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Évaluation des murin exercice d'endurance sans l'utilisation d'une grille de choc: une alternative à l'exercice forcé

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DOI :

10.3791/51846

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14 août 2014

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1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

Dans cet article

Résumé

Une méthode d’évaluation de l’endurance à l’effort chez des souris de laboratoire sans l’utilisation d’une grille de choc est démontrée. Cette méthode est un raffinement humain qui peut réduire les effets confondants du stress sur les paramètres expérimentaux.

Résumé

En utilisant des modèles de souris de laboratoire, les voies moléculaires responsables des avantages métaboliques de l'exercice d'endurance commencent à être défini. La méthode la plus courante pour évaluer l'exercice d'endurance chez les souris utilise des contraint courir sur un tapis roulant motorisé équipé d'une grille de choc. Les animaux qui quittent la course sont poussées par la ceinture mobile du tapis de course sur une grille qui délivre un choc électrique pied; d'échapper au stimulus négatif, les souris retournent à courir sur la courroie. Cependant, le comportement d'évitement et de stress psychologique en raison de l'utilisation d'un appareil de choc peuvent interférer avec la quantification de la course d'endurance, ainsi que des mesures de confondre hormones et cytokines taux sériques après l'exercice. Ici, nous démontrons et de valider une méthode raffinée de mesurer course d'endurance dans naïfs souris C57BL / 6 en laboratoire sur un tapis roulant motorisé sans l'utilisation d'une grille de choc. Lorsque les souris sont preacclimated sur le tapis roulant, ils courent volontairement démarche vitesses spécifiques à chaque mouse. Utilisation de la grille de choc est remplacé par un encouragement douce par un opérateur humain en utilisant un abaisse-langue, couplé avec une sensibilité à la volonté volontaire pour fonctionner sur la partie de la souris. Critères d'évaluation clairs pour quantifier le temps à l'épuisement pour chaque souris exécution sont définis et pris en compte dans des signes comportementaux d'épuisement tels que la posture évasée et une respiration laborieuse. Cette méthode est une amélioration humaine qui diminue également les effets confondants de stress sur les paramètres expérimentaux.

Introduction

L'obésité, la résistance à l'insuline, et le diabète de type 2 sont des troubles métaboliques interdépendantes qui exercent des effets profonds sur la santé des États-Unis et les populations mondiales 1-4. Endurance exercice peut prévenir, ainsi que pour traiter, ces conditions 5,6. En outre, l'évaluation de la vitesse de marche et l'endurance sont utilisés comme tests cliniques de diagnostic pour la fragilité, la sarcopénie, et les conséquences d'autres troubles tels que la maladie pulmonaire obstructive chronique, chez des sujets humains 7.

Les voies biochimiques sous-jacents aux effets bénéfiques de l'exercice d'endurance sur la composition corporelle et la sensibilité à l'insuline commencent à être élucidés, en utilisant des souris génétiquement ou pharmacologiquement modifiés affichage amélioré ou réduit la capacité d'effort 8-11. Cependant, nombre de ces études ont utilisé des tapis roulants motorisés équipés de grilles de choc pour forcer la souris pour lancer 8-11. Les animaux qui quittent la course sont poussés parla courroie mobile du tapis de course sur une grille qui délivre un choc électrique pied; d'échapper au stimulus négatif, les souris retournent à courir sur la courroie. Ces procédures peuvent introduire un stress psychologique et le comportement d'évitement comme facteurs de confusion touchant paramètres expérimentaux 12. D'autres méthodes de mesure de l'endurance, comme la quantification de l'activité ambulatoire en utilisant un appareil faisceau-break ou la quantification des en-cage roue tourne, peuvent être confondus par la modulation des rythmes circadiens, l'anxiété, la formation par inadvertance, ou de la nourriture comportement de recherche 12-16. De plus, ces procédures nécessitent un hébergement individuel, une autre source de stress psychologique chez la souris. Par conséquent, une mesure directe de l'exercice d'endurance pas confondu par le stress est nécessaire.

