Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d'ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Summary

Les analyses

RNA-Seq deviennent de plus en plus importantes pour identifier les fondements moléculaires des traits adaptatifs dans les organismes non modèles. Ici, un protocole permettant d’identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les moustiques Aedes albopictus diapause et non diapause est décrit, de l’élevage des moustiques au séquençage de l’ARN et aux analyses bioinformatiques des données RNA-Seq.

Abstract

La diapause photopériodique est une adaptation importante qui permet aux individus d’échapper à des environnements saisonniers difficiles via une série de changements physiologiques, notamment l’arrêt du développement et la réduction du métabolisme. Le profilage global de l’expression génique via RNA-Seq peut fournir des informations importantes sur les mécanismes transcriptionnels de la diapause photopériodique. Le moustique tigre asiatique, Aedes albopictus, est un organisme exceptionnel pour l’étude des bases transcriptionnelles de la diapause en raison de sa facilité d’élevage, de sa diapause facilement induite et des ressources génomiques disponibles. Ce manuscrit présente un flux de travail expérimental général pour identifier les différences transcriptionnelles induites par la diapause chez A. albopictus. Les techniques d’élevage, les conditions nécessaires pour induire le développement de la diapause et de la non-diapause, les méthodes d’estimation du pourcentage de diapause dans une population, ainsi que l’extraction de l’ARN et l’évaluation de l’intégrité des moustiques sont documentées. Un flux de travail pour traiter les données de séquençage de l’ARN des séquenceurs Illumina aboutit à une liste de gènes exprimés de manière différentielle. Les résultats représentatifs démontrent que ce protocole peut être utilisé pour identifier efficacement les gènes régulés différentiellement au niveau transcriptionnel chez A. albopictus en raison de différences photopériodiques. Avec des ajustements modestes, ce flux de travail peut être facilement adapté pour étudier les bases transcriptionnelles de la diapause ou d’autres traits importants de l’histoire de la vie chez d’autres moustiques.

Introduction

Les progrès rapides des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) offrent des opportunités passionnantes pour sonder les fondements moléculaires d’un large éventail d’adaptations écologiques génétiquement complexes dans une grande diversité d’organismes non modèles^{1 à 3}. Cette approche est extrêmement puissante car elle établit une base pour les études de génomique des populations et fonctionnelles d’organismes ayant une écologie ou une histoire évolutive particulièrement intéressante et/ou bien décrite, ainsi que d’organismes préoccupants dans la pratique, tels que les ravageurs agricoles et les vecteurs de maladies. Ainsi, les technologies NGS conduisent à des progrès rapides dans les domaines de l’écologie et ont le potentiel de résoudre des problèmes tels que la compréhension des bases mécanistes des réponses biologiques au changement climatique contemporain rapide⁴, la propagation des espèces envahissantes⁵ et les interactions hôte-pathogène^6,7.

Le potentiel extraordinaire des technologies NGS pour répondre aux questions fondamentales et appliquées en écologie et en biologie évolutive est en partie dû au fait que ces approches peuvent être appliquées à n’importe quel organisme à un coût modéré qui est réalisable pour la plupart des laboratoires de recherche. De plus, ces approches fournissent des informations à l’échelle du génome sans nécessiter de ressources génétiques a priori telles qu’une puce à puce ou une séquence génomique complète. Néanmoins, pour maximiser la productivité des expériences NGS, il faut examiner attentivement la conception expérimentale, y compris des questions telles que le calendrier de développement et la spécificité tissulaire de l’échantillonnage d’ARN. En outre, les compétences techniques requises pour analyser les quantités massives de données produites par ces expériences, souvent jusqu’à plusieurs centaines de millions de lectures de séquences d’ADN, ont constitué un défi particulier et ont limité la mise en œuvre généralisée des approches NGS.

