériliser avec 1% de chlorhexidine et d'alcool lingettes. Appliquer une couverture chirurgicale stérile sur l'animal et de garder la zone stérile à tout moment.
NOTE: En option, la tête du rat peut être fixé dans un cadre stéréotaxique en décubitus dorsal pendant la chirurgie pour désactiver la mobilité de la tête, ce est-l'os occipital. - Ajouter un 2 à 3 cm de long incision médiane de la mentonnière presque à l'extrémité rostrale du sternum au moyen d'un scalpel stérile (# 10). Eventuellement, appliquer de petites pinces bulldog pour rétracter la peau.
- Blunt disséquer les couches supérieures de tissus tels que les glandes (par exemple glande sous-maxillaire et parotide) et les muscles couvrant la trachée en utilisant action inverse avec des ciseaux émoussés et pince à griffes. Toujours rester sur la ligne médiane. Les tissus doivent se séparer facilement.
- Une fois que la trachée est exposée, le déplacer d'un côté. La ligne médiane est visible en dessous avec deux coussinets adipeux blancs, marquant la ligne médiane à la fin rostrale.
- Rostral aux coussinets adipeux blanc, tissu disséquer émoussée jusqu'à la surface ventrale du crâne (l'os basioccipital) est atteint.
- Insérez rétracteurs long dentées (longueur de dent de 5,5 mm ou 16 mm) afin de maintenir la trachée déplacé d'un côté (maximum 1 cm) et à exposer la base du crâne. Déplacement de la trachée peut obstruct respiration.
NOTE: Pour certains animaux, desserrer les rétracteurs à plusieurs reprises au cours de la chirurgie pour enlever la pression sur la trachée, par exemple toutes les 10 min pendant 2 min. rétracteurs de crochet peuvent être utilisés à la place des rétracteurs de longues dents pour réduire la tension de déplacement. - Cautériser attentivement les petits vaisseaux sanguins visibles à la fin rostrale allant vers le larynx afin d'éviter les saignements.
REMARQUE: Afin d'éviter cautériser les vaisseaux sanguins de nerf laryngé récurrent sont soigneusement tiré loin de la paroi tissulaire avant d'être cautérisées. - Ajuster le microscope pour le reste de l'opération.
- Retirer le périoste recouvrant la base du crâne avec des pinces fines. Ajustez les écarteurs pour atteindre la meilleure vue possible pour le forage.
- Sentez-vous la surface inégale de l'os basioccipital avec une pince fine, notant une élévation sur la ligne médiane, qui couvre l'artère basilaire. Rostralement, le crâne devient soulevée comme une légère convexité.
- Selon le côté de la lésion est souhaitée, percer un trou d'environ 1 mm latéralement de la ligne médiane dans les mouvements médio-latérale.
NOTE: Ne oubliez pas que le rat est en position couchée, et son côté gauche peut être du côté des enquêteurs de la main droite! - Une fois qu'un trou est fait, agrandir vers la ligne médiane avec de petits va-et-vers le bas-mouvements verticaux avec la perceuse jusqu'à l'artère basilaire est clairement visible et agrandir latéralement pendant au moins 2 mm.
- Assurez-vous que l'artère basilaire est clairement visible. La pyramide peut être identifié par sa forme légèrement bombée (Figure 2) et en bordure de vaisseaux sanguins.
- Retirez tous les fragments d'os restants avec des pinces fines.
- Appliquer une goutte de Doxapram chlorhydrate, un stimulant respiratoire, sur la langue.
- Ouvrez la dure longitudinalement avec une aiguille de calibre 26 et une pince fine dehors de l'artère basilaire. Profitez du liquide céphalo-rachidien (LCR) et des saignements avec des cotons-tiges.
- Éviter Injury de l'artère basilaire, faire une coupe couvrant environ 1,5 mm de large la largeur de la pyramide et 0,5 mm de profondeur avec Vannas Printemps Ciseaux perpendiculaire à l'artère basilaire (figure 2) d'interrompre les fibres du CST.
