Universal à main en trois dimensions optoacoustique sonde d'imagerie pour Deep Tissue angiographie humain et des études précliniques fonctionnels en temps réel

Résumé

Nous fournissons ici une description détaillée du protocole expérimental pour l’imagerie avec un nouveau système optoacoustique portable (photoacoustique) pour l’imagerie fonctionnelle et moléculaire tridimensionnelle en temps réel. Les performances puissantes et la polyvalence démontrées peuvent définir de nouveaux domaines d’application de la technologie optoacoustique dans la recherche préclinique et la pratique clinique.

Résumé

La combinaison exclusive d’un contraste optique élevé et d’une excellente résolution spatiale rend l’optoacoustique (photoacoustique) idéale pour obtenir simultanément un contraste anatomique, fonctionnel et moléculaire dans des tissus optiquement opaques profonds. Bien que l’application de l’optoacoustique à la recherche sur les petits animaux ait récemment démontré un énorme potentiel, de vastes efforts ont également été déployés pour traduire cette technologie d’imagerie dans la pratique clinique. Nous présentons ici une nouvelle approche de tomographie optoacoustique capable de fournir des images volumétriques à haute résolution et enrichies spectralement de la morphologie et de la fonction des tissus en temps réel. Une description détaillée du protocole expérimental de fonctionnement avec le système d’imagerie en mode manuel et stationnaire est fournie et présentée pour différents scénarios potentiels impliquant des études fonctionnelles et moléculaires sur des modèles murins et humains. La possibilité de visualisation en temps réel en trois dimensions ainsi que la conception portable polyvalente de la sonde d’imagerie rendent l’approche nouvellement développée unique parmi le panthéon des modalités d’imagerie utilisées dans la recherche préclinique et la pratique clinique d’aujourd’hui.

Introduction

Acousto-optique (photo-acoustique) imagerie attire de plus en plus l'intérêt des communautés de recherche biologique et médicale, qui se manifeste par le nombre sans cesse croissant de publications couvrant variété de nouvelles applications qui exploitent les avantages uniques offerts par la technologie ^1-5. En particulier, la capacité à image distinctive spectrale agents de photo-absorption avec une résolution spatio-temporelle à des profondeurs bien au-delà de la limite de diffusion de la lumière ouvre capacités sans précédent pour l'imagerie fonctionnelle et moléculaire ^6-10.

En effet, la traduction de la technologie acousto-optique dans la pratique clinique est livré avec des perspectives prometteuses dans le diagnostic et le suivi du traitement de nombreuses maladies. Cependant, la propagation limité de photons dans la dispersion optique et de tissus absorbants et les réponses faibles généralement associés au phénomène optoacoustique limiter la profondeur de la méthode applicable. En conséquence, optoa portatifCoustic sondes ont été tentées pour des parties d'image accessibles depuis l'extérieur du corps de ^11,12 alors que les systèmes endoscopiques sont utilisés pour fournir des images de l'intérieur du corps en les insérant par des orifices naturels ^13. Certaines parties faible absorption de corps humain, tels que le sein féminin, sont également accessibles par les scanners tomographiques ^14,15 acousto-optique. Un intérêt particulier est l'approche à main car il permet un grand polyvalence, de façon similaire à l'échographie. Ici, l'adaptation des ultrasons commune linéaires sondes de tableau pour l'imagerie acousto-optique reste difficile, principalement en raison de différences fondamentales dans les exigences d'imagerie tomographique entre l'échographie et optoacoustics. Bien que les taux de rafraîchissement élevé en échographie norme sont activés par séquentiel émission-réception systèmes utilisant des fréquences de répétition élevé d'impulsions dans la gamme kHz, l'imagerie acousto-optique en temps réel en trois dimensions est obtenue par collecte simultanée de données tomographiques volumétrique d'un seul interrogating impulsion laser. Ainsi, l'imagerie acousto-optique de haute qualité implique l'acquisition de données en trois dimensions de la plus grande angle solide possible autour de l'objet imagé.