Des études récentes de RNA-Seq sur les bases transcriptionnelles de la diapause chez le moustique envahissant et important sur le plan médical Aedes albopictus fournissent un exemple utile de certains des protocoles expérimentaux qui peuvent être utilisés pour appliquer avec succès la technologie NGS à l’étude de la base moléculaire d’une adaptation écologique complexe dans un organisme non modèle^8–10. A. albopictus est une espèce très envahissante originaire d’Asie, mais qui a récemment envahi l’Amérique du Nord, l’Amérique du Sud, l’Europe et l’Afrique^11,12. Comme de nombreux insectes tempérés, les populations tempérées d’A. albopictus survivent tout l’hiver en entrant dans un type de dormance appelé diapause photopériodique. Chez A. albopictus, l’exposition des femelles nymphes et adultes à des journées courtes (automnales) entraîne la production d’œufs de diapause dans lesquels le développement embryologique est terminé, mais la larve pharate à l’intérieur du chorion de l’œuf entre dans un arrêt de développement qui rend l’œuf réfractaire au stimulus^{d’éclosion 15–17}. Les ovules de diapause sont plus résistants à la dessiccation^5,18 et contiennent plus de lipides totaux¹⁹ que les ovules non diapause. La diapause photopériodique chez A. albopictus est donc une plasticité phénotypique adaptative contrôlée par la mère qui est essentielle pour survivre aux conditions rigoureuses de l’hiver dans les environnements tempérés. Malgré l’importance écologique bien comprise de la diapause photopériodique chez un large éventail d’insectes^20,21, la base moléculaire de cette adaptation cruciale n’est bien caractérisée chez aucun insecte²². Chez des organismes tels que A. albopictus qui subissent une diapause embryonnaire au stade larvaire pharate, il reste un défi particulièrement important de comprendre comment le signal photopériodique reçu par la mère est transmis à la progéniture et persiste au cours du développement embryonnaire pour provoquer l’arrêt au stade larvaire pharate.

Ce protocole décrit l’élevage des moustiques, la conception expérimentale et les analyses bioinformatiques pour les expériences NGS (transcriptome sequencing) réalisées pour élucider les composantes transcriptionnelles de la diapause photopériodique chez A. albopictus. Ce protocole peut être utilisé pour des études supplémentaires sur la diapause chez A. albopictus, peut être adapté pour étudier la diapause chez d’autres espèces étroitement apparentées telles que d’autres moustiques édines qui subissent une diapause^{d’œuf 23}, et est également plus généralement pertinent pour l’utilisation d’approches NGS pour étudier les bases transcriptionnelles de toute adaptation complexe chez n’importe quel insecte.

Protocol

1. élevage de larves de deux A. Groupes albopictus vers l'âge adulte

1. Placer les deux armoires de photopériode avec éclairage programmable à 21 ° C pour l'expression de la diapause optimale ¹⁶ et environ 80% d'humidité relative.
   1. Programme une armoire pour un 16L: la lumière 8D: cycle d'obscurité (un non-diapause induire LD photopériode). Réglez le second cabinet pour un 8L: 16D lumière: cycle d'obscurité (diapause induire) ^13.
   2. «Lumières» du programme en même temps dans les deux armoires pour synchroniser l'heure circadien entre photopériodes.
2. Calculer la quantité d'oeufs nécessaires pour réaliser l'expérience. But pour 300 à 500 œufs par cage. Au moins trois répliquer cages de diapause et trois répliquer cages non-diapause sont nécessaires pour la production d'ARN. Cela donne un total d'environ 1,800-3,000 œufs par expérience.
   1. Hatch les œufs en submergeant les papiers d'œufs dans environ 500 ml de H ₂ O. déminéralisée
   2. Ajouter ca. 1 ml alimentaire coulis composé de nourriture pour chien au sol et les crevettes de saumure comme décrit précédemment ^24. Couvrir le récipient avec la maille, et de garder le maillage en place avec une bande de caoutchouc.
   3. Placez dans le cabinet LD photopériode pendant environ 24 heures.
3. Transfert larves écloses à 10 x 10 x 2 cm boîtes de Petri remplies de ca. 90 ml d'eau désionisée H ₂ O.
   1. Maintenir environ 30 larves par boîte. Transfert larves pour nettoyer tous les plats de 48 à 72 h, par exemple chaque lundi, mercredi et vendredi (MWF) ^24.
   2. RSS environ 1 ml alimentaire coulis composé de nourriture pour chien au sol et les crevettes de saumure dans l'eau déminéralisée chaque MWF comme décrit précédemment ^24.
4. Mettre en place trois à quatre cages d'adultes pour chaque traitement de photopériode, où chaque cage comporte une réplique biologique.
   1. De part et d'autre de 9,5 L seaux, découper un trou de 10 par 14 cm, et un autre trou avec 15 cm de diamètre. CoVer la première avec la maille. Couper environ une longueur de pied d'un chausson orthopédique, et coller une extrémité autour de l'intérieur de l'autre trou.
   2. Couper l'extrémité de pied de la chaussette et le noeud de fermeture - ouvert uniquement lorsque l'accès à l'intérieur de la cage est nécessaire. Pour le couvercle de la cage, couper tous de l'intérieur, ne laissant que la jante, et remplacer le plastique intérieur avec maille ^24.
   3. Notez la photopériode, répliquer nombre, cage date de début, et autres informations pertinentes à l'expérience avec un marqueur permanent sur le côté de la cage.
5. Tapisser le fond des cages adultes avec du papier filtre humide. Humidifiez le papier filtre avec suffisamment déminéralisée H ₂ O pour augmenter l'humidité locale dans la cage, mais il faut éviter l'eau stagnante, qui peut stimuler la ponte sur le papier filtre ^24. Vérifiez le papier de filtre tous les jours pour le séchage, re-humide si nécessaire.
6. Pour produire suffisamment d'ovocytes pour une bibliothèque d'ARN, comprendre au moins 100 femelles / 9,5 L cage, avec pas plus de 500 moustiques par cage.
7. Recueillir pupes MWF et le placer dans une petite tasse de H ₂ O propres à une densité de pas plus de 50 pupes par 25 ml H ₂ O. Transférer la tasse de pupes à une cage d'adulte. La place des cages dans l'armoire de la photopériode respective - A. albopictus pupes sont photosensibles ^15.
8. Assurer quotidienne que H ₂ O dans des gobelets est propre et claire, et retirez pupes morts, parce que l'accumulation de pupes mort peut causer une mortalité massive. Retirer H ₂ O tasses après toutes pupes émergent.
9. Placez raisins organiques sur la maille haut de la cage de fournir sucre pour adultes émergés. Surveiller les raisins secs, et de les changer tous les 3-5 jours pour éviter l'accumulation de moule.