REMARQUE: Marquez les microciseaux avance à 0,5 mm de la pointe. Une fois que la dure-mère est ouverte l'artère basilaire peut être déplacé légèrement à permettre un meilleur accès à la pyramide d'un côté. - Répétez la coupe en utilisant la pointe d'une aiguille de calibre 26 pour assurer la lésion comprend des fibres à proximité de l'artère basilaire.
- Arrêter le saignement avec une légère pression appliquée par des cotons-tiges. Facultativement, la coupe peut être recouverte d'éponge de gélatine.
- Retirez les rétracteurs, remplacer les tissus et suture seulement la peau avec des sutures Vicryl 3-0.
- Après la chirurgie, garder l'animal dans un incubateur à 32 ° C jusqu'à ce que tout à fait réveillé et administrer 5 ml de solution saline sous-cutanée, si nécessaire. Ne pas laisser l'animal sans surveillance.
- Donnez Carporfen voie sous-cutanéecomme un anti-inflammatoire et comme analgésique pour la douleur post-chirurgicale postopératoire une journée.
- De surveiller les animaux de près pendant une semaine après la chirurgie et au moins une fois par semaine par la suite.
- Si nécessaire, après la chirurgie, des packs de gel lieu d'hydratation, de la nourriture en purée pour bébé, purée humide et chow sec sur sol de la cage. Fournir des bouteilles d'eau avec de longs becs (manquant vannes roulement à billes).
Résultats
Les taux de survie.
Dans une étude représentative menée par nous, nous avions un taux de 16 sur 20 rats femelles à capuchon Lister (200 à 250 g) de survie. La complication la plus fréquente est la respiration des difficultés en raison du déplacement de la trachée ou des dommages aux centres respiratoires du tronc cérébral juste dorsale aux pyramides (solitarii noyau, ambigus et parabrachilis). Des résultats similaires ont été rapportés dans la littérature 16.
Résultats comportementaux.
Une gamme de tests comportementaux ont été utilisés pour évaluer les résultats après sensori pyramidotomy chez les rongeurs: le test de l'échelle horizontale, le culot unique atteignant test, le test cylindre de l'élevage et de test de l'escalier sont Montoya évaluations comportementales les plus couramment utilisés. Autres essais décrits dans la littérature sont le culot atteindre test, test corde d'escalade, analyse de la marche et le test de ruban adhésif3,17-19. La plupart de ces montrent une fonctionnelle déficit moteur 1 semaine après une blessure. Actuellement, la plupart des études décrites dans la littérature ne effectuer des tests de comportement jusqu'à 42 jours 4,11,13,20,21, ou pour un temps plus court 3,18,22. Nous avons effectué les tests de comportement pour une période de temps prolongée et nous avons vu essentiellement le rétablissement complet de la fonction motrice 8 semaines après pyramidotomy pour certains des tests de comportement, à l'exception du test de l'escalier Montoya et le test de l'échelle horizontale. Ce est probablement pour plusieurs raisons. Tout d'abord, le CST rostrale blessés à la lésion peut former des synapses sur les neurones dans le tronc cérébral qui agissent comme des relais indirects aux neurones moteurs de la moelle épinière. D'autre part, la non blessé (controlatéral) CST peut germer et formes synapses sur les neurones dans le tronc cérébral ou la moelle épinière qui agissent comme des relais aux neurones moteurs. Troisièmement, d'autres voies motrices épargné tels que les voies réticulospinales, vestibulo ou rubrospinal peuvent prendre en charge certaines fonctions. Ainsi, un t durableraitement effet est difficile à détecter avec de nombreux tests de comportement dans le modèle de pyramidotomy. Certains tests de comportement dans ce modèle pourrait toutefois refléter un rétablissement accéléré début après la blessure, qui est liée à un traitement.
