Article de méthode

Détection de l'épissage alternatif durant la transition épithéliale-mésenchymateuse

DOI :

10.3791/51845

⸱

9 octobre 2014

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Il a été démontré que la régulation de l’épissage alternatif

contribue à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant un modèle EMT inductible pour la détection d’épissages alternatifs pendant l’EMT.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’épissage alternatif joue un rôle essentiel dans la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un programme cellulaire essentiel qui se produit dans divers processus physiologiques et pathologiques. Nous décrivons ici une stratégie pour détecter l’épissage alternatif au cours de l’EMT en utilisant un modèle EMT inductible en exprimant le répresseur de transcription Twist. L’EMT est surveillée par des changements dans la morphologie cellulaire, la perte de localisation de l’E-cadhérine aux jonctions cellule-cellule et l’expression commutée des marqueurs EMT, tels que la perte des marqueurs épithéliaux E-cadhérine et γ-caténine et le gain des marqueurs mésenchymateux N-cadhérine et vimentine. À l’aide d’ensembles d’amorces spécifiques aux isoformes, l’épissage alternatif des ARNm intéressés est analysé par RT-PCR quantitative. La production d’isoformes protéiques correspondantes est validée par des tests d’immunoblottage. La méthode de détection des isoformes d’épissage décrite ici convient également à l’étude de l’épissage alternatif dans d’autres processus biologiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM) est un programme de développement qui anime la morphogenèse d'organes et le remodelage tissulaire cours de l'embryogenèse. Lorsque anormalement activée, EMT favorise la métastase de la tumeur et des organes fibrose 1,2. Études convaincantes ont décrit l'importance de la régulation de la transcription au cours du processus de EMT, définie par plusieurs facteurs de transcription, tels que Twist, Snail, et ZEB, qui répriment l'expression de la adhérentes protéine de jonction E-cadhérine, entraînant la perte d'un cobble- pierre comme la morphologie et le gain d'un phénotype mésenchymateux fusiforme 3-8 épithéliale. Des études récentes à travers l'analyse de l'ensemble du génome d'ARN ont révélé qu'il existe un groupe de gènes dont l'épissage modèles sont associés soit aux phénotypes épithéliales ou mésenchymateuses 9,10. Le travail de notre laboratoire relié fonctionnellement épissage alternatif et EMT. En étudiant la surface de la molécule d'adhésion cellulaire CD44, CD44, nous avons démontré que alternative épissage est étroitement régulée pendant EMT, et plus important encore, que CD44 épissure isoforme de commutation de causalité contribue à EMT 11.

L'épissage alternatif est un modèle répandu et conservé de la régulation des gènes, car jusqu'à 95% des gènes multi-exons humains sont épissage alternatif 12-14. En générant de multiples produits de protéines à partir d'un seul gène, épissage alternatif constitue un mécanisme essentiel de la diversité des protéines, en ajoutant une autre couche de complexité au génome humain. En tant que tel, la dérégulation de l'épissage alternatif pourrait conduire à des effets biologiques profonds causent des maladies humaines. En effet, l'épissage alternatif aberrant dans les maladies a été documentée depuis plus d'une décennie 15-25, y compris les conclusions récentes mutations dans les gènes codant pour les machines de splicéosome sont généralement trouvés dans les syndromes myélodysplasiques 26-28. Par conséquent, le développement de méthodes fiables pour la détection de la i alternativement épissésoforms est d'une grande importance dans l'étude de divers processus biologiques, y compris EMT.

Ici, nous fournissons un protocole pour détecter des changements dans l'épissage alternatif en utilisant un modèle d'EMT inductible. Les méthodes de conception d'amorces de PCR et la détection des isoformes d'épissage sont adaptés non seulement pour l'étude de l'épissage alternatif pendant EMT, mais également pour l'étude de l'épissage alternatif dans d'autres processus biologiques. Enquête épissage alternatif pendant EMT est impératif afin de mieux comprendre les mécanismes de EMT et les métastases de la tumeur, facilitant ainsi le développement de stratégies efficaces pour traiter les métastases du cancer.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. culture cellulaire de EMT induction