Pour remédier à ces préoccupations, notre laboratoire a développé et validé une méthode pour évaluer la capacité de fonctionnement maximale et durable vitesse de course chez les souris non formés, naïfs en utilisant un tapis roulant motorisé pas équipé avec une grille de choc. L'espace à la fin de la courroie, où la grille de choc réside habituellement, devient alors une plate-forme pour les souris pour se reposer, et fournit un endroit pour les souris qui refusent de fonctionner à siéger jusqu'à l'enlèvement de l'appareil. Les souris sont encouragées à utiliser par un observateur humain en utilisant tapotant doucement ou de toucher avec un abaisse-langue, couplé avec une sensibilité à la volonté volontaire pour fonctionner sur la partie de la souris. Cette méthode a été utilisée pour quantifier les différences dans l'exercice d'endurance entre les souris C57BL / 6, génétiquement modifiée et à contrôler qui diffèrent dans l'expression de la cytokine muscle dérivé de l'interleukine-15 (IL-15) 16,17. Cette méthode est une amélioration humaine qui diminue les effets confondants de renforcement négatif causé par l'utilisation d'une grille de choc.

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Protocole

La procédure décrite ici a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et son utilisation des animaux VA Puget, et conforme à la ILAR Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

1 Préparation expérimentale

  1. Décidez à l'avance si le sang ou un prélèvement de tissus peu de temps après l'exercice est nécessaire, et si oui, déterminer l'intervalle post-exercice pour la conduction de ces procédures. Les exemples incluent la détermination de l'hormone de induite par l'exercice ou la libération de cytokines dans la circulation (ce qui nécessite la collecte de sang), la détermination de l'expression induite par l'exercice des espèces d'ARNm d'intérêt (nécessitant l'euthanasie, suivie par un prélèvement de tissus). Si immédiat après sang d'exercice ou d'une collection de tissus est indiqué, avoir du matériel pour ces procédures à portée de main dans la salle d'opération. Recevez examen institutionnel approbation du conseil d'administration et effectuer selon les directives réglementaires. Toutes les expériences nécessitent pas de sang après l'exercice ou collecti de tissusur; une simple comparaison de course d'endurance peut être tout ce qui est nécessaire.
  2. Décidez à l'avance sur les groupes expérimentaux et les procédures de post-exercice pour les souris (voir la description ci-dessus).
  3. Placez le tapis roulant sur une table solide dans une pièce calme dédié pendant les essais en cours d'exécution à cette procédure.
  4. Installez le tapis roulant pour voies de souris de taille et à une inclinaison appropriée pour le protocole. L'inclinaison de 5 o est utilisé ici pour éviter les dommages dus à l'exercice excentrique (allongement du muscle en même temps que la contraction) des muscles qui se produit lors de la course de descente.
  5. Placez un tampon absorbant en dessous de la ceinture de tapis roulant pour attraper les excréments.

2. acclimatation de souris sur le tapis roulant

Décidez si un (pas d'exercice) groupe «sédentaire» de la souris est nécessaire, et exposer des souris sédentaires au tapis de course sans courir, comme indiqué dans les étapes 2.1 à 2.5. Déterminer si 2 ou 4 groupes expérimentaux sont nécessaires,. exemple, sédentaire / Exercice (2 groupes); Contrôles exercés / levées de traitement (2 groupes, pas d'animaux sédentaires); ou, sédentaire / Levées x Contrôle / Traitement (4 groupes). Le «traitement» peut être un génotype transgénique ou knock-out, un régime pharmacologique, régime spécial, ou autre intervention expérimentale.