Cylindre Elevage essai 3,4,23
Basé sur le test cylindre de l'élevage à l'OSC correspondant à la patte dominante a été blessé. Les rats sont placés dans un cylindre en plexiglas et on observe le comportement d'élevage pendant une période de 3 min. Preinjury il y avait une légère préférence pour l'utilisation d'une patte, la patte dominante, lors de l'exploration verticale (figure 3A). La blessure affecte le côté dominant et l'utilisation de la patte contralésionnel a diminué à 28% au 1 Mesures semaine postinjury (répétées ANOVA p <0,05; analyse post-hoc a révélé les animaux ont des déficits importants à la semaine 1, 2 et 3, p <0,05, Fisher LSD). 4 semaines postinjury les animaux récupérés uned utilisé la patte antérieure affecté pour 45% des arrières, et après six semaines ce était de 57% (n = 16, moyenne ± écart-type est représenté). Souris même, Starkey et al. (4) ont évaluée en utilisant le test du cylindre pour un maximum de 42 jours après pyramidotomy et ont signalé une diminution significative de l'utilisation de la patte affectée pendant toute la période d'essai.
Montoya Escalier essai de 24
Rats exigent préformation pour ce test pour se acclimater avant l'accident. Pour augmenter la motivation pendant les animaux de la session de test sont la nourriture limitée à 15 g d'aliment par rat la veille. Les rats privés de nourriture sont placés dans la cage d'escalier Montoya pendant 15 min. De chaque côté, il ya un escalier de sept marches avec des puits, contenant chacune trois pastilles. Le nombre total de boulettes récupérées sur chaque côté sont enregistrées. Le nombre de boulettes récupérées à la patte contralésionnel / touchés a diminué significativement de 61% à preinjury3% 3 jours postinjury (figure 3B). La possibilité de récupérer des granulés était encore affaiblie de manière significative à 4 semaines postinjury avec 20% de boulettes récupérées. Les rats montrent un déficit important jusqu'à la semaine 8 avec seulement 29% des pastilles mangé à ce point dans le temps (mesures répétées ANOVA p <0,05, analyse post hoc a révélé les animaux ont des déficits importants sur le côté contralésionnel à tous les semaines, p <0,05, Fisher LSD). La patte ipsilésionnelle est affectée jusqu'à 1 semaine postinjury; mais cela récupère par les deuxième semaine (mesures répétées ANOVA p <0,05, analyse post hoc a révélé les animaux ont des déficits importants au Jour 3 et une Semaine sur la patte ipsilésionnelle, p <0,05, de Fisher LSD). Les déficits initiaux de la patte ipsilésionnelle pourraient se expliquer par le lesioning de la partie ipsilatéral des voies cortico passant par la pyramide de coupe, avec la germination et la récupération ultérieure.
Horizontaltest de Ladder 25
Rats exigent préformation pour ce test. Rats à pied trois fois sur une longue échelle de 1 m avec un espacement échelon irrégulière. Les vidéos sont ensuite analysés au ralenti et le nombre total de pied glisse et manque pour chaque patte est quantifié. Le graphique de la figure 3C représente le nombre total des accidents et des bouts de côté affecté et moins touchée (+ patte patte arrière) en pourcentage du nombre total de mesures prises. Les rats ont un nombre significativement élevé d'erreurs 1 semaine postinjury avec 10% ou 11% du côté affecté et le côté moins touché respectivement. Ce déficit est persistant sur le côté contralésionnel / touchées jusqu'à huit semaines avec 10% d'erreurs fait, cependant, décide sur le côté ipsilésionnelle / moins touché par deux semaines (mesures répétées ANOVA, analyse post hoc a révélé les animaux ont des déficits importants à tous les semaines le côté contralésionnel et des déficits importants à la semaine 1 et 3 sur le ipsilésionnellecôté, p <0,05, LSD de Fisher).