Remarque: EMT peut être induite par un traitement de TGFß ou l'expression ectopique de facteurs de transcription Twist, Snail, ou ZEB1 / 2 dans les cellules épithéliales. Décrit dans le présent protocole est un système d'EMT inductible par l'expression de la protéine de fusion Twist-ER dans les cellules épithéliales immortalisées humaines mammaires (HMLE / Twist-ER, un don du Dr J Yang, UCSD) 9,11,29. Dès le 4-hydroxytamoxifène (TAM) de traitement, la protéine de fusion Twist-ER translocation vers le noyau pour diriger la transcription et les résultats dans une transition EMT complet dans 12-14 jours 9,11,29. D'autres systèmes inductibles EMT, comme HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß, et MCF10A / TGFß, peuvent être trouvées dans nos précédentes publications 11,30.

  1. Maintenir des cellules HMLE / Twist-ER mammaire dans un milieu de croissance de cellules epitheliales sans sérum (MEGM) dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Passage des cellules tous les 2-3 jours quand ils atteignent 80% de confluence. Incuber les cellules avec 0,15% de trypsine à 37 ° C pendant 5-10 min, puis inactiver la trypsine avec du sérum de veau à 5% / DMEM. Isoler les cellules et les remettre en suspension dans MEGM. cellules de plaque dans une nouvelle boîte de culture tissulaire dans un rapport de 1 à 4.
  2. Dissoudre TAM dans l'éthanol pour obtenir une solution à 200 pM. Protéger TAM de la lumière et conserver à -20 ° C. Avant utilisation, fraîchement ajouter TAM dans MEGM médias à une dilution de 1: 10 000 pour obtenir une concentration finale de 20 nM TAM.
  3. Pour l'induction de l'EMT, l'assiette des cellules de 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER dans une boîte de 10 cm de culture de tissu en double exemplaire. cellules de culture avec 20 nM médias TAM contenant MEGM.
  4. Plate cellules de 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER dans un plat de 10 cm en double exemplaire et traiter les cellules avec 0,01% d'éthanol comme un contrôle non-TAM traité.
  5. Deux jours après l'incubation, prendre des photos sous un microscope optique à un grossissement de 10X pour enregistrer les changements morphologiques des cellules.
  6. Aspirer le milieu d'un plat de contrôle ou TAM-traitécellules. Laver les cellules avec du PBS froid et les cellules de la récolte par la mise au rebut de la moitié de la plaque dans du tampon de lyse d'ARN pour l'isolement d'ARN et l'autre moitié dans du tampon RIPA pour l'analyse des protéines.
  7. cellules de passage de la commande ou de la vaisselle TAM-traités par 1,6 x 10 6 cellules re-placage dans un plat de 10 cm en double exemplaire. Traiter en continu les cellules avec 20 nM TAM ou véhicule.
  8. Répéter les étapes 5 à 7, une fois tous les deux jours jusqu'au jour 14, moment auquel les cellules Twist-ER TAM-traités présentent une mésenchymateuses morphologie fusiforme, tandis que les cellules témoins traités avec le véhicule à maintenir la morphologie epitheliale pavé analogue.

2 Caractérisation des EMT

Remarque: A la fin de l'EMT est indiqué par: (1) Téléphones changements morphologiques d'une morphologie épithéliale pavés comme à un aspect fusiforme fibroblastique-comme; (2) La perte de la E-cadhérine localisation au niveau des jonctions cellule-cellule; et (3) L'expression de marqueurs de commutation EMT, définie par la pertede marqueurs et de gain de marqueurs mésenchymateuses épithéliales.

Téléphones changements morphologiques sont capturés par microscope optique à un grossissement de 10X au cours du temps des EMT induction, décrit dans la section 1 de détection immuno-fluorescence de la E-cadhérine à cellules jonctions est décrit dans cette section. L'expression des marqueurs de TEM est détectée par immuno-empreinte. Marqueurs épithéliaux courants sont la E-cadhérine, γ-caténine, et occludine, et des marqueurs mésenchymateuses incluent la fibronectine, la N-cadhérine et la vimentine. Les procédures générales de immunoblot sont décrits à la section 4.

