La synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules humaines

Résumé

Dans cet article, vidéo, on décrit la synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules.

Résumé

La fourniture exogène d'un ARN messager codant synthétique (ARNm) pour l'induction de la synthèse des protéines dans les cellules souhaitées a un potentiel énorme dans les domaines de la médecine régénérative, la biologie de la cellule de base, le traitement de maladies, et la reprogrammation de cellules. Ici, nous décrivons une étape par étape de protocole pour la production de l'ARNm modifié avec un potentiel d'activation immunitaire réduite et une meilleure stabilité, le contrôle de la qualité de l'ARNm produit, la transfection de cellules avec de l'ARNm et de la vérification de l'expression de la protéine induite par cytométrie en flux. Jusqu'à 3 jours après une seule transfection avec eGFP ARNm, les cellules HEK 293 transfectées produisent eGFP. Dans cet article, la vidéo, la synthèse de l'ARNm eGFP est décrite à titre d'exemple. Cependant, la procédure peut être appliquée à la production de l'ARNm d'autres souhaités. Utilisation de la synthèse de l'ARNm modifié, les cellules peuvent être amenés à exprimer transitoirement les protéines désirées, dont ils ne seraient normalement pas exprimer.

Introduction

Dans les cellules, la transcription de l'ARN messager (ARNm) et la traduction de l'ARNm en suivant protéines désirées assurer le bon fonctionnement des cellules. Troubles génétiques héréditaires ou acquis peuvent conduire à la synthèse insuffisante et dysfonctionnel de protéines et provoquer des maladies graves. Ainsi, une nouvelle approche thérapeutique pour induire la production de protéines manquantes ou défectueuses est exogène de la livraison synthétique modifié ARNm dans des cellules, qui code pour la protéine désirée. Ainsi, les cellules sont déclenchées à synthétiser des protéines fonctionnelles, dont ils ne peuvent normalement pas produire ou seraient naturellement pas besoin. En utilisant cette approche, des troubles génétiques peuvent être corrigés par introduction de l'ARNm qui code pour la protéine défectueuse ou manquante ^1. Le traitement de l'ARNm peut également être utilisé pour la vaccination de synthétiser des antigènes protéiques qui sont exprimés par les cellules tumorales ou de pathogènes. De ce fait, le système immunitaire de l'hôte peut être activé afin d'éliminer efficacement les cellules tumorales ou prévenir infections ^2,3. En outre, ces dernières années, l'ARNm a été utilisée avec succès pour générer des cellules souches pluripotentes induites (CISP). A cet effet, les fibroblastes ont été transfectées avec des ARNm pour induire l'expression de facteurs de reprogrammation ^4-6 et pour les convertir en iPSCs avec un énorme potentiel en médecine régénératrice.

Auparavant, l'utilisation de l'ARNm conventionnel a été associée à une faible stabilité et une forte immunogénicité. Ainsi, les applications cliniques des ARNm conventionnelles ont été limitées. Toutefois, le remplacement de la cytidine et l'uridine par la 5-méthylcytidine et pseudouridine intérieur de la molécule d'ARNm en Kariko et collègues rendu des molécules d'ARNm stables dans les fluides biologiques et de réduire considérablement l'activation immunitaire ^10.7, ce qui permet maintenant l'applicabilité clinique de l'ARNm modifiés.

Utilisation ARNm modifiés produits par synthèse, les transcriptions de gènes souhaités peuvent être livrés temporairement in vivo ¹¹ou in vitro pour induire l'expression de la protéine. L'ARNm est traduit introduit dans des conditions physiologiques par la machinerie de traduction cellulaire. En raison de l'absence d'intégration dans le génome de la cellule hôte par rapport à des vecteurs viraux pour la thérapie génique, le risque d'oncogenèse est empêché ^12,13. Ainsi, la thérapie utilisant de l'ARNm synthétique modifié ira mieux acceptation clinique à l'avenir.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la production de l'ARNm modifié (figure 1), la transfection de cellules avec l'ARNm et de l'évaluation de l'expression des protéines dans les cellules transfectées.

