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Article de méthode

Tandem de congélation à haute pression et rapide Gel Remplacement de tissus végétaux pour microscopie électronique à transmission

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DOI :

10.3791/51844

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13 octobre 2014

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1Department of Biochemical, Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, Knoxville, 2Advanced Microscopy and Imaging Facility, University of Tennessee, Knoxville

Dans cet article

Résumé

L’obtention d’images de microscopie électronique à transmission de haute qualité est un défi, en particulier dans le cas des cellules végétales, qui ont de grandes vacuoles remplies d’eau en abondance et des espaces aérés. La congélation à haute pression en tandem et la substitution de congélation rapide réduisent considérablement le temps de préparation des échantillons de plantes pour la MET tout en produisant des échantillons avec une excellente conservation ultrastructurale.

Résumé

Depuis la microscopie électronique à transmission de 1940 (TEM) a fourni des biologistes avec des images ultra-haute résolution de matériaux biologiques. Pourtant, en raison de protocoles laborieux et de longue haleine qui exigent également de l'expérience dans la préparation des échantillons sans artefact, TEM n'est pas considérée comme une technique facile à utiliser. Préparation de l'échantillon traditionnel pour la TEM fixateurs chimiques pour préserver les structures cellulaires. Congélation à haute pression est la cryofixation d'échantillons biologiques sous des pressions élevées pour produire des taux de refroidissement très rapide, limitant ainsi la formation de glace, ce qui est préjudiciable à l'intégrité de l'ultrastructure cellulaire. Congélation à haute pression et la substitution de gel sont actuellement les méthodes de choix pour la production de la morphologie de la plus haute qualité dans les sections de résine pour TEM. Ces méthodes de minimiser les artefacts normalement associés à un traitement classique pour la MET de coupes fines. Après cryofixation l'eau gelée dans l'échantillon liquide est remplacée parsolvant organique à basse température, un procédé appelé substitution de gel. Substitution gel est généralement effectuée sur plusieurs jours dans dédiée, des équipements coûteux. Une innovation récente permet que le processus soit terminé en trois heures, au lieu des deux habituelles jours. Ceci est généralement suivi par plusieurs jours de préparation de l'échantillon qui comprend l'infiltration et l'intégration dans les résines époxy avant la coupe. Nous présentons ici un protocole combinant congélation à haute pression et la substitution de congélation rapide qui permet usine échantillon fixation à accomplir en quelques heures. Le protocole peut être facilement adapté pour travailler avec d'autres tissus ou des organismes. Les tissus végétaux sont particulièrement préoccupantes en raison de la présence d'espaces aérés et vacuoles remplies d'eau qui empêchent la congélation libre de glace d'eau. En outre, le procédé de fixation chimique est d'autant plus longtemps dans les plantes en raison de parois cellulaires qui empêchent la pénétration des produits chimiques à l'intérieur des tissus profonds. Les tissus végétaux sont donc particrement difficile, mais ce protocole est fiable et fournit des échantillons de la plus haute qualité.

Introduction

Notre connaissance de l'ultrastructure cellulaire provient principalement de la microscopie électronique, qui peut résoudre les détails de l'ordre de quelques nanomètres 1. En dépit d'être si puissant dans la résolution TEM n'est pas considéré comme convivial, comme la préparation de l'échantillon nécessite beaucoup de temps et protocoles laborieux et exige une certaine expertise du praticien. Fixation traditionnelle des échantillons a combiné l'utilisation d'aldéhydes et de tétroxyde d'osmium avant tout autre traitement qui comprend la déshydratation, l'intégration dans de la résine, puis la coupe à réaliser des coupes ultra-minces qui sont ensuite colorés par des métaux lourds. Cependant, il est connu que la fixation chimique peut produire des artefacts, y compris l'agrégation des protéines et la perte de lipides 1, et les variations qui affectent les membranes à plusieurs compartiments cellulaires en fin de compte deux. Ces objets sont en grande partie attribuables à la lenteur de la fixation et de la déshydratation à la température ambiante 3, 4, 5.