  1. Au jour 12 du traitement TAM, graines 1 x 10 5 cellules sur une lamelle de verre de 12 mm circulaire placés dans un puits d'une plaque de 24 puits.
  2. 48 heures après l'ensemencement des cellules, moyen d'aspiration et de lavage avec préchauffé PBS.
  3. Fixer les cellules avec préchauffé paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min.
  4. Laver les cellules trois fois avec du PBS.
  5. Incuber les cellules avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15minutes à température ambiante.
  6. Laver les cellules trois fois avec du PBS.
  7. Incuber les cellules dans 5% de BSA / PBS pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer la liaison non spécifique.
  8. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire E-cadhérine à une dilution 1:50 de BSA à 1% / PBS dans une chambre humidifiée O / N à 4 ° C. REMARQUE: La gamme de dilution d'anticorps primaire est normalement comprise entre 1:50 et 1: 200, et la dilution optimale pour chaque anticorps doit être déterminée expérimentalement.
  9. Décanter l'anticorps primaire et laver les cellules trois fois avec du PBS.
  10. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire marqué par fluorescence à une dilution de 1: 500 à 1 heure à température ambiante. De cette étape, protéger les cellules de la lumière.
  11. Décanter l'anticorps secondaire et laver trois fois avec du PBS.
  12. cellules de taches avec 0,1-1 g / ml DAPI ou Hoechst pendant 10 min.
  13. Rincer les cellules avec du PBS à trois reprises.
  14. Mont lamelles de avec une goutte de milieu de montage, et des lamelles d'étanchéité avec du vernis à ongles.
  15. Respecter les cellules et prendreimages sous un microscope à fluorescence 63X.

La coloration avec des anticorps supplémentaires peut être effectuée pour confirmer le phénotype de l'EMT. Par exemple, la N-cadhérine et α-actine de muscle lisse peuvent être colorées pour un phénotype 29,31,32 mésenchymateuses. La réorganisation de la structure du cytosquelette peut être contrôlée par coloration des cellules avec de la phalloïdine pour 11 F-actine. En outre, les dosages de la motilité cellulaire et la résistance à la mort cellulaire peuvent être effectuées pour étudier les propriétés d'EMT 11.