  1. Laissez la souris pour s'acclimater à la salle d'intervention dans sa cage de transport domicile, avec leurs compagnons de cage, pour 1 - 2 h.
  2. Sélectionnez une seule souris et un nombre record d'étiquette; peser la souris et le poids record.
  3. Placez la souris sur le tapis roulant sans le moteur allumé pour l'acclimatation, environ 5 min. Mettre sous tension, sans la ceinture de tapis roulant en marche, et laissez la souris s'acclimater au bruit de la machine pour un autre 5 min.
  4. Retirer les souris dans les groupes «sédentaires» (s'il est utilisé, voir la note 1) du tapis de course à ce moment et les renvoyer dans leur cage ou de mener les procédures post-levée que par la conception expérimentale (voir note 2).

3. Démarrage du test d'exécution à l'épuisement

  1. Après acclimatation, de tourner la courroie à basse vitesse (10 m / min) lorsque l'animal explore la ceinture et non sur la plate-forme.
  2. Appuyer ou soulever l'arrière-train de la souris avec un abaisse-langue, une à trois fois, pour encourager les animaux réticents à rester sur le tapis roulant et courir doucement.
    REMARQUE: La plupart des souris se déroulera facilement, mais ils s'arrêtent parfois pour de courtes périodes. Lorsque cela se produit, utilisez l'abaisse-langue à taper doucement ou soulever l'arrière de l'animal à encourager la reprise de la course. Souvent, les souris n'ont pas besoin d'être touché par l'abaisse-langue; remarquant la main avec l'abaisse-langue venir vers eux provoque les souris à courir un peu plus.
  3. Lancer une minuterie de laboratoire une fois que la souris est en marche à la vitesse initiale de 10 m / min.
  4. Tournez la vitesse lentement lorsque la souris est au sommet (fin vers le haut) de la bande, par incréments de 1 m / min, à propos de toutes les 2 min.
  5. Tournez la vitesse à laréglage précédent si la souris fonctionne à plusieurs reprises dans des éclats courts et pas à un rythme soutenu.
  6. Déterminer la vitesse maximale soutenue fonctionnement de chaque souris (habituellement 14 à 17 m / min pour les souris C57BL / 6) par l'ajustement de la vitesse et en regardant la souris. Enregistrer cette vitesse.
    REMARQUE: L'emplacement de l'animal sur le tapis roulant Queues de l'enquêteur quant à la volonté de l'animal afin de fonctionner à une vitesse supérieure. Si la souris est à l'extrême (en montée) fin et sur le point de courir dans le mur, il est prêt à fonctionner à une vitesse supérieure. Si la souris est en cours d'exécution à un rythme régulier dans le milieu du tapis roulant, il peut être à sa vitesse maximale, ou peut avoir besoin de réglage, en fonction de la qualité de l'analyse.

4. Endpoints et souris qui d'arrêt

  1. Utilisez l'abaisse-langue à taper doucement ou soulever l'arrière-train des animaux qui s'arrêtent, pour encourager la reprise de la course (voir note 3.2). Ne pas arrêter le chronomètre des interruptions temporaires dans la course.
  2. Identifier et REMOVsouris e qui refusent de fonctionner. Indiquer sur la feuille de données. En fonction de votre modèle expérimental, les souris qui refusent peuvent être testés à nouveau sur un autre jour
    NOTE: Certaines souris seront complètement refuser de fonctionner. Ces souris se déroulera dans des éclats courts, puis arrêter de toiletter ou «pédale», c'est-à s'asseoir sur la plate-forme et d'utiliser leurs pattes avant sur le tapis. La posture de ces souris est voûté, avec les quatre pieds plantés sous l'animal pour éviter d'être repoussé sur le tapis roulant par l'abaisse-langue. De temps en temps une souris devient agressif envers l'abaisse-langue quand réticents à courir, mordre l'abaisse-langue ou grimper comme un moyen d'évasion. Il est clair dans les 5 premières minutes de l'essai si la souris, ou ne sera pas, de fonctionner. Retirer les souris qui refusent de courir à partir de l'analyse, mais ne les comptent pas comme des souris «sédentaires».
  3. Identifier souris épuisés et arrêter le chronomètre.
    REMARQUE: Epuisement est définie par trois arrêts successifs et le refus de resume en cours d'exécution en dépit des encouragements doux, plus les signes physiques de fatigue tels que respiration laborieuse et la posture évasée. Souris remettre de l'épuisement dans 30 à 60 min.
  4. Notez le montant total de temps passé à exécuter à toutes les vitesses.
  5. Selon la conception expérimentale, soit retourner la souris est dans sa cage, ou mener des procédures de post-exercice immédiats tels que le sang ou un prélèvement de tissus selon les directives institutionnelles.
  6. Essuyez la bande nettoyer avec une lingette germicide après l'essai de chaque souris individuelle de sorte que le parfum de la souris précédente n'influence pas le comportement des souris testées ultérieures.
  7. Testez la prochaine souris. Utilisez une nouvelle abaisse-langue pour chaque souris. Les souris qui se trouvent dans la même cage peuvent être testés séquentiellement dans la même journée sans acclimatation supplémentaire à la salle d'intervention.