cryofixation par congélation haute pression (HPF) évite la plupart des artefacts causés par la fixation chimique. Le principe de cryofixation est qu'il abaisse le point de congélation de l'eau de 20 degrés, ralentit la germination et la croissance des cristaux de glace et augmente la viscosité de l'eau dans un échantillon biologique, de sorte que les constituants cellulaires sont essentiellement immobilisées 6, 7. HPF diminue un la température de l'échantillon à celle de l'azote liquide, sous très haute pression (210 MPa ou 2100 bars) en millisecondes. Une fois fait correctement HPF empêche la formation de gros cristaux de glace qui peuvent causer des dommages importants à l'ultrastructure cellulaire. HPF peut être utilisé pour fixer des échantillons de 100 à 200 um d'épaisseur, à des concentrations typiques de solutés biologiques 7. Il ya de nombreux commentaires sur la physique et les principes sous-jacents HPF, par exemple, 1, 7, 8.

Après HPF, les échantillons sont incubés à basse température (-78,5 ° C à -90 &N ° 176, C) en présence de solvants liquides contenant des fixateurs chimiques organiques tels que le tétroxyde d'osmium, généralement pendant quelques jours. A cette température basse, l'eau dans l'échantillon est remplacé par le solvant organique, typiquement le methanol ou l'acétone 1, 9. Ainsi, ce processus est appelé substitution de gel (FS). L'échantillon est ensuite chauffé progressivement et pendant ce temps est fixé, le plus souvent avec du tétroxyde d'osmium et de l'acétate d'uranyle 9. La reticulation à basse température présente l'avantage de fixer des molécules qui sont immobilisées 1. FS produit donc des échantillons de qualité supérieure par rapport à celles qui sont fixées par fixation chimique classique à température ambiante, en particulier, il en résulte une meilleure préservation ultrastructurale, une meilleure conservation de l'antigénicité et de réduction de la perte de composants non liés cellulaires 10, 11.

La plupart des FS est réalisée sur de longues périodes, typiquement jusqu'à plusieurs jours. Ceci est particulièrement true pour les plantes échantillons 12, 13, 14. Un récent protocole développé par McDonald et Webb réduit considérablement le temps de FS de quelques jours à quelques heures 15. Dans leur procédure rapide substitution de gel (SFT), FS est effectuée plus de 3 heures, alors que dans les FS ultra rapides (SQFS) les échantillons sont traités en 90 minutes. La qualité des échantillons produits par ces méthodes est comparable à ceux produits par des protocoles de service fixe traditionnels. Nous avons adopté le protocole de l'EFT pour le traitement en aval des échantillons de plantes après HPF. Cela s'est avéré pour sauver non seulement du temps mais aussi de l'argent, comme l'EFT et SQFS utilisent de l'équipement de laboratoire commun au lieu de les coûteuses machines disponibles dans le commerce FS.

Les tissus végétaux sont souvent très difficiles à préparer pour la MET. En moyenne, les cellules végétales sont plus grandes que soit des cellules bactériennes ou animales. La présence de la cuticule cireuse hydrophobe, des parois cellulaires épaisses, de grandes vacuoles remplies d'eau contenant des acides organiques, des hydrolases phénolique et compounds que peut occuper jusqu'à 90% du volume total de la pile 16, et la présence d'espaces aérés diminue fortement la conductivité thermique du système 17. En outre, dans le cas des plantes, l'épaisseur de l'échantillon dépasse presque toujours 20 pm, la limite d'utilisation de la fixation chimique. A ces épaisseurs, la faible conductivité thermique de l'eau empêche un taux de gel de plus de -10 000 ° C / sec dans le centre de l'échantillon. Ce taux est nécessaire pour éviter la formation de glace hexagonale dommageable (cristaux de glace avec une densité plus faible et plus de 10 à 15 nm) 8. Ensemble, ces défis présents à la fois une bonne congélation de l'échantillon et FS ultérieures. Néanmoins, cryofixation est la meilleure méthode pour la fixation des échantillons de plantes. Ici, un protocole pour HPF-EFT d'échantillons de tissus de plantes sont présentées. Il est centré sur l'espèce modèle Arabidopsis thaliana, mais a aussi été utilisé avec Nicotiana benthamiana. Les résultats montrent que les caractéristiques HPF-SFT produit samples de qualité comparable à HPF-FS traditionnels dans une fraction du temps. Avec les ajustements nécessaires, ce protocole peut également être utilisé pour d'autres échantillons biologiques relativement épais.