2. Maintien de la adultes pour autoriser accouplement et la production d'oeufs

1. Maintenir cages à une humidité élevée (env. 80%) en alignant le fond de la cage avec un papier filtre humide, et donner accès à des raisins secs non moisis, comme décrit ci-dessus (Sections 1,5 et 1,9).

3. sang maternel

1. Préparez-vous à des femelles de sang-alimentation entre deux à six jours après l'éclosion afin de se assurer que les femmes ont été exposés à au moins huit jours courts sans ambiguïté avant la ponte commence pour près de 100% des oeufs de diapause ^14.
2. Préparez le système d'alimentation Hemotek membrane. Branchez les unités d'alimentation dans l'alimentation. Régler la température de chaque unité à 37 ° C en utilisant la vis de réglage. Utilisez un thermomètre électronique et la sonde pour mesurer la température de l'unité d'alimentation pendant l'étalonnage.
3. Préparer le réservoir de repas. Tendez un carré de membrane de collagène d'alimentation sur l'ouverture du réservoir de repas et le fixer avec un joint torique. Retirez soigneusement les coins pour enlever les rides; couper la membrane avec des ciseaux.
   REMARQUE: membrane de collagène peut ne pas fonctionner bien pour toutes les espèces de moustiques, et il peut être nécessaire d'essayer plusieurs types de trouver la membrane optimale si l'on travaille avec unespèces autres que A. albopictus. Parafilm fonctionne bien avec Culex pipiens.
   1. Si le sang est conservé congelé, décongeler à la température ambiante pendant au moins 1 heure avant de l'utiliser.
   2. Maintenez le réservoir de sorte que la membrane est orientée vers le bas, et les ports de remplissage non pris en charge sont vers le haut. Utiliser une pipette de transfert ou d'une seringue pour remplir le réservoir avec environ 3 ml de sang total provenant de poulets qui a le citrate de sodium comme un anti-coagulant. Sceller orifices de remplissage avec des bouchons en plastique.
4. Fixer le réservoir au dispositif d'alimentation préparé en le vissant sur la tige sur la plaque de transfert de chaleur sur le fond de la mangeoire. Inversez le chargeur et placez-le sur le dessus de la cage, côté de la membrane vers le bas, de sorte que les moustiques peuvent se nourrir à travers les mailles de la cage. Gardez le chargeur sur la cage pendant environ 45 min pour maximiser l'alimentation.