Protocole

1. Augmentation de plasmides contenant nécessité de classer les séquences d'ADN (CDS)

1. Préchauffer milieu SOC, qui est inclus dans le kit de transformation, à la température ambiante et les plaques de gélose LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline à 37 ° C. Équilibrer le bain d'eau à 42 ° C.
2. Décongelez un flacon de composant chimique E. coli sur la glace.
3. Ajouter 1-5 ul du plasmide (10 pg à 100 ng) contenant les CDS dans le flacon de composant chimique E. coli et mélanger délicatement. Ne pas mélanger les cellules par pipetage. Après l'ajout de plasmides, mélanger en tapotant doucement le tube.
4. Incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min.
5. Choc thermique E. coli pendant 30 sec à 42 ° C dans un bain d'eau sans agitation.
6. Placer le flacon sur de la glace pendant 2 min.
7. Ajouter 250 ul de milieu SOC préchauffé à E. coli et secouer les bactéries horizontalement à 300 tours par minute pendant 1 heure à 37 ° C dans un incubateur bactérienne.
8. Étaler 100 pi et 150 pi de mélange de transformation sur des plaques de gélose LB préchauffé, inverser les plaques et incuber une nuit à 37 ° C.
9. Après colonies deviennent visibles, inoculer une colonie unique à partir de chaque plaque dans un tube de culture de 15 ml contenant 5 ml de milieu LB avec 100 ug / ml d'ampicilline. Incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 300 tours par minute jusqu'à ce que la culture est à la fin de journal ou de la phase stationnaire.
10. Pour le stockage à long terme de transformer E. coli, pipette 75 ul de 100% de glycérol dans le cryovial. Ajouter 225 ul de la culture bactérienne (stock congelé contient 25% de glycérol), bien mélanger et stocker le cryovial à -80 ° C.
11. Isoler les plasmides contenant les CD requis en utilisant un kit de purification de plasmide selon les instructions du fabricant.
12. Déterminer la concentration de plasmide en utilisant un spectrophotomètre.
13. Préparer des aliquotes de 20 pi et de les stocker à -20 ° C pour le temps prolongée.

_title "> 2. Amplification du plasmide Inserts et ajout de Poly T-queue par réaction en chaîne de la polymérase (PCR)

1. REMARQUE: Pour obtenir la matrice d'ADN pour la transcription in vitro (IVT), les CDS d'intérêt, ici eGFP, est amplifié par PCR. En même temps, un poly-T de queue 120 thymidines (T) est ajoutée à l'insert au moyen d'une amorce inverse avec un prolongement T _120. Ainsi, les ARNm générés obtenir un poly A-queue avec une longueur définie après l'IVT.
2. Préparer le mélange de PCR comme indiqué dans le tableau 1.
3. Bien mélanger le mélange réactionnel. NOTE: produit PCR peut être utilisée dans 4-5 réactions IVT. Pour augmenter la quantité de matrice d'ADN pour IVT, le volume total du mélange de PCR peut être augmentée. Plusieurs tubes de PCR de chaque mélange contenant 100 ul de PCR peuvent être utilisées pour obtenir un rendement suffisant du produit de PCR.
4. Placer les tubes PCR dans un thermocycleur et lancer la PCR en utilisant le protocole de cycle de PCR (tableau 2).
5. Nettoyer le PCR réaction en utilisant un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant et on élue l'ADN en utilisant 20 de l'eau sans nucléase ul.
6. Mesurer la concentration de l'ADN en utilisant un spectrophotomètre. REMARQUE: La concentration d'ADN détecté est d'environ 300 pg / ml. Ainsi, le montant total prévu devrait être ~ 6 pg. La quantité d'ADN pour d'autres protéines peut varier en fonction de la longueur de CDS, la quantité de plasmide utilisée pour la PCR, la température de recuit d'amorces, et le numéro de cycle.
7. Geler l'ADN à -20 ° C pendant une longue période ou l'utiliser directement pour IVT.