Récemment, nous avons lancé la première sonde acousto-optique pour portable en trois dimensions (volumétrique) l'imagerie en temps réel ^16. Le système est basé sur un réseau bidimensionnel de 256 éléments piézo-électriques disposés sur une surface sphérique (points bleus dans la Figure 1A) couvrant un angle de 90 °. La taille des éléments individuels de l'ordre de 3 x 3 mm ^2, ainsi que leur orientation et la bande passante de la fréquence (environ 2-6 MHz) garantissent collection de signal efficace d'un volume centimétrique entourant le centre de la sphère (cube noir sur la figure 1A). Excitation optique de la région de formation d'image est muni d'un faisceau de fibres inséré à travers une cavité cylindrique centrale de la matrice, de sorte que la longueur d'onde quelconque SUSCeptible d'être transmise à travers le faisceau de fibres peut être utilisé pour l'imagerie. Une image réelle de la matrice de transducteurs avec le faisceau de fibres optiques est représentée sur la figure 1B. L'excitation efficace et la détection simultanée de signaux permet l'imagerie des tissus profonds avec une seule photo excitation (une impulsion laser), de sorte que l'imagerie en temps réel à une cadence déterminée par la fréquence de répétition des impulsions du laser est plus activé avec un Graphics- traitement-unité (GPU) la mise en œuvre de la procédure de reconstruction ^17. Un boîtier cylindrique avec une membrane de polyéthylène transparent (figure 1C) est fixé à la matrice de transducteur pour enfermer un milieu liquide transmettant acoustique (de l'eau). La membrane est en outre couplé au tissu au moyen d'un gel acoustique. Une image de la sonde acousto-optique d'être utilisé en mode de fonctionnement à main est illustré à la figure 1D.

Le thr démontrédimensions imagerie acousto-optique à main ee combinée avec le temps réel la capacité de l'imagerie fonctionnelle venir avec des avantages importants pour les diagnostics cliniques et un certain nombre d'applications potentielles sont envisagées pour diverses indications, telles que la maladie vasculaire périphérique, du système lymphatique, le cancer du sein, des lésions cutanées, l'inflammation ou de l'arthrite ^18. En outre, la capacité d'imagerie rapide permet la visualisation d'événements biologiques dynamiques avec la sonde disposé dans une position stationnaire. En combinaison avec l'oscillateur paramétrique optique (OPO), la technologie laser rapide en longueur d'onde d'accord, cette approche permet une imagerie en temps réel de la biodistribution des agents photo-absorbant. Ainsi, de nouvelles possibilités peuvent également émerger dans de petites applications d'imagerie animale, par exemple., Dans l'étude de l'hémodynamique des tissus, suivi in vivo dans des cellules, la visualisation de la pharmacocinétique, la perfusion des organes, ciblé imagerie moléculaire des tumeurs et le système cardiovasculaire, ou neuro-imagerie.

Dans ce travail, nous présentons une description détaillée du protocole d'imagerie expérimental pour fonctionner avec le réseau sphérique acousto-optique sonde et vitrine performances portatif dans plusieurs scénarios cliniques et petits typiques imagerie animale.

Protocole

La procédure détaillée pour fonctionner avec la sonde acousto-optique à main volumétrique est décrit ci-dessous. Cette procédure est effectuée selon la réglementation en ce qui concerne l'établissement approuvés expériences animales et humaines.

1. Préparation du système

1. Mettre en marche le laser pendant une période d'échauffement de ~ 15 min avant l'opération de stabilisation du faisceau de lumière de sortie.
2. Placer la partie de l'eau renfermant de la membrane d'isolement qui est en contact avec la peau (Figure 1).
   REMARQUE: La distance entre la membrane d'isolement (en contact avec la peau) et la région de sensibilité maximale du capteur (centre du palpeur sphérique) définit la profondeur d'imagerie efficace.
3. Compléter le volume total d'environ 100 ml entre la membrane isolante et la surface du transducteur avec de l'eau désionisée à l'aide d'une pompe.
4. Assurez-vous qu'aucun des bulles de fuite d'eau ni air sont present. Sinon, éviter les bulles d'air en fournissant recirculation de l'eau.
5. Réaliser les essais à la température ambiante et assurer le milieu de couplage (eau) est maintenue à cette température.

2. Préparation d'imagerie

1. Préparation d'imagerie humain.
2. Enlever les poils de la partie à être imagées avec une lotion d'épilation afin d'éviter un fond indésirable dans les images (cette étape est facultative).
3. Appliquer le gel à ultrasons à la peau autour de la région à imager afin de fournir un couplage acoustique efficace. Placer la sonde optoacoustique dans la région d'intérêt. Veiller à ce que les bulles d'air sont présents dans le gel de couplage ultrasonore.
4. préparation d'imagerie animale.
5. Veiller à ce que les procédures de soins et expérimentales sur les animaux sont en accord avec les règles et les règlements institutionnels et gouvernementaux.
6. Retirer la fourrure de l'animal dans la zone à imager avec une lotion de rasage. Protéger les yeux de l'animal avecvétérinaire pommade, qui prévient le dessèchement et les dommages causés par l'exposition à un rayonnement laser intense pulsée.
7. Anesthésier l'animal à l'aide d'une injection intrapéritonéale (IP) de kétamine / xylazine (100 mg / kg kg de kétamine + 5 mg / kg KG xylazine) avant l'expérience ou une anesthésie isoflurane (2-3% (en volume) avec 0,9 l / min débit de gaz) pendant l'expérience. Confirmer anesthésie en vérifiant le réflexe de la patte postérieure de l'animal.
8. Appliquer le gel à ultrasons à la peau autour de la région à imager afin de fournir un couplage acoustique efficace et placer la sonde optoacoustique dans la région d'intérêt. Veiller à ce que les bulles d'air sont présents dans le gel de couplage ultrasonore.