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Protocole

NOTE: La procédure de QFS nécessite beaucoup de soins et de prudence par l'utilisateur et nous mettons en évidence les consignes de sécurité ici comme précautions et remarques le cas échéant.

1.PRÉPARATION pour HPF Run

  1. Avant de commencer la préparation des échantillons, mettez au congélateur à haute pression en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE: L'unité HPF utilisé dans ce protocole est une unité Wohlwend Compact 02 (figure 1A), et il faut environ une heure à une heure et demi de procédure de démarrage avant HPF va peut commencer.
    1. Mise en marche du Wohlwend Compact 02 haute pression Congélateur.
      1. Allumez l'appareil en tournant l'interrupteur principal de "0" à "1".
      2. Libérer l'air comprimé de la machine.
      3. Relâcher l'azote liquide à l'appareil.
      4. Appuyez sur la touche "SYSTEM tarir".
      5. Après 30 minutes, appuyez sur le «SYSTENouveau sur la touche M tarir ".
      6. Appuyez sur la touche "ON / OFF" pour allumer l'appareil.
      7. Appuyez sur le bouton «azote».
      8. Laissez la machine refroidir pendant 20 minutes, même si le "DRIVE IN" bouton a déjà allumé.
      9. Le "DRIVE IN" de la touche s'allume.
      10. Appuyez sur le "DRIVE IN" bouton.
      11. Appuyez sur le bouton «AUTO».
      12. Les «système prêt" bouton s'allume.
      13. Placer la sonde de température et de pression dans la chambre de pression et le verrouiller avec la broche.
      14. Appuyez sur le bouton "JET AUTO". Cette étape vérifie que l'augmentation de la pression et la température diminuent sont comme vous le souhaitez; essentiellement un essai. Les fortes baisses de température et de fortes augmentations de la pression sont attendus (figure 1B).
      15. Effectuer deux autres cycles de JET.

2 Préparation pour ReceiviLes échantillons congelés ng

  1. Remplissez une boîte isolée contenant détenteurs cryovial avec de l'azote liquide (voir Mises en garde de sécurité), de sorte que les détenteurs sont complètement couverts (figure 1C).
    REMARQUE: Utiliser PPE y compris Cryogants et des lunettes lors de la manipulation de l'azote liquide.
  2. Placer le nombre approprié de flacons contenant le milieu FS dans les supports de tubes d'aluminium dans l'azote liquide (Figure 1C). Avec ce protocole jusqu'à quatre disques contenant chacune un seul échantillon peut être placé dans un tube cryogénique.
    REMARQUE: Les flacons doivent être étiquetés avec un instrument tranchant comme un scribe à pointe de diamant et un crayon très gras.
    1. Pour fixateur pendant QFS utiliser 1% OsO 4 et 0,1% d'acétate d'uranyle dans l'acétone 9. Préparer la solution à grand volume, distribuer des aliquotes de 1,5 ml dans les tubes cryogéniques et les conserver congelés dans l'azote liquide.
      REMARQUE: Suivez les avertissements de sécurité pour la manipulation OSO4 et de l'acétate d'uranyle.
      REMARQUE: OSO4 et de l'acétate d'uranyle sont des produits chimiques dangereux et doivent être manipulés dans la hotte tout en portant des équipements de protection individuelle (EPI), y compris des chaussures fermées à embout, blouse de laboratoire et des gants.
      REMARQUE: Les tubes cryogéniques utilisés pour contenir des échantillons pour QFS doit avoir un joint torique dur pour s'assurer que les tubes restent scellés pendant QFS pour éviter les fuites de OSO4.
  3. Préparer la pâte de levure en mélangeant la levure de boulangerie avec un volume à peu près égal à 10% de methanol avec un cure-dent ou un autre instrument jusqu'à ce que la pâte soit homogène. La pâte de levure agit comme un agent cryoprotecteur extracellulaire et est utilisée pour remplir l'espace autour de l'échantillon dans le porte-échantillon. La quantité de pâte dépend du nombre d'échantillons; pour 10 échantillons ou moins la pâte (1 ml) peuvent être mélangés dans un tube à centrifuger.