3. Contrôle étape: la qualité du produit PCR

1. Contrôle de la qualité du produit de PCR par électrophorèse sur gel de l'ADN.
2. Mélanger la quantité souhaitée d'agarose à 1 x TBE dans un ballon. Pour un gel d'agarose à 1%, ajouter 0,5 g d'agarose à 50 ml de TBE 1x.
3. Micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose est dissous. Ne pas laisser bouillir. Assurez-vous que l'agarose est complètement en solution.
4. Ajouter 5 ul nucléique tache de gel d'acide à 50 ml de gel d'agarose.
5. Verser le gel dans une boîte de gel d'agarose, réglez le peigne, et attendre environ 1 heure jusqu'à ce que le gel se solidifie.
6. Retirer le peigne et placer la boîte de gel dans un plateau de gel.
7. Mélanger 2 pi (200 ng) de 80-10,000 pb ADN Ladder et 200 ng de produit PCR chacune avec 2 pi de tampon de charge 6x dans un volume total de 12 ul.
8. Charger soigneusement les échantillons d'ADN dans les puits du gel d'agarose.
9. Utilisation de TBE 1x comme tampon, exécutez le gel d'agarose à 100 V pendant 1 heure.
10. Visualiser les bandes d'ADN sur un système de formation d'image (figure 2).

4. Transcription in vitro (IVT)

1. NOTE: Après PCR, les inserts plasmidiques sont amplifiés et un poly T-queue est ajouté. Au cours de l'IVT, l'information génétique est transcrit à partir de l'ADN à l'ARN. La transcription de l'ARNm généré est utilisé pour produire des protéines dans les cellules.
2. Nettoyer la zone de travail et pipettes avec une RNase dsolution de econtamination. Utilisez PCR conseils propre et stérile pipette à double filtre et changer fréquemment gants pour minimiser la contamination de la réaction se mélange avec RNases.
3. Préparer le mélange de NTP analogique / bouchon de la manière décrite dans le tableau 3.
4. Mélanger le mélange analogique NTP / cap en vortexant et centrifuger brièvement.
5. Assembler le mélange réactionnel à IVT décrit dans le Tableau 4.
6. Mélanger le mélange réactionnel IVT soigneusement la pipette doucement de haut en bas. Ensuite, centrifuger brièvement le tube PCR à recueillir le mélange à la partie inférieure du tube.
7. Incuber à 37 ° C pendant 3 heures dans un thermomixeur.
   NOTE: Le temps d'incubation optimal dépend de la longueur des inserts et efficacité de la transcription de template. Pour les inserts courts (<500 nt), un temps d'incubation plus long peut être avantageux. Une expérience décours temporel peut être effectuée pour déterminer le temps d'incubation optimal pour un rendement maximal. Par conséquent, mettre en place des réactions de FPI, pour example, pour 1, 2, 3, 4, 6 h, et incubation pendant une nuit et déterminer la quantité d'ARNm. La cinétique de la transcription in vitro pour la production de l'ARNm eGFP est représenté sur la Figure 3.
8. Pour supprimer la matrice d'ADN, ajouter 1 pl de DNase (2 U / pi) au mélange réactionnel IVT, bien mélanger et incuber 15 min à 37 ° C.
9. On purifie le mélange réactionnel en utilisant un kit de purification de l'ARN selon les instructions fabricant. On élue l'ARNm modifié à partir de la membrane de la colonne de centrifugation à deux reprises avec de 40 l'eau sans nucléase ul. REMARQUE: La concentration d'ARN détectée est d'environ 1500 pg / ml. Ainsi, le montant total prévu devrait être ~ 120 ug. La quantité d'ARNm synthétisé pour d'autres protéines peut varier en fonction de la longueur de la CDS et la quantité de produit PCR utilisé pour IVT.