4. Stimuler ponte

1. Quatre à cinq jours après la farine de sang, d'équiper chaque cage avec une couleur foncée 50 ml cjusqu'à recouverte de papier non blanchi de germination des graines (de papier d'oeuf) ou texturé serviette en papier non blanchi et remplir à moitié avec de l'eau déminéralisée ^neuf. Si plus de 250 moustiques sont dans une cage, utilisez deux tasses.
   NOTE: Pour de petites cages ou des flacons seule femelle, «infusion de foin" dans des récipients de ponte peut augmenter la ponte en raison de l'odeur de la flore microbienne ^25.

5. recueillir et stocker des oeufs

1. Commencer la collecte des œufs dans les 4-5 jours d'alimentation de sang parce que la production d'œufs généralement des pics d'environ cinq jours après le repas de sang, puis se apaise la semaine prochaine.
2. Variez oeuf fréquence de la collecte sur les nécessités de l'expérience. À des fins générales, recueillir des documents d'oeufs sur un calendrier de MWF. Retirer les papiers d'œufs de chaque cage et le remplacer par du papier neuf. Placez articles récemment enlevés dans des boîtes de Pétri et magasin en SD photopériode armoire pour éviter les effets de confusion de stockage des œufs.
3. Permettre aux documents d'œufs de re principale humide pendant 2 jours post-ponte pour permettre la formation séreuse cuticule, ce qui augmente la résistance à la dessiccation des œufs ^26.
4. Après le prélèvement d'environ 48 h, oeufs secs en plein air. Sécher le papier tel qu'il est mou et légèrement humide au toucher, mais pas si humide que le papier est sombre à partir de H ₂ O ou stimule l'éclosion des oeufs.
   NOTE: A 6.5 "x 4" papier peut prendre environ 3,5 heures pour sécher. Soyez prudent de ne pas trop sèche documents d'œufs, que cela se traduira dans l'œuf la dessiccation ^27.
5. Réserve oeufs supplémentaires à la fois LD et SD photopériodes pour évaluer l'incidence de la diapause et interprètent l'effet photopériodique (voir Mesure diapause, section 6).
6. Pour le stockage à long terme, conserver ses documents d'oeuf à 21 ° C et environ 80% d'humidité dans des boîtes de Pétri. Gardez boîtes de Petri dans un conteneur de stockage Tupperware avec un flacon d'eau pour maintenir l'humidité locale que le développement embryonnaire prend de quatre à cinq jours à 21 ° C.

ove_title "> 6. Mesurer diapause Incidence

1. Utiliser des embryons réservés supplémentaires (voir Stimuler ponte, section 4) qui sont 7-20 jours vieux pour quantifier la réponse de diapause.
2. Enregistrez le nombre d'œufs présents sur chaque papier oeuf.
3. Stimuler les œufs à éclore en immergeant complètement papiers d'œufs individuels dans un plat 90 ml Petri avec environ 80 ml ​​de H ₂ O. déminéralisée Ajouter environ 0,25 ml alimentaire suspension.
4. Après 24 h compter le nombre de hachurée larves de premier stade. Placez la boîte de Petri sur une surface noire de visualiser larves et placer une source de lumière sur un côté du plat. Les larves se éloigner de la source de lumière, ce qui permet un décompte clair des larves individu. Retirer larves individuelle avec une pipette en comptant pour empêcher racontant larves individu.
5. Lieu documents d'œufs dans une nouvelle boîte de Pétri et re-sèche. Re-oeufs éclosent après ~ 1 semaine et encore concordent œufs éclos en utilisant la méthode ci-dessus.
6. Lieu documents d'œufs avec le reste u n oeufs éclos dans de nouvelles boîtes de Pétri de 90 ml avec une solution de blanchiment d'environ 80 ml ^​​28. Veiller à ce que les documents d'œufs sont complètement immergés dans la solution de blanchiment et laissent sous une nuit de la hotte pour éviter l'odeur d'eau de Javel.
   REMARQUE: solution de blanchiment peut être stocké pendant ~ 1 semaine à 4 ° C, mais devrait par ailleurs fait frais.
7. Inspectez oeufs en utilisant un microscope optique que le blanchiment va effacer le chorion et permettre la visualisation