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Résultats

Ce procédé de mesure de l'endurance physique reflète fidèlement le profil moléculaire et métabolique de différentes souches de souris C57BL / 6 qui diffèrent dans l'expression de la cytokine IL-15 16,17. Les souris transgéniques qui surexpriment l'IL-15 (IL-15 TG souris) exposition a augmenté considérablement les temps d'exécution à épuisement par rapport aux témoins de même portée, alors que les souris que l'IL-15 (IL-15 KO souris) exposition n'ont pas réduit considérablement les temp...

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Discussion

Décrit ici est un procédé pour évaluer l'endurance de roulement volontaire chez la souris de laboratoire au moyen d'un tapis roulant motorisé sans l'utilisation d'une grille de choc. Cette méthode peut révéler des différences entre les sous-lignes de souris C57BL / 6 qui diffèrent dans l'expression de la cytokine IL-15, qui à son tour provoque des différences dans l'expression de facteurs sous-jacents à l'exercice d'endurance 16,17. En accord avec les principes de la «trois R» ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer.

Remerciements

Soutenu par l'examen du mérite # BX001026 du ministère des Anciens Combattants (LSQ), et l'utilisation des ressources et des installations au système de soins de santé VA Puget Sound, le Core transgénique ressources de l'Université de Washington Amortisseur central Nathan d'excellence dans la biologie fondamentale du vieillissement (NIA # 5P30AG-013280), et l'Université de Washington Diabète Endocrinologie Research Center (NIH # P30 DK-17047). Nous remercions Cynthia Pekow DVM et Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, ont fourni des commentaires utiles sur le manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Open Rodent Treadmill Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMCe numéro de catalogue est pour les modèles sans grille d’amortisseur. Les grilles d’amortisseurs peuvent être retirées manuellement des anciens modèles (Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYgénéralement commandé par l’intermédiaire d’un établissement localContient 10 % d’alcool isopropylique ; tout produit équivalent peut être utilisé.
Abaisse-langueTout fournisseur
Minuterie de laboratoireTout fournisseur
IL-15 TG souris *JAX, Bar Harbor, ME011002murin Transgène IL-15 exprimé à partir d’un promoteur d’actine alpha-squelettique humaine modifié avec une séquence de signal modifiée pour faciliter la sécrétion.
Souris C57BL/6J (de type sauvage)*JAX, Bar Harbor, ME000664Souris témoins pour souris IL-15 TG
IL-15 KO*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MSouris homozygotes IL-15 « knockout » sur fond C57BL
/6 C57BL/6NTac (type sauvage)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-MSouris témoins pour IL-15 KO
*Facultatif ; les lignées de souris et les traitements peuvent être spécifiques à l’expérimental protocole.
local

Références

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

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Mots-clés

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