5. Traitement des ARNm purifié avec de l'Antarctique phosphatase

1. REMARQUE: L'ARNm généré est traité à la phosphatase pour éliminer 5 'trides phosphates, qui peuvent être reconnues par RIG-I et conduisent à l'activation immunitaire. En outre, le traitement à la phosphatase empêche la re-circularisation à une réaction auto-ligature.
2. Ajouter 9 ul de 10 x tampon de réaction de la phosphatase Antarctique à 79 ul de solution de l'ARNm purifié. Par la suite, ajouter 2 pl de phosphatase Antarctique (5 U / pl) et mélanger délicatement l'échantillon. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 30 min.
3. On purifie le mélange réactionnel en utilisant un kit de purification de l'ARN selon les instructions fabricant. On élue l'ARNm modifié à partir de la membrane de la colonne de centrifugation à deux reprises avec de 50 l'eau sans nucléase ul.
4. Mesurer la concentration de l'ARNm modifié à l'aide d'un spectrophotomètre. Vérifiez que le rapport de l'absorbance à 260 nm / 280 nm (A ₂₆₀ / A ₂₈₀₎ est ≥ 1,8 et le rapport A ₂₆₀ / A ₂₃₀ est de 2,0, ce qui indique une pureté.
   NOTE: Le rendement total prévu devrait être d'environ 90 mg, qui est sufficient pour environ 36 transfections ARNm.
5. Ajuster la concentration de l'ARNm de 100 ng / ul en ajoutant de l'eau sans nucléase.
6. Aliquoter l'ARNm modifié en aliquotes à usage unique nécessaires pour transfections et conserver à -80 ° C. Eviter les cycles multiples de gel et de dégel. Correctement préparée et stockée ARNm est stable depuis de nombreuses années. Pendant le travail, toujours garder l'ARNm modifié sur la glace.

6. Contrôle étape: la qualité de l'ARNm synthétisé à jour

1. Vérifiez la qualité de l'ARNm modifié par électrophorèse sur gel d'ARN.
2. Mélanger la quantité souhaitée d'agarose à 1 x TBE dans un ballon. Pour un gel d'agarose à 1%, ajouter 0,5 g d'agarose à 50 ml de TBE 1x.
3. Micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose est dissous. Ne pas laisser bouillir. Assurez-vous que l'agarose est complètement en solution.
4. Ajouter 5 ul nucléique tache de gel d'acide à 50 ml de gel d'agarose.
5. Verser le gel dans une boîte de gel d'agarose, réglez le peigne, et attendre environ 1 heure jusqu'à ce que le gel est solidified.
6. Retirer le peigne et placer la boîte de gel dans un plateau de gel.
7. Mélanger 3 ul (3 ug) de 0,5 à 10 kb et l'ARN Ladder 200 ng d'ARNm modifié synthétisé chacun avec 7 ul de tampon de charge dans un volume total de 10 ul. La composition du tampon de charge est décrite dans le tableau 5.
8. Dénaturer l'échelle et les échantillons d'ARNm à 70 ° C pendant 10 min.
9. Disposer soigneusement l'échelle et les échantillons d'ARNm sur le gel d'agarose 1%.
10. Effectuer une électrophorèse à 100 V pendant 1 heure en utilisant 1x TBE comme tampon.
11. Visualisez l'échelle et bandes d'ARNm sur un transilluminateur UV et photo à l'aide d'un système de documentation de gel (figure 4).

7. Préparation des cellules pour la transfection

1. Planche 2 x10 ⁵ cellules (cellules HEK293) par puits de plaque de 12 puits.
2. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur de cellules. NOTE: Le jour de la transfection, les cellules doivent avoir réached 80-90% de confluence.