3 Détection de Splice isoformes en utilisant des tests qRT-PCR

  1. Conception Primer
    REMARQUE: paires d'amorces doivent être soigneusement conçues pour amplifier isoformes d'épissage distinctes. Le saut d'exon, le cas de l'épissage alternatif le plus fréquemment observé, est montrée ici comme un exemple pour illustrer la stratégie de conception d'amorce. Figure 1A représente un quatre exon pré-ARNm, avec le troisième exon comme un exon variable. L'inclusion de l'exon 3 résultats dansla production d'une isoforme d'épissage plus, alors saut de l'exon 3 génère une épissure isoforme plus courte. Les amorces doivent être conçues pour distinguer l'isoforme de l'exon 3 et l'exon-inclus-3-isoforme sautée, et à détecter la transcription total de cet ARNm.
    1. Pour la détection de l'exon inclusion, de concevoir avec soin une amorce sens à l'intérieur de l'exon 3 de variable, et une amorce anti-sens à l'intérieur de l'exon constitutive proximité 4, permettant l'amplification spécifique de l'isoforme de l'exon-inclus variable. Veillez à ne pas concevoir deux amorces sens et antisens dans le même exon variable afin d'éviter les produits de PCR amplifiés à partir d'ADN génomique ou pré-ARNm.
    2. Pour amplifier spécifiquement le saut d'exon événements, conception une des amorces couvrant la jonction de l'exon 2 et constitutive exon 4 qui seraient autrement détruits quand l'exon 3 variables est inclus. Concevoir l'autre amorce à l'intérieur du exon constitutive 4 En tant que tel, les produits de PCR sont générés uniquement lorsque l'exon 3 variables est non compris leed et constitutif exon 2 et l'exon 4 sont ensuite réunis.
    3. Pour détecter des transcrits totaux de la génétique, de concevoir les amorces dans les deux exons 1 et 2 constitutifs Ainsi, les produits PCR sont amplifiés à partir de toutes les isoformes.
    4. S'assurer que la température de fusion (Tm) des amorces pour l'ensemble est d'environ 55 ° C, la longueur de chaque amorce est d'environ 18 à 22 nucléotides, et la taille des produits de PCR se situe entre 80 et 150 paires de bases.
  2. extraction de l'ARN: l'ARN extrait à l'aide d'un kit totale d'isolement d'ARN (voir le tableau des matériaux).
    1. Prélever des cellules dans 350 tampon de lyse ARN ul.
    2. Ajouter 350 ul de 70% d'éthanol au lysat et bien mélanger.
    3. Transférer l'échantillon dans la colonne de purification de l'ARN.
    4. Centrifugeuse à 10.000 g pendant 1 min et le rejet accréditives.
    5. Laver la colonne une fois avec 500 pi de lavage de l'ARN tampon I et deux fois avec de l'ARN tampon de lavage II.
    6. Retirer le tampon de lavage d'ARN résiduelII à partir de la colonne par une centrifugation à vitesse maximale pendant deux minutes.
    7. Transférer la colonne dans un nouveau tube de 1,5 ml, ajouter de l'eau sans nucléase 50 ul au centre de la matrice de la colonne et éluer l'ARN par centrifugation à la vitesse maximale.
  3. Synthèse de premier brin d'ADNc
    1. Déterminer la concentration et de la qualité de l'ARN par une mesure d'absorption UV. Remarque: Bonne qualité de l'ARN devrait avoir une 260 nm / 280 nm rapport d'absorbance d'environ 2,0.
    2. Mise en place de la transcriptase inverse (RT) des réactions qui contiennent 250 ARN ng totale, 0,05 ug d'amorces hexamères aléatoires, 50 pmol de MgCl2, 10 pmol de dNTP, un tampon de 2 pi de 5 x GoScript, et 1 pl RT enzyme dans un volume final de 20 ul.
    3. Réaliser des réactions de RT à 42 ° C pendant 1 h, suivie d'une incubation à 70 ° C pendant 5 minutes pour inactiver l'enzyme RT.
  4. PCR en temps réel
    1. Mis en place 20 réactions ul qui se composent de 10 ul SYBR maître vert mélange,0,1 à 1,0 pi d'ADNc matrice, et 5 pmoles d'amorces sens et antisens.
    2. Exécuter la PCR en temps réel avec 40 cycles des étapes suivantes: dénaturation à 95 ° C pendant 10 sec, 58 ° C pour un recuit de 10 secondes, et 60 ° C pendant 30 sec prolongement. Réaliser des réactions de PCR en trois exemplaires.
    3. Vérifiez courbes de dissociation et assurez-vous qu'un seul pic est observé pour chaque jeu d'amorces.
    4. Obtenir les valeurs cycle de quantification (Cq) en calculant les secondes valeurs dérivées des courbes d'amplification.
    5. Calculer la quantité relative (RQ) d'ARNm cibles dans les échantillons induits par rapport à l'échantillon non induit en utilisant le «delta delta Cq (ΔΔCq)« méthode comme représenté par la formule suivante. Utilisez gènes de ménage, comme GAPDH ou PAD, comme une référence.

figure-protocol-1
Pour calculer plus précisément les valeurs relatives des isoformes d'épissage, til utiliser des gènes de référence multiples doit être considéré. Les résultats peuvent être analysés en utilisant une méthode de quantification de la valeur absolue modifié décrit par Pfaffl 33,34 et al.

