La synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules humaines

Résumé

Dans cet article, vidéo, on décrit la synthèse in vitro de l'ARNm modifié pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules.

Résumé

La fourniture exogène d'un ARN messager codant synthétique (ARNm) pour l'induction de la synthèse des protéines dans les cellules souhaitées a un potentiel énorme dans les domaines de la médecine régénérative, la biologie de la cellule de base, le traitement de maladies, et la reprogrammation de cellules. Ici, nous décrivons une étape par étape de protocole pour la production de l'ARNm modifié avec un potentiel d'activation immunitaire réduite et une meilleure stabilité, le contrôle de la qualité de l'ARNm produit, la transfection de cellules avec de l'ARNm et de la vérification de l'expression de la protéine induite par cytométrie en flux. Jusqu'à 3 jours après une seule transfection avec eGFP ARNm, les cellules HEK 293 transfectées produisent eGFP. Dans cet article, la vidéo, la synthèse de l'ARNm eGFP est décrite à titre d'exemple. Cependant, la procédure peut être appliquée à la production de l'ARNm d'autres souhaités. Utilisation de la synthèse de l'ARNm modifié, les cellules peuvent être amenés à exprimer transitoirement les protéines désirées, dont ils ne seraient normalement pas exprimer.

Introduction

Dans les cellules, la transcription de l'ARN messager (ARNm) et la traduction de l'ARNm en suivant protéines désirées assurer le bon fonctionnement des cellules. Troubles génétiques héréditaires ou acquis peuvent conduire à la synthèse insuffisante et dysfonctionnel de protéines et provoquer des maladies graves. Ainsi, une nouvelle approche thérapeutique pour induire la production de protéines manquantes ou défectueuses est exogène de la livraison synthétique modifié ARNm dans des cellules, qui code pour la protéine désirée. Ainsi, les cellules sont déclenchées à synthétiser des protéines fonctionnelles, dont ils ne peuvent normalement pas produire ou seraien....

Protocole

1. Augmentation de plasmides contenant nécessité de classer les séquences d'ADN (CDS)

1. Préchauffer milieu SOC, qui est inclus dans le kit de transformation, à la température ambiante et les plaques de gélose LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline à 37 ° C. Équilibrer le bain d'eau à 42 ° C.
2. Décongelez un flacon de composant chimique E. coli sur la glace.
3. Ajouter 1-5 ul du plasmide (10 pg à 100 ng) contenant les CDS dans le flacon de composant chimique E. coli et mélanger délicatement. Ne pas mélanger les cellules par pipetage. Après l'ajout de plasmides, mélanger en tapotant doucement le tube.
4. ....

Résultats

Utilisation d'un plasmide pcDNA 3.3 contenant les CDS de la EGFP, la synthèse de l'ARNm modifié eGFP a été établie (figure 1). Après insert amplification par PCR et poly T-tailing, une bande claire avec une longueur d'environ 1100 pb est détecté (Figure 2). L'augmentation du temps de IVT augmenté le rendement de l'ARNm (Figure 3). Après l'IVT, une bande d'ARNm clair avec une longueur d'environ 1100 pb a été détecté, ce qui correspond à la longueur de l'ARNm de eGFP à ré.......