8. Effectuer la transfection d'ARNm des cellules

1. Décongeler l'ARNm modifié.
2. Générer les lipoplexes pour la transfection.
3. Ajouter 25 ul (2,5 ug) de l'ARNm modifié et 2 pi d'cationique réactif lipidique de transfection de 473 ul d'Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I réduit milieu de sérum pour produire le mélange de transfection pour la transfection d'un puits d'une plaque à 12 puits. Élargir le volume en fonction du nombre de puits à transfecter. Comme contrôle négatif, préparer un mélange de transfection sans ARNm.
4. Mélanger les composants doucement par pipetage. Incuber le mélange de transfection à la température ambiante pendant 20 min pour produire des lipoplexes pour la transfection.
   REMARQUE: Le mélange de transfection contient pas d'antibiotiques. Ainsi, prendre soin d'assurer la stérilité lors de la manipulation des cellules.
5. Laver les cellules avec 500 DPBS ul / puits.
6. Ajouter 500 ul de mélange de transfection pour un puits d'un puits 12 plate.
7. Incuber les cellules pendant 4 h à 37 ° C et 5% de CO _2.
8. Aspirer le mélange de transfection et ajouter 1 ml de milieu complet de culture cellulaire pour les cellules.
9. Incuber les cellules pendant 24 heures dans l'incubateur de cellules.
10. Effectuer l'analyse microscopique de fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence (Figure 5). NOTE: Pour examiner l'expression d'autres protéines dans des cellules, qui sont produites par transfection avec de l'ARNm autre que l'ARNm codant pour eGFP, les cellules peuvent être cultivées sur des lamelles couvre-objet. Ensuite, la transfection peut être réalisée et les cellules peuvent être colorées avec des anticorps appropriés et analysés par microscopie à fluorescence.

9. Les analyses par cytométrie en flux de eGFP expression dans les cellules

1. Éliminer le milieu de culture cellulaire à partir des puits et lavez chaque puits avec 1 ml DPBS (sans calcium et magnésium). Ajouter 500 ul de trypsine / EDTA dans chaque puits pour détacher les cellules de la surface des plaques de culture cellulaire. Ensuite, ajouter 500ul TNS par puits pour inactiver la trypsine.
2. Centrifuger les cellules individuelles pendant 5 min à 300 g à la température ambiante. Eliminer le surnageant en laissant seulement la pastille. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 150 pi de solution de fixation cellulaire et de transférer la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie de flux.
3. Analyser le pourcentage de cellules exprimant EGFP et l'intensité de fluorescence en utilisant Geo Mean (moyenne géométrique de l'intensité de fluorescence) (Figure 6).

10. La mesure de l'expression des protéines dans le temps

1. Effectuer l'ARNm de la transfection de cellules dans 3 puits d'une plaque à 12 puits comme décrit dans l'étape 8. En outre, trois puits d'incuber des cellules HEK293 avec le mélange de transfection sans l'ajout d'ARNm.
2. Mesure de l'expression de eGFP 1, 2, et 3 jours après la transfection afin d'évaluer la durée de l'expression de la protéine (figure 7).

Résultats

Utilisation d'un plasmide pcDNA 3.3 contenant les CDS de la EGFP, la synthèse de l'ARNm modifié eGFP a été établie (figure 1). Après insert amplification par PCR et poly T-tailing, une bande claire avec une longueur d'environ 1100 pb est détecté (Figure 2). L'augmentation du temps de IVT augmenté le rendement de l'ARNm (Figure 3). Après l'IVT, une bande d'ARNm clair avec une longueur d'environ 1100 pb a été détecté, ce qui correspond à la longueur de l'ARNm de eGFP à ré...