Tests électrophysiologiques
Dans un terminal électrophysiologique set-up l'animal a été anesthésié par voie intrapéritonéale avec de l'uréthane. Tout au long de la procédure, il a été maintenu à 37 ° C ± 1 ° C. Sa région ventrale du cou, ses membres antérieurs et la région de la poitrine ont été rasés et désinfectés avec de l'iode gommage. Les pyramides ont été exposés comme décrit précédemment et le nerf radial a été exposé dans la partie supérieure du bras par une approche ventrale inciser la peau et le muscle grand pectoral. L'extrémité distale du nerf radial a été coupé et le nerf a été mis sur deux fils d'argent branchements électrodes dans un bain d'huile minérale. Soit pyramide a été stimulé avec des électrodes bipolaires concentriques à différentes profondeurs avec 5 impulsions à 300 Hz et une amplitude croissante de stimulation. Les enregistrements ont été toujours faits à partir du nerf radial du bras handicapés (figure 4).
Anim indemneals eu une réponse forte à latences entre 12 à 20 ms dans le nerf radial lorsque la pyramide controlatéral a été stimulée (figure 4B). Stimulation ipsilatérale ne aboutit qu'à activation occasionnelle (figure 4C). Les animaux qui ont reçu préalablement pyramidotomies, sur le côté opposé au bras d'enregistrement ne présentent pas de réponse dans le nerf radial lorsque l'appareil lésé est stimulée au-dessus de la lésion (figure 4B). Toutefois, la stimulation des fibres du CST dans les pyramides ipsilatéral à l'enregistrement électrodes ont donné lieu à une plus forte activation dans le nerf radial par rapport aux animaux non blessés à 12 semaines postinjury (figure 4C).
Résultats anatomiques.
Les animaux ont été euthanasiés 10 semaines après la chirurgie selon l'annexe 1 des animaux (des procédures scientifiques) Loi 1986. Deux semaines auparavant, le CST indemne a été tracée avec biotinyléamine dextran (BDA) injections dans le cortex moteur 26 ipsilatérale au bras handicapés (Figure 1). Ceci permet la quantification des fibres non blessés, qui traversent la ligne médiane et fournissent la moelle épinière contralésionnel (Figure 5C, D). Animaux non lésés ne ont que quelques fibres traversant la ligne médiane, alors que cela augmente en réponse à une blessure. Des coupes transversales de la moelle épinière cervicale ont été colorées avec la protéine kinase C (PKC) gamma afin d'évaluer la proportion de dénervation dans la CST lésion (figure 5E) 16. En variante, l'intégralité de la lésion peut être évaluée en injectant BDA traceur dans le cortex moteur sur le côté de la lésion ipsilésionnelle de pyramidotomy. L'absence de marquage dans la controlatéral dorsomédial CST et le ipsilatéral ventromédian CST fournit la preuve du transection unilatérale complète.
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Figure 1: Schéma montrant les voies cortico chez le rat et axotomie unilatérale de la CST dans les pyramides Image du haut:. Neurones cortico origine dans les cellules pyramidales couche 5 corticales. Dextran amine biotinylée (représentée en vert) est injecté dans le cortex contralésionnel deux semaines avant la fin de l'expérience. Image du milieu: Les étendues forment des pyramides sur la surface ventrale de la moelle et à la jonction spinomedullary la majorité des axones decussate. Pyramidotomy unilatérale est effectuée dans la moelle caudale (en rouge). Basse photo: La majorité des voies cortico délabré dans les parties dorsomédian et dorso-latéraux de la moelle épinière. Une minorité reste ipsilatéralement et fonctionne ventromedially.