3. Pré-affichage en mode de fonctionnement

1. Mettre en place la longueur d'onde (s) de formation d'image entre 690 nm et 900 nm et le taux de répétition des impulsions entre 10 et 50 Hz. Sélectionner les paramètres du système d'acquisition de données acoustiques - 1 MQimpédance d'entrée. Acquérir 2030 échantillons pour chaque impulsion de laser à un taux de 40 Mégaéchantillons par seconde et 12 bits résolution verticale échantillonnage. Déclencher l'acquisition de la sortie Q-switch du laser.
2. Veiller à ce que l'opérateur et le patient utilisent des lunettes de protection adaptées à la longueur d'onde (s) d'excitation optique. Régler la puissance du laser de sorte que l'influence de la lumière à la surface de tissu est maintenue en dessous de 20 mJ / cm ² lors de l'expérience pour des longueurs d'onde du proche infrarouge de manière à satisfaire des limites d'exposition de sécurité pour les expériences de l'homme ¹⁹ et pour éviter la fatigue thermique et de lésions de la peau chez les animaux .
3. Démarrer le logiciel de pré-vision avec une mise en oeuvre de GPU d'algorithmes de traitement pour permettre la visualisation d'images tridimensionnelles à une vitesse de défilement correspondant à la vitesse de répétition des impulsions du laser.
4. Déplacer la sonde et / ou l'objet à imager afin d'optimiser les performances de visualisation et de localiser les structures d'intérêt.

4. Acquisition de données

1. L'acquisition des données pour le mode de balayage (à main).
2. Si besoin est, d'injecter un produit de contraste avant l'acquisition d'enrichir le contraste dans la région d'intérêt.
   NOTE: Dans nos expériences nous ont pas effectué imagerie humaine contraste amélioré. Cependant, divers agents de contraste peuvent être potentiellement utilisés dans ce but. Vert d'indocyanine (ICG), est un exemple d'agent de contraste optique cliniquement approuvé qui peut être utilisé pour l'amélioration du contraste à dose maximale recommandée de 2 mg / kg de poids corporel chez l'adulte.
3. Lancer le matériel d'acquisition de données avec les paramètres décrits dans le maintien de la 3.1 l'exécution du logiciel de prévisualisation. Déplacez doucement la sonde autour de la région imagée pour suivre les structures d'intérêt.
   REMARQUE: lorsque les images à de multiples longueurs d'onde laser sont acquis simultanément, la vitesse de déplacement de la sonde dans le mode portatif doit être diminué de façon significative (de préférence inférieure à 2 mm / spour un taux de répétition des impulsions laser de 50 Hz) afin d'éviter les artefacts relative au mouvement dans les images spectrale non mélangés.
4. L'acquisition des données en mode stationnaire.
5. Montez l'objet imagé (ex., Animaux) et la sonde à main sur le support et lancer l'acquisition avec les paramètres décrits à la section 3.1 de maintien de l'exécution du logiciel pré-vue.
6. Maintenir la sonde optoacoustique et la partie de formation d'image dans la même position pendant l'expérience pour visualiser événements biologiques dynamiques de la région d'intérêt.
7. Injecter un agent de contraste pour suivre sa distribution dynamique dans la région d'intérêt.
   REMARQUE: Dans nos expériences, des souris, vert d'indocyanine (ICG) a été utilisé pour l'augmentation du contraste. En règle générale, une quantité de 10 nmoles ou 0,4 mg / kg d'ICG doit être introduit dans la circulation sanguine de la souris afin de créer un contraste détectable avec optoacoustics multi-spectrales in vivo.
   REMARQUE: L'agent de contraste doit êtreapprouvé pour un usage humain et / ou animal par l'autorité respective.

5. Finaliser l'expérience

1. Arrêtez le laser.
2. Retirer la sonde acousto-optique de la région imagée. Pour l'étude des animaux, arrêter l'alimentation de l'anesthésie.
3. Placez l'animal sous un chauffage à infrarouge pour garder la chaleur et éviter le contact avec d'autres animaux jusqu'à ce que complètement récupéré de l'anesthésie. Ne pas laisser l'animal sans surveillance lors de la récupération de l'anesthésie.