3. haute pression de congélation des échantillons

  1. Retirer une feuille (ou d'autres tissus) d'intérêt de la plante et placez-le doucement sur un morceau de dental cire ou autre surface de coupe. Utiliser un poinçon de 2,0 mm ou la taille souhaitée pour couper un échantillon de la feuille. Manipuler l'échantillon doucement avec une paire de pinces et de travailler le plus rapidement possible.
  2. Travailler sous un microscope de dissection, placez le disque de feuille sur le côté de 0,2 mm de type A de support de l'échantillon et couvrir complètement dans la pâte de levure. Assurez-vous que le disque est complètement rempli, et la pâte est de niveau avec le bord du support en lissant la pâte avec un pinceau fin (figure 2).
  3. Placer le support dans le porte-échantillon. Couvrir l'échantillon avec le support de spécimen de type B, surface plate.
    REMARQUE: Le porte-échantillon doit être sec et à température ambiante.
  4. Prenez échantillon dans le porte-échantillon, l'insérer dans la machine et lancer un cycle de congélation en appuyant sur le bouton "JET AUTO", qui devrait terminer en une seconde ou deux.
  5. Travailler le plus rapidement possible, retirez le support de la machine et placer la pointe maintenant le sample dans de l'azote liquide dans la caisse isotherme au-dessus de la machine HPF. Plonger les pointes des deux paires de pinces dans l'azote liquide pour les refroidir.
    NOTE: Après le gel, les transporteurs ne doivent être manipulés avec des pinces d'azote liquide refroidi. Chauds (température ambiante) forceps sont souvent la cause de l'échec dans cryotechniques.
  6. Ouvrez un tube cryogénique contenant le support FS, et placer le couvercle sur le côté de la boîte. A l'aide d'une paire de forceps de l'azote liquide refroidi, retirer doucement le disque du porte-échantillon, en veillant à ce que le disque est toujours dans l'azote liquide ou de la vapeur. Travailler dans la vapeur d'azote liquide, tenir le tube de FS avec une pince pré-refroidissement et utiliser l'autre pour placer le support dans le flacon de FS. Vissez le bouchon du flacon de FS en marche. Ne pas coincer tout l'azote liquide dans le flacon.
    REMARQUE: Lors du transfert des échantillons de tubes cryogéniques pour QFS, veillent à ce qu'aucune azote liquide est piégé dans les flacons. L'azote liquide se dilate 700 fois pendant le réchauffement et une trapped azote liquide peut provoquer des explosions pendant ce temps.
  7. Répétez les étapes 3.1 à 3.7 jusqu'à ce que tous les échantillons souhaités sont gelés. Des disques de feuilles multiples qui contiennent le même type d'échantillon peuvent être placées dans le même flacon. A noter que le porte-échantillon doit être séché et amené à la température ambiante entre pistes congélation. Pour ce faire vite, chauffer avec un sèche-cheveux, et de surveiller la température par le toucher.