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Figure 2: Vue ventrale du cerveau de rat. Les pyramides se distinguent parce qu'ils sont élevés, convexités parallèles (boîte jaune). Les frontières des pyramides sont définis en dedans par le tronc basilaire (en bas) sur la ligne médiane et latéralement à la base de la convexité à mi-chemin entre l'artère basilaire et l'artère paraolivary (POL) comme on le voit en (c). Craniotomie est effectuée sur l'artère basilaire et latérale se étendant à l'artère paraolivary (encadré rouge, C). Une pyramide est coupée perpendiculairement à l'artère basilaire (ligne rouge en C, coupe est indiqué sur échantillon dans A et B). Lésions placés trop près des caudale artères vertébrales (de vert) seront incomplets parce que le CST commence à déçusse et parce que l'artère vertébrale est réglée de la ligne médiane. (C) image adapté de «Le système nerveux de Rat" par George Paxinos 27. NOTE: Cette figure montre une lésion sur le côté gauche des images: ce est la plate-forme de l'animalht faisceau pyramidal, car il est couché sur le dos. Se il vous plaît noter toutefois que la vidéo montre une lésion à gauche faisceau pyramidal de l'animal.
Figure 3:. Les résultats représentatifs pour l'essai d'élevage de cylindre, Montoya escalier culot atteindre tester et tester à échelle horizontale Il ya un déficit moteur détecté par tous les tests après l'accident. Cependant, pas de déficit peut être détecté par le test cylindre d'élevage à 4 semaines postinjury, alors que les déficits soutenus peuvent être détectés avec le test de l'escalier Montoya et le test de l'échelle horizontale jusqu'à huit semaines postinjury (n = 16 par groupe, des moyens et l'erreur standard sont représenté). Asterisk indique p <0,05 par rapport à preinjury référence (test LSD de Fisher). Se il vous plaît cliquer surici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Électrophysiologie évaluer le faisceau cortico-spinal avant et après pyramidotomy (A) montre le set-up pour l'expérience terminal. Nous stimulons les pyramides avec un train de cinq impulsions à différentes profondeurs rostrales sur le site de lesioning et entrecroisement. Le tube rouge est le tractus lésé. Nous enregistrons de nerf radial sur le côté contralésionnel. (B) et (C) montrent par exemple des enregistrements avec la stimulation ou la stimulation ipsilésionnelle contralésionnel avant ou 12 semaines après pyramidotomy. Stimulations ipsilésionnelle évoquent plusieurs potentiels d'action composé (pics à la trace) dans le nerf radial avant qu'une blessure (B). Ceux-ci sont abolies par la blessure et l'activité ne RETUR pasn dans les 12 semaines (B '). Stimulation contralésionnelle évoque rares potentiels d'action composé unique preinjury (C). 12 semaines après l'activité de blessures considérablement est augmenté (C '), probablement en raison d'axones intacts germination travers la ligne médiane et en plastique changements au sein de la moelle épinière. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Évaluation anatomique après pyramidotomy (A, B, C, D) biotinylé amine dextran a été utilisé pour tracer le faisceau cortico-spinal en l'injectant dans le cortex moteur correspondant à la CST non lésé (voir vert dans la Figure 1). La médiane dorsale, les composants médiales ventrales de la CST sont clairement visibles (A, partie dorsale médiane agrandie en B). (C) et (D) sont des grossissements de (A) de fibres de germination à travers la ligne médiane dans la substance grise du côté dénervé en réponse à un traitement. Pour évaluer l'exhaustivité de la lésion sections transversales de niveau cervical 4 (12 semaines de tissu postinjury) ont été coupées et colorées avec des anticorps contre PKC gamma (E). Le CST sur le côté gauche de l'image est intact et peut être vu à travers la ligne médiane bombée sur le côté dénervé, probablement en raison de la désintégration de la structure dorsale blessé CST.