6. Off-line de traitement des données

1. Chargez le fichier (s) contenant les signaux acousto-optique acquise dans l'application de logiciels utilisés pour le traitement des données.
2. Utiliser un algorithme de reconstruction pour obtenir une matrice à trois dimensions correspondant à une image volumétrique de l'absorption optique pour chaque trame et chaque longueur d'onde.
   NOTE: Pour la reconstruction, il est préférable d'utiliser un algorithme tenant compte de facteurs de distorsion, comme HeterogeneLITÉS et l'atténuation de l'objet imagé, les effets de bande passante finale et forme géométrique des éléments de détection et de légères variations de fluence, afin d'obtenir une représentation plus quantitative de la distribution de l'énergie absorbée.
3. Utiliser un algorithme de déconvolution pour obtenir, à partir de chaque trame multi-longueur d'onde, une nouvelle série de tableaux de la matrice en trois dimensions représentant l'absorption optique pour chaque substance absorbante présente dans l'échantillon.
4. Si nécessaire, traiter en outre les matrices de la matrice représentant la distribution de l'absorption optique pour faciliter la visualisation et la lecture des paramètres biologiques pertinents.

Résultats

Les résultats représentatifs, ce qui démontre les capacités de la sonde volumétrique décrit à main acousto-optique, sont présentés dans cette section. Dans tous les cas, l'influence de lumière sur la surface de la peau a été maintenue en dessous de la limite d'exposition de la sécurité de 20 mJ / cm ^{2 19.}

La performance de la sonde en temps réel le suivi vasculaire périphérique humain est présenté à la figure 2. Au cours de cette expérience, la sonde a été lenteme...

Discussion

Les avantages uniques offerts par les techniques d'imagerie acousto-optique dans la recherche de petits animaux ont créé une forte motivation pour la traduction de la technologie dans la pratique clinique, avec un certain nombre de diagnostics et les applications de surveillance de traitement par exemple envisagés., Cancer du sein et de la peau, l'inflammation ou les maladies du système vasculaire périphérique. Cependant, par opposition à des souris ou des animaux plus petits, qui peuvent être entourés ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Laser à oscillateur paramétrique optique (OPO)	Innolas Laser GmbH, Krailling (Allemagne)	sur mesure	Le laser fournit des impulsions laser d’une durée d’environ 10 nsec et d’une énergie allant jusqu’à 80 mJ. La longueur d’onde est réglable entre 680 et 950 nm.
Réseau sphérique de détecteurs piézocomposites	Imasonic SaS, Voray (France)	sur-mesure	Le réseau se compose de 256 capteurs piézoélectriques répartis sur une surface sphérique. Chaque élément a des dimensions de 3 x 3 mm2, une fréquence centrale de 4 MHz et une bande passante de 100 %.  ;
Système d’acquisition de données (DAQ)	Falkenstein Mikrosysteme GmbH, Taufkirchen (Allemagne)	mesure	L’DAQ acquiert simultanément 256 signaux à 40 mégaéchantillons par seconde et 2 030 échantillons. L’impédance d’entrée est de 1 MW.
Faisceau de fibres	CeramOptec GmbH, Bonn (Allemagne)	sur mesure	Le faisceau se compose de 480 fibres individuelles réparties de manière aléatoire dans l’entrée et la sortie. L’ouverture numérique de chaque fibre individuelle est de 0,22.
Souris nue athymique	Harlan Laboratories (Pays-Bas)	Nu athymique - Foxn1nu	La souris était âgée de 8 semaines (adulte) au moment de l’expérience. Le protocole éthique a été approuvé par le gouvernement bavarois (numéro 55.2.1.54-2632-102-11)
Crème Bepanthen	Bayer AG (Allemagne)		Pommade vétérinaire pour protéger les yeux pendant l’anesthésie
Logiciel	de traitement des donnéesMatlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	sur-mesure	Le logiciel de traitement des données a été développé à notre institute. Il permet la reconstruction à chaque longueur d’onde et le démélange de plusieurs longueurs d’onde, ainsi que le traitement ultérieur des données.
Cette			pièce contient l’eau qui agit comme un milieu de couplage acoustique entre la peau et les éléments du transducteur
Vert d’indocyanine (ICG)	PULSION Medical Systems SE		ICG-PULSION (principe actif : colorant vert d’indocyanine) est un médicament utilisé dans le diagnostic cardiaque, circulatoire et micro-circulatoire, le diagnostic de la fonction hépatique et le diagnostic de l’angiographie ophtalmique.

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