Discussion

La thérapie ARNm a un énorme potentiel dans le domaine de la médecine régénérative, le traitement des maladies et la vaccination. Dans cette vidéo, nous démontrons la production d'un ARNm modifié stabilisée pour l'induction de l'expression des protéines dans les cellules. En utilisant ce protocole, d'autres ARNm souhaités peuvent être générés. La synthèse in vitro de l'ARNm modifié permet la transfection de cellules avec des ARNm désirées pour induire l'expression de protéines cibles. De.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Culture cellulaire
DMEM, high glucose	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
Pénicilline/Streptomycine  ;	PAA	P11-010	100x
L-glutamine  ;	PAA	M11-004	200 mM
DPBS sans calcium ni magnésium	PAA	E15-002
0,04 % trypsine / 0,03 % EDTA  ;	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Solution neutralisante de trypsine, inhibiteur de trypsine à 0,05 % dans 0,1 % de cellules BSA
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Consommables
Plaques de culture tissulaire, 12 puits  ;	Corning	3512
Fiole de culture cellulaire (75 cm2)  ;	Corning	430641
microcentrifugation stériles de 1,5 ml sans DNase ni RNase.	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml tubes coniques  ;	pointes	de
PCR propres et stériles.	Eppendorf	10 et micro ; l : 022491202 ; 100 et micro ; l : 022491237 ; 1 000 et micro ; l : 022491253
Grenaillage cryovial bio-one	122279-128	Cryo.s  ;
Tube à fond rond en polypropylène de 14 ml pour la culture bactérienne	BD Falcon	352059
Amplification et purification du plasmide
pcDNA 3.3_eGFP Plasmid  ;	Addgene	26822
One Shot Top10 composant chimique d’Escherichia coli  ;	Invitrogen	C4040-10
Eau stérile (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)  ;	Carl Roth	X968.1	Dissoudre 25 g L-1 dans de l’eau stérile.
Gélose LB (Luria/Miller)  ;	Carl Roth	X969.1	Dissoudre 40 g L-1 dans de l’eau stérile.
Ampicilline Solution Prête à l’emploi	Sigma Aldrich	A5354	100 mg/ml  ;
Glycérol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit  ;	Qiagen	27104
production d’ARNm
HotStar HiFidelity Polymerase Kit  ;	Qiagen	202602
QIAquick Kit de purification PCR  ;	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Kit  ;	Life Technologies	AM1334
5-Méthylcytidine-5&aiguë ;-triphosphate  ;	Trilink	N1014	5-méthyl-CTP
Pseudouridine-5&aiguë ;-triphosphate  ;	Trilink	N1019	Pseudo-UTP
3´ ;-O-Me-m7G(5´ ;)PPP(5&aigu ;)G ARN cap structure analogue  ;	New England Biolabs	S1411L
Inhibiteur de RNase RiboLock	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µ ; l  ;
TURBO DNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µ ; l (du kit MEGAscript T7)
Phosphatase antarctique  ;	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kit  ;	Qiagen	74104
RNaseZap solution  ;	Life Technologies	AM9780
Lipofectamine 2000  ;	Invitrogen	11668-019	Réactif de transfection lipidique cationique
Opti-MEM I Reduced Serum Media  ;	Invitrogen	11058-021	Milieu Essentiel Minimal (MEM) amélioré qui permet une réduction de la supplémentation en sérum de veau fœtal (FBS)
Électrophorèse sur gel
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Gelred Nucleic Acid Gel Stain	Biotium	41003	10,000x dans l’eau  ;
peqGOLD Gamme Mix DNA-Ladder  ;	Peqlab	25-2210
Analyses de cytométrie en flux
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentré  ;
Amorce pour amplification d’insert et PCR de queue poly (T)
Forward Primer (grade HPLC) 10 µ ;	M Ella Biotech		5´ ;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´ ;
Amorce inversée (qualité HPLC) 10 & micro ;	M Ella Biotech		5´ ;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´ ;
Equipment
Cell Binder	Binder		CO2 (5 %) et O2 (20 %)  ;
Compteur de cellules CASY  ;	Schä ; rfe System
Établi stérile  ;	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Incubateur bactérien  ;	Spectrophotomètre ScanDrop
	Thermocycleur analytique Jena
PCR  ;	Eppendorf
Microcentrifugeuse	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixeur	Eppendorf
Appareil à gel pour électrophorèse  ;	de documentation Bio-Rad
Gel  ;	Bio-Rad
FACScan  ;	BD Biosciences
Microscope à fluorescence  ;	Microscope à
;	Zeiss