Discussion

La thérapie ARNm a un énorme potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, le traitement des maladies et la vaccination. Dans cette vidéo, nous démontrons la production d'un ARNm modifié stabilisée pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules. En utilisant ce protocole, d'autres ARNm souhaités peuvent être générés. La synthèse in vitro de l'ARNm modifié permet la transfection de cellules avec des ARNm désirées pour induire l'expression de protéines cibles. De...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Culture cellulaire
DMEM, high glucose	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Pénicilline/Streptomycine  ;	PAA	P11-010	100x
L-glutamine  ;	PAA	M11-004	200 mM
DPBS sans calcium ni magnésium	PAA	E15-002
0,04 % trypsine / 0,03 % EDTA  ;	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Solution neutralisante de trypsine, inhibiteur de trypsine à 0,05 % dans 0,1 % de cellules BSA
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Consommables
Plaques de culture tissulaire, 12 puits  ;	Corning	3512
Fiole de culture cellulaire (75 cm2)  ;	Corning	430641
microcentrifugation stériles de 1,5 ml sans DNase ni RNase.	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml tubes coniques  ;	pointes	de
PCR propres et stériles.	Eppendorf	10 et micro ; l : 022491202 ; 100 et micro ; l : 022491237 ; 1 000 et micro ; l : 022491253
Grenaillage cryovial bio-one	122279-128	Cryo.s  ;
Tube à fond rond en polypropylène de 14 ml pour la culture bactérienne	BD Falcon	352059
Amplification et purification du plasmide
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid  ;	Addgene	26822
One Shot Top10 composant chimique d’Escherichia coli  ;	Invitrogen	C4040-10
Eau stérile (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)  ;	Carl Roth	X968.1	Dissoudre 25 g L-1 dans de l’eau stérile.
Gélose LB (Luria/Miller)  ;	Carl Roth	X969.1	Dissoudre 40 g L-1 dans de l’eau stérile.
Ampicilline Solution Prête à l’emploi	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml  ;
Glycérol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit  ;	Qiagen	27104
production d’ARNm
HotStar HiFidelity Polymerase Kit  ;	Qiagen	202602
QIAquick Kit de purification PCR  ;	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit  ;	Life Technologies	AM1334
5-Méthylcytidine-5&aiguë ;-triphosphate  ;	Trilink	N1014	5-méthyl-CTP
Pseudouridine-5&aiguë ;-triphosphate  ;	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´ ;-O-Me-m7G(5´ ;)PPP(5&aigu ;)G ARN cap structure analogue  ;	New England Biolabs	S1411L
Inhibiteur de RNase RiboLock	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µ ; l  ;
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µ ; l (du kit MEGAscript T7)
Phosphatase antarctique  ;	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit  ;	Qiagen	74104
RNaseZap solution  ;	Life Technologies	AM9780
Lipofectamine 2000  ;	Invitrogen	11668-019	Réactif de transfection lipidique cationique
Opti-MEM I Reduced Serum Media  ;	Invitrogen	11058-021	Milieu Essentiel Minimal (MEM) amélioré qui permet une réduction de la supplémentation en sérum de veau fœtal (FBS)
Électrophorèse sur gel
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003	10,000x dans l’eau  ;
peqGOLD Gamme Mix DNA-Ladder  ;	Peqlab	25-2210
Analyses de cytométrie en flux
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentré  ;
Amorce pour amplification d’insert et PCR de queue poly (T)
Forward Primer (grade HPLC) 10 µ ;	M Ella Biotech		5´ ;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ ;
Amorce inversée (qualité HPLC) 10 & micro ;	M Ella Biotech		5´ ;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ ;
Equipment
Cell Binder	Binder		CO2 (5 %) et O2 (20 %)  ;
Compteur de cellules CASY  ;	Schä ; rfe System
Établi stérile  ;	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Incubateur bactérien  ;	Spectrophotomètre ScanDrop
	Thermocycleur analytique Jena
PCR  ;	Eppendorf
Microcentrifugeuse	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixeur	Eppendorf
Appareil à gel pour électrophorèse  ;	de documentation Bio-Rad
Gel  ;	Bio-Rad
FACScan  ;	BD Biosciences
Microscope à fluorescence  ;	Microscope à
;	Zeiss