4. examen de Splice isoformes au niveau des protéines

  1. Prélever des cellules dans 100 tampon RIPA glacée ul.
  2. Réglez lysats sur la glace pendant environ 10 min.
  3. Centrifuger à 14 000 g pendant 10 min à 4 ° C, et recueillir le surnageant.
  4. Mesurer la concentration de protéine par des essais de Bradford.
  5. Diluer les échantillons de protéine dans un tampon de charge SDS charger et de 20 à 40 ug de protéines dans des gels à 10% de SDS-PAGE.
  6. Exécutez gels SDS-PAGE à 20 mA pendant 1,5 heure.
  7. Transfert des protéines sur des membranes de PVDF dans un système de transfert humide à 4 ° C pendant 3 heures à 85 V. ajuster le temps de transfert en fonction du poids moléculaire des protéines cibles.
  8. membrane de bloc dans 5% de lait écrémé pendant 30 min à 1 h à température ambiante.
  9. Incuber membrane with un anticorps primaire à 4 ° CO / N. La gamme de dilution d'anticorps primaire est normalement comprise entre 1: 200 et 1: 5000, déterminer la dilution optimale pour chaque anticorps expérimentalement. La dilution des anticorps utilisés dans ce protocole peut être trouvé dans le "Tableau de réactifs et d'équipements spécifiques".
    1. Pour détecter les isoformes d'épissage, utiliser des anticorps spécifiques qui reconnaissent une isoforme particulière. En variante, en utilisant un anticorps qui reconnaît l'épitope dans la région codante de l'exon constitutive et détecter les isoformes d'épissage en même temps en fonction de leurs différentes dimensions de la protéine.
    2. Dans le même temps, surveiller EMT par immunoblot des marqueurs de l'EMT. Utiliser la E-cadhérine, γ-caténine, et occludine comme marqueurs épithéliaux, et la fibronectine, la N-cadhérine et la vimentine comme marqueurs mésenchymateuses.
  10. Membrane Laver trois fois avec du TBS-T (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) à un intervalle de 5 minutes.
  11. Incuber la membrane avec une fourmi secondaire conjugué à la HRPibody dans une dilution 1: 10 000 à 1 heure à température ambiante.
  12. Membrane Laver trois fois avec du TBS-T à un intervalle de 5 minutes.
  13. Visualiser protéine avec un système de détection de chimioluminescence et exposer la membrane à un film d'autoradiographie.

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Résultats

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Les procédures décrites ci-dessus fournissent une méthode robuste pour détecter l'épissage alternatif pendant EMT. Les résultats représentatifs de commutation de l'isoforme CD44 épissure pendant EMT induite Twist-sont donnés ci-dessous à titre d'exemple.

EMT induite Twist-dans les cellules HMLE / Twist-ER a été caractérisée par une transition d'un pavée comme phénotype épithélial à un phénotype fibroblastique allongée (figure 2A), l'absence de marqueurs épithéliaux E-cadhéri...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La procédure décrite ici permet la détection de l'épissage alternatif dans un modèle d'EMT inductible. Ainsi, les modifications dynamiques de l'isoforme d'épissage expression peuvent être capturées pendant toute la durée de temps de EMT. Cette méthode présente des avantages sur l'utilisation de epithelial- différente ou des lignées de cellules mésenchymateuses-représentant pour la comparaison de l'épissage alternatif d'arrière-plans génétiques distinctes provenant de lignées cellulaires liées...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier Wensheng Liu pour son aide inestimable en matière d’imagerie cellulaire. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (R01 CA182467), de l’American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), de la Fondation Lynn Sage et de la Fondation A Sister’s Hope.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4-hydroxytamoxifèneSigmaH7904Préparez une solution mère en dissolvant le 4-hydroxytamoxifène dans de l’éthanol à 200 μ ;M. Maintenez la solution à -20 ° ; C à l’abri de la lumière.
E.Z.N.A. Kit d’isolement de l’ARN totalOmega Bio-TekR6731Kit d’isolement de l’ARN total
Système de transcription inverse GoScriptPromegaA5001Réactif pour test qRT-PCR
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002Réactif pour test qRT-PCR
LightCycler 480 Système de PCR en temps réelRocheÉquipement pour test qRT-PCR
Anticorps CD44R& D SystemsBBA10Dilution 1:1 000
Anticorps E-cadhérineTechnologie de signalisation cellulaire4065Dilution 1:2 500 pour immunotransfert ; dilution 1:50 pour immunofluorescence
&gamma ;-Catenin AnticorpsTechnologie de signalisation cellulaire2309Dilution 1:1 000
Anticorps occludineSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-5562Dilution 1:500
Anticorps anti-fibronectineBD Transduction Laboratories610077dilution 1:5 000
Anticorps N-cadhérineBD Transduction Laboratories610920Dilution 1:2 000
Anticorps VimentinNeoMarkersMS-129-p1Dilution 1:500
Anticorps GAPDHMillipore CorporationMAB374Dilution 1:10 000
Amasham ECL Western blot réactif de détectionHealth Life ScienceRPN2209Système de chimiluminescence
GE

Références

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RT PCR quantitativeessais d immunotransfertamorces sp cifiques aux isoformesmarqueurs de l EMTisoformes d pissage de CD44mod le inductible de Twisttraitement au tamoxif neanalyse de la morphologie cellulaire

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