télomérase est exprimée dans le cerveau néonatal et également dans des régions distinctes du cerveau adulte. Nous présentons un test TRAP non toxique permettant de gagner du temps pour l’analyse de l’activité de la télomérase dans diverses régions du cerveau de la souris et la détection des différences d’activité de la télomérase entre les cerveaux des souris mâles et femelles.
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Article de méthode
Activité de la télomérase dans les différentes régions du cerveau de souris: la télomérase non-radioactifs Répétition protocole d'amplification (TRAP) Dosage
Dans cet article
Résumé
Résumé
La télomérase, une ribonucléoprotéique, est responsable du maintien de la longueur des télomères et donc la promotion de l'intégrité génomique, la prolifération et la durée de vie. En outre, la télomérase protège les mitochondries de stress oxydatif et confère une résistance à l'apoptose, ce qui suggère son importance possible pour le survivant de non-mitotique des cellules hautement actifs tels que les neurones. Nous avons démontré précédemment la possibilité de nouveaux activateurs de la télomérase pour augmenter l'activité de la télomérase et d'expression dans les diverses régions du cerveau de la souris et pour protéger les cellules des neurones moteurs du stress oxydatif. Ces résultats renforcent l'idée que la télomérase est impliqué dans la protection des neurones à partir de diverses lésions. Pour souligner le rôle de la télomérase dans le cerveau, nous comparons ici l'activité de la télomérase dans le cerveau mâle et femelle souris et sa dépendance à l'âge. test TRAP est un procédé standard pour la détection de l'activité de la télomérase dans différents tissus ou lignées cellulaires. Ici, nous démontrons l'analysis de l'activité télomérase dans les trois régions du cerveau de souris non dénaturant par extraction de protéines à l'aide de CHAPS tampon de lyse suivi d'une modification de la méthode TRAP standard.
Dans cet essai, deux étapes, la télomérase endogène s'allonge un substrat spécifique de la télomérase (TS d'amorce) en ajoutant 6 répétitions TTAGGG pb (réaction de télomérase). Les produits de la réaction de télomérase sont amplifiés par réaction de PCR créer une échelle d'ADN de six incréments de pb. L'analyse de l'échelle de l'ADN est effectué par 4,5% en haute résolution électrophorèse sur gel d'agarose suivie par une coloration avec très sensible aux taches d'acide nucléique.
Par rapport à la méthode TRAP traditionnels qui utilisent marqué au 32P radioactif dCTP de la détection de l'ADN et de polyacrylamide électrophorèse sur gel de résolution de l'échelle de l'ADN, ce protocole offre un gain de test TRAP pour évaluer l'activité de la télomérase dans le cerveau de la souris, ce qui démontre la capacité de temps de non-toxique détecter des différences dans telomerasl'activité dans les différents e région du cerveau de la souris mâle et femelle.
Introduction
La télomérase est une ribonucléoprotéine composé de télomérase transcriptase inverse (TERT), la sous-unité catalytique de la télomérase, et un composant d'ARN (TERC). Le rôle canonique de la télomérase est de préserver la bonne longueur des télomères en ajoutant des séquences répétitives (TTAGGG) aux extrémités télomériques, favorisant ainsi l'intégrité du génome, et une prolifération cellulaire. Autres rôles ont été attribués à TERT dans les cellules, c'est à dire qu'il confère une résistance à l'apoptose induite par divers agent endommageant 2, protège les cellules souches mésenchymateuses humaines du stress oxydat....
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Protocole
Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité d'éthique pour l'expérimentation animale dans l'Université Ben Gourion (IL-39-08-2010).
Extraction de la protéine 1 de cerveau de souris
- Préparer 3 tubes de 15 ml contenant chacun 5 ml de solution et placer les tubes Ringer sur la glace.
- Sacrifier la souris en utilisant l'isoflurane (ATTENTION - utiliser hotte chimique) pendant 10-20 sec suivie par dislocation cervicale et décapitation immédiate.
- Retirez le cerveau du crâne et de rincer pendant quelques secondes avec la solution de Ringer glacée pour éviter d'endommager les tis....
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Résultats
Des extraits protéiques de cellules entières ont été préparés à partir du lobe frontal (FL), le tronc cérébral (BS) et le cervelet (CR), dérivé de la femelle et 3 souris CD-1 mâles de 3 1 CD aux âges de 1 et 3 mois pour l' test TRAP modifié et 3 souris CD-1 mâles à l'âge de 2 mois pour le test TRAP radioactifs. L'activité de télomérase a été détectée dans une ug de protéines extrait en utilisant le test TRAP à jour et 2 mg de protéines pour extraire le test TRAP radioactif. Détection de l'activité de la télomérase par l.......
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Discussion
Analyse de l'activité de la télomérase dans le cerveau de la souris par le test TRAP est constitué de quatre étapes principales: 1) l'extraction des protéines à partir de régions spécifiques du tissu cérébral 2) TS élongation d'amorce par la télomérase - réaction télomérase 3) l'amplification des produits de la réaction de télomérase par PCR 4 ) séparation des produits de PCR en utilisant un gel d'agarose de haute résolution.
Ce test TRAP modifié répond à deux grandes dif.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été partiellement soutenu par la technologie B.G. Negev et la contribution de Linda Powers.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| TRAP Mix (10x) | Fabriqué manuellement, mélangez les éléments suivants dans UPW : 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5 % TWEEN (acheté chez Sigma). Les aliquotes sont congelées à -20 °C. | ||
| de Ringer | Fabriquée manuellement, mélangez les éléments suivants dans DDW : 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4· ; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1,802 g/L de D-(+)-glucose anhydre. | ||
| Isoflurane | Minrad INC. | NDC 60307-110-10 | Manipuler avec précaution dans un capot chimique |
| dNTPs (10 mM) | Amorce Sigma | D7295 | |
| TS (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')Oligos d’ADN | Sigma | commandés au format DRY et UPW ajoutés selon la concentration requise | |
| Amorce ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | commandés au format DRY et UPW ajoutés selon les besoins concentration | |
| Titane Taq Polymérase/Tampon | Clontech | S1792/S1793 | |
| Agarose haute résolution | Sigma | A4718 | Toute agarose haute résolution de haute qualité peut être sutible |
| Appareil mini-gel | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Teinture d’acide nucléique (GEL-RED) | Biotium | 41003 | |
| Amorce IC (5'-ATCGCTTCTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | commandés au format DRY et UPW ajoutés en fonction de la concentration requise | |
| Tampon de lyse CHAPS | Technologie de signalisation cellulaire | 9852S | Ajouter PMSF (inhibiteur de protéase) à une concentration finale de 1 mM |
| d’eau ultra pure (UPW) | Biological Industries | 01-866-1B | |
| CD-1 souris | HARLAN Laboratories INC. |
Références
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by nove....
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Réimpressions et autorisations