Discussion
Nous avons décrit le modèle de lésion de pyramidotomy. Le tractus cortico-spinal est coupé au niveau du tronc cérébral. D'un point de vue technique cette chirurgie nécessite beaucoup de prudence et de précision. Le tronc cérébral accueille les centres respiratoires et les centres cardiovasculaires dans plusieurs noyaux tels que le noyau ambigu et solitarii intégré dans la formation réticulaire sous les pyramides. Si la coupe est faite trop profond cela peut conduire à des difficultés respiratoires soudains, qui peuvent être fatales. Nous donnons Dopram juste avant la coupe d'augmenter l'activité de respiration pour éviter un arrêt brutal respiration. Si la respiration se arrête, il vaut la peine de ventilation de l'animal pour les cinq minutes suivantes avec l'oxygène comme il peut récupérer. En outre, les dommages à l'artère basilaire doit absolument être évitée. Les complications pendant la première quelques jours postinjury sont: une autre hémorragie dans le tronc cérébral qui affecte les fonctions vitales, la perte de poids considérable, la respiration graves difficulties dues au déplacement de la trachée et de l'orientation et de l'équilibre de graves problèmes de l'animal en raison d'une blessure vaste y compris les olives juste latérales des pyramides. Ces complications peuvent être traités comme des points d'extrémité et les animaux peuvent être euthanasiés. Une surveillance étroite au cours de la première semaine après la chirurgie est essentielle. La nourriture supplémentaire peut être donnée afin de contrebalancer la perte de poids. l'inflammation des voies respiratoires (respiration rauque) résout normalement dans un à deux jours. Généralement, les jeunes animaux sont plus faciles à opérer sur leur cou est moins profonde. En outre, ils sont plus résistants et ont moins de complications respiratoires.
Il nécessite un peu de pratique pour parvenir à une lésion complète du CST avec un pyramidotomy. De même, dans deux études de Steward et al. 16, qui visait à répliquer un ancien expérience en Benowitz et al. 28, fait état de taux de mortalité initialement élevés et que certains de leurs lésions étaient incomplètes. Comportementaledéficits seront également variable. Nous recommandons qu'une nouvelle chirurgien effectue de nombreuses chirurgies pratique de pyramidotomy avant toute expérience complète pour tester un médicament candidat est effectuée. Des moyens de prévenir les lésions incomplètes sont retraçant la coupe avec une aiguille hypodermique se assurer que les fibres cortico à proximité de l'artère basilaire sont coupés comme décrit dans ce protocole. D'autres options sont à aspirer le site de la lésion avec une pipette à pointe verre aspiration comme décrit dans Zhou et al., 2003 29. Un fil de tungstène amende peut également être utilisé pour couper le tube 22. Une alternative à pyramidotomy est à couper le C3 dorsale cervicale CST unilatéralement et puis de couper avec une approche ventrale la partie ventrale C2 ipsilésionnelle de la CST 18. Cependant sans doute, une lésion complète ne est pas nécessaire si l'objectif est d'étudier la germination de la CST contralésionnel; si la majorité de la pyramide est lésé et une réponse de germination à partir du côté non lésé se produit, cela peut être suffisant.
Un but du modèle de lésion de pyramidotomy est pour l'ablation d'un côté du faisceau cortico-spinal et en utilisant des thérapies de neuroplasticité inducteur pour stimuler la plasticité et la germination des fibres intactes non blessés. Pour tester les thérapies de neuro-protecteurs ce modèle ne convient pas et d'autres modèles de préjudice tels que les blessures de contusion doit être utilisé. Résultats de pyramidotomies sont évalués le plus souvent avec les tests de comportement et l'anatomie. Le test de l'échelle horizontale, le test cylindre de l'élevage et de test de l'escalier sont Montoya évaluations comportementales les plus couramment utilisés. Autres essais décrits dans la littérature sont le culot atteindre test, test d'escalade de corde, analyse de la marche et de la bande collante de test 3,17-19. Cependant, les résultats de la plupart test de comportement sont souvent surveillés jusqu'à un maximum de 42 jours postlesion 3,4,11,17,18,20-22. Des expériences passées, les rongeurs récupérer plus fonction à des moments plus tard sans aucune intervention de traitement. Nous avons montré that le test de l'échelle horizontale et le test atteindre Montoya escalier en granulés à détecter les handicaps jusqu'à un moment ultérieur. Ils peuvent être utilisés pour mesurer la récupération fonctionnelle en raison d'un traitement. L'exhaustivité de la lésion est jugée par la PKC gamma coloration (qui marque fibres CST dans les colonnes dorsales) de la moelle épinière au niveau cervical ou rostrale ériochrome cyanine coloration des sections transversales du site de la lésion. Dextrane aminé biotinylé peut être injecté dans le cortex contralésionnel pour évaluer la germination des fibres intactes à travers la ligne médiane dans la région de la moelle épinière dénervé.