4 Préparation de gel Remplacement

  1. Immerger complètement le bloc chauffant en aluminium dans de l'azote liquide pendant 10 min ou jusqu'à ce que les arrêts d'ébullition nucléée. Bien que ce qui se passe, placer une couche de neige carbonique (1-2 cm) dans le fond du récipient utilisé comme chambre FS (figure 3). Un contenant en styromousse ou seau à glace peuvent être utilisés pour FS, avec de la glace sèche ou des granules écrasés.
  2. Insérer rapidement des cryotubes contenant les échantillons en même temps que la sonde de température dans les rangées du milieu du bloc de chauffage. Assurez-vous que les couvercles sur leles flacons sont hermétiquement vissé sur le support de sorte que FS ne fuit pas lors de FS. Commencer l'enregistrement de la température.
    1. Ajouter la sonde de température en plaçant un thermocouple à travers le sommet d'un tube cryogénique afin qu'il atteigne le fond du tube. Sceller le couvercle du tube avec une résine de sorte qu'aucune fuite de liquide hors. Remplir le tube avec 1,5 ml d'acétone au début de chaque cycle de SFT.
  3. Utilisation Cryogants isolés ou de grandes pinces, verser tout l'azote liquide à partir du bloc chauffant. Prenez soin de ne pas verser les cryotubes.
    REMARQUE: Utiliser PPE y compris Cryogants et des lunettes lors de la manipulation de l'azote liquide.
  4. Placez le bloc contenant les flacons sur la couche de glace sèche dans la chambre de l'EFT. Assurez-vous que le bloc est placé de telle sorte que les tubes sont couchés à l'horizontale, mais avec une légère inclinaison vers le haut. Il devrait y avoir aucune fuite si les cryotubes sont utilisées.
  5. Emballez la chambre de l'EFT avec de la glace sèche de sorte que les tubes de FS sont couvertes, même s'il n'est pas nécessaire derecouvrir la partie supérieure du bloc. Placer le couvercle sur la chambre.

5. rapide FS

REMARQUE: Effectuer la course de l'EFT dans une hotte dans le cas où une fuite de OSO4 se produit par inadvertance en dépit d'autres précautions.

  1. Passer chambre QFS sur un agitateur rotatif de plate-forme dans une hotte de laboratoire et tourner à 125 tours par minute pendant 120 minutes. Pendant ce temps, la température du bloc devrait augmenter progressivement jusqu'à environ -80 ° C. L'agitation assure le mélange des composants pour de meilleures FS.
    REMARQUE: La mise en place de l'agitateur dans la hotte et la position de la porte de la hotte doit être le même tout au long de la procédure de l'EFT et pour tous les QFS gérées pour assurer le réchauffement uniforme des échantillons.
  2. Retirez la glace sèche de la chambre et continuer agitation pendant une heure.
    REMARQUE: la température devrait augmenter à environ -15 ° C à -20 ° C.
  3. Retirer les échantillons et de la sonde de température de la chambre de SFT et le placer sur laagitateur à la température ambiante pendant 10 à 15 min un autre, jusqu'à ce qu'ils atteignent la température ambiante. Arrêter l'enregistrement de la température.
  4. Au cours de FS, éteindre la machine HPF.
    1. Fermer le robinet du réservoir d'azote liquide pendant que la machine HPF est rempli d'azote.
    2. Appuyez sur le bouton «azote».
    3. Attendez jusqu'à ce que les "piston vers le bas" s'éteint la lumière rouge.
    4. Appuyez sur la touche "ON / OFF".
    5. Appuyez sur la touche "SYSTEM tarir".
    6. Couper l'alimentation de l'air comprimé à la machine.
    7. Après un minimum de 12 heures (pour assurer un séchage de l'humidité), éteindre la machine en mettant l'interrupteur principal de "1" à "0".

6. Poster FS traitement

  1. Retirez délicatement les médias FS avec des pipettes de transfert plastique et les placer dans le conteneur approprié pour les déchets toxiques.
    REMARQUE: OSO4 et de l'acétate d'uranyle sont des substances chimiques dangereuseset doivent être manipulés dans la hotte tout en portant des équipements de protection individuelle (EPI), y compris des chaussures fermées à embout, blouse de laboratoire et des gants.
  2. Échantillons Laver quatre fois avec 100% d'acétone. Recueillir les deux premiers lavages et placer dans le conteneur de déchets toxiques.
  3. En utilisant des pinces fines, retirer les échantillons de tissus provenant de porteurs. Conserver les échantillons humide avec de l'acétone comme cela est fait, et travailler très doucement pour éviter la rupture des échantillons.
    NOTE: Il n'est pas rare et il peut effectivement être utile d'avoir la pâte de levure tomber loin des échantillons à ce stade. La pâte de levure est habituellement brun très foncé alors que le tissu de la feuille est encore verte.
  4. Recueillir les échantillons dans des cryotubes contenant de l'acétone. Procéder à la préparation de l'échantillon (infiltration et intégration) pour TEM selon les protocoles habituels.

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Résultats

Les résultats présentés ci-dessous ont été obtenus en utilisant un Compact Wohlwend 02 pour HPF (figure 1A). Un avantage majeur de cet instrument est la facilité d'utilisation des supports de spécimens et de ses détenteurs. Lors de l'utilisation d'autres instruments, McDonald recommande que deux utilisateurs doivent procéder à la préparation des échantillons et HPF, un préparation des échantillons tandis que l'autre ne le gel et le transfert de la FS Cryotubes 9. Cependant, la Wohlwend spécim...

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Discussion

Le succès du protocole présenté ici dépend fortement de l’utilisateur. Tout d’abord, une préparation avancée est nécessaire pour s’assurer que tous les matériaux nécessaires sont facilement disponibles et en quantité suffisante pour effectuer un cycle HPF-QFS complet. Deuxièmement, l’utilisateur doit travailler rapidement, en se déplaçant d’une étape à l’autre d’une manière efficace qui minimise la manipulation des échantillons, minimisant ainsi les changements dans l’état natif du tissu. Une fois les échantillons congel...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La gentillesse et la générosité du Dr Kent McDonald de l’UC Berkeley sont grandement appréciées. Nous remercions un évaluateur anonyme pour ses suggestions très utiles. Le laboratoire Burch-Smith est soutenu par des fonds de démarrage de l’Université du Tennessee.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Wohlwend HPF Compact 02 Machine de congélation à haute pressionTechnotrade International, IncHPF02Avec oscilloscope intégré pour afficher les courbes de congélation et de pression ; Un PC (non inclus) est requis pour l’affichage  ; de paramètres de congélation
Support pour supports d’épicimen en aluminium DN 3 x 0,5 mmTechnotrade International, Inc290
Supports d’échantillons, P=1 000, DN 3 x 0,5 aluminium, type ATechnotrade International, Inc241-200
Supports d’échantillons, P = 1 000, DN 3 x 0,5 aluminium, type BTechnotrade International, Inc242-200
Stockage Dewar 20,5 L, MVE Millennium 2000 XC20Graphique
LevurePlus elle est ancienne, mieux c’est, pour éviter une production excessive de gaz (CO2)
Pics à
Enregistreur de données à thermocouple EL-USB-TCOMEGA Engineering Inc.OM-EL-USB-TC  ;Batterie de remplacement achetée séparément
Sonde de températureMicroscopie électronique Sciences34505
Bloc chauffant 12/13 mm
Agitateur rotatifFisher Scientific11-402-10
Poinçon à feuilles - Harris Uni-core 2.00Ted-Pella Inc.15076
Cire dentaire roseMicroscopie électronique Sciences72660
Flacons cryogéniques 2 mlMicroscopie électronique Sciences61802-02
Méthanol
Sécheur
Glace
Azote
Acétone
PincesPlusieurs paires
de boulanger dentscarboniqueliquide

Références

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