En conclusion, le modèle de pyramidotomy est bon pour l'évaluation des capacités de neuroplasticité induisant d'un médicament de traitement de lésions du système nerveux central si la chirurgie est maîtrisée avec succès. Il évalue la plasticité des fibres intactes. La prochaine étape serait d'utiliser un modèle plus cliniquement pertinente comme les blessures de contusion pour évaluer la capacité de la drogue pour surmonter les grandes BLESSURESes affectant plusieurs tracts.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Trust International Spinal Research et rosiers Trust.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Carprofène | Norbrook | Vm No ; 02000/4229 | donner 5 mg/kg deux fois par jour |
| Système de couverture homéothermique | Harvard Instruments | 507222F | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Ciseaux fins - Coupe dure | Outils scientifiques fins | 14058-09 | |
| Pinces | Outils scientifiques fins | 11019-12 | |
| Écarteurs Alm à dents longues | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| kit de système de cautérisation | Harvard Instruments | 726067 | |
| pince Dumont fine | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Meules en acier au carbone | Fine Science Tools | 19007-07 | |
| Dopram V-drops | Pfizer | appliquer 1 goutte sur la langue | |
| Vannas Spring Ciseaux | Outils scientifiques fins | 15000-03 | |
| gelfoam | Equimedical | EQU705001 | |
| 3-0 Sutures en vicryl | Microscope opératoire Ethicon | ||
| Système d’anesthésie compact | |||
| Balances | Ohaus | NVT3201 | |
| Lames de scalpel en acier au carbone n° 10 | Swann-Morton | 201 | |
| Aiguilles 25g Seringues | Terumo | NN-2525R | |
| (1 ml et 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Chlorure de Sodium 0,9 %) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotons-tiges | Johnson and Johnson 5000207582502 | stériliser avant utilisation |
Références
- Lemon, R. N. Descending pathways in motor control. Annual review of neuroscience. 31, 195-218 (2008).
- Lemon, R. N., Griffiths, J. Comparing the function of the corticospinal system in different species: organizational differences for motor specialization. Muscle & nerve. 32, 261-279 (2005).
- Starkey, M. L., et al. Assessing behavioural function following a pyramidotomy lesion of the corticospinal tract in adult mice. Experimental neurology. 195, 524-539 (2005).
- Starkey, M. L., Bartus, K., Barritt, A. W., Bradbury, E. J. Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice. Eur J Neurosci. 36, 3665-3678 (2012).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Cells of origin, course, and termination patterns of the ventral, uncrossed component of the mature rat corticospinal tract. The Journal of comparative neurology. 386, 293-303 (1997).
- Brosamle, C., Schwab, M. E. Ipsilateral, ventral corticospinal tract of the adult rat: ultrastructure, myelination and synaptic connections. Journal of neuroctology. 29, 499-507 (2000).
- Bareyre, F. M., et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats. Nat Neurosci. 7, 269-277 (2004).
- Chen, Q., Smith, G. M., Shine, H. D. Immune activation is required for NT-3-induced axonal plasticity in chronic spinal cord injury. Exp Neurol. 209, 497-509 (2008).
- Z'Graggen, W. J., et al. Compensatory sprouting and impulse rerouting after unilateral pyramidal tract lesion in neonatal rats. J Neurosci. 20, 6561-6569 (2000).
- Rosenzweig, E. S., et al. Extensive spontaneous plasticity of corticospinal projections after primate spinal cord injury. Nat Neurosci. 13, 1505-1510 (2010).
- Z'Graggen, W. J., Metz, G. A., Kartje, G. L., Thallmair, M., Schwab, M. E. Functional recovery and enhanced corticofugal plasticity after unilateral pyramidal tract lesion and blockade of myelin-associated neurite growth inhibitors in adult rats. J Neurosci. 18, 4744-4757 (1998).
- Kartje-Tillotson, G., O'Donoghue, D. L., Dauzvardis, M. F., Castro, A. J. Pyramidotomy abolishes the abnormal movements evoked by intracortical microstimulation in adult rats that sustained neonatal cortical lesions. Brain Res. 415, 172-177 (1987).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature Neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Akbik, F. V., Bhagat, S. M., Patel, P. R., Cafferty, W. B., Strittmatter, S. M. Anatomical plasticity of adult brain is titrated by Nogo Receptor 1. Neuron. 77, 859-866 (2013).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacol. 39, 777-787 (2000).
- Steward, O., Sharp, K., Yee, K. M. A re-assessment of the effects of intracortical delivery of inosine on transmidline growth of corticospinal tract axons after unilateral lesions of the medullary pyramid. Experimental neurology. 233, 662-673 (2012).
- Thallmair, M., et al. Neurite growth inhibitors restrict plasticity and functional recovery following corticospinal tract lesions. Nature neuroscience. 1, 124-131 (1998).
- Weidner, N., Ner, A., Salimi, N., Tuszynski, M. H. Spontaneous corticospinal axonal plasticity and functional recovery after adult central nervous system injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3513-3518 (2001).
- Schnell, L., Schneider, R., Kolbeck, R., Barde, Y. A., Schwab, M. E. Neurotrophin-3 enhances sprouting of corticospinal tract during development and after adult spinal cord lesion. Nature. 367, 170-173 (1994).
- Starkey, M. L., Bleul, C., Maier, I. C., Schwab, M. E. Rehabilitative training following unilateral pyramidotomy in adult rats improves forelimb function in a non-task-specific way. Experimental neurology. 232, 81-89 (2011).
- Ueno, M., Hayano, Y., Nakagawa, H., Yamashita, T. Intraspinal rewiring of the corticospinal tract requires target-derived brain-derived neurotrophic factor and compensates lost function after brain injury. Brain : a journal of neurology. 135, 1253-1267 (2012).
- Maier, I. C., et al. Constraint-induced movement therapy in the adult rat after unilateral corticospinal tract injury. J Neurosci. 28, 9386-9403 (2008).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The "staircase test": a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of neuroscience methods. 36, 219-228 (1991).
- Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behavioural brain research. 119, 1-13 (2001).
- Soleman, S., Yip, P., Leasure, J. L., Moon, L. Sustained sensorimotor impairments after endothelin-1 induced focal cerebral ischemia (stroke) in aged rats. Experimental neurology. 222, 13-24 (2010).
- Paxinos, G. The Rat Nervous System. , Academic Press, Inc. (1995).
- Benowitz, L. I., Goldberg, D. E., Madsen, J. R., Soni, D., Irwin, N. Inosine stimulates extensive axon collateral growth in the rat corticospinal tract after injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 13486-13490 (1999).
- Zhou, L., Baumgartner, B. J., Hill-Felberg, S. J., McGowen, L. R., Shine, H. D. Neurotrophin-3 expressed in situ induces axonal plasticity in the adult injured spinal cord. J Neurosci. 23, 1424-1431 (2003).
Réimpressions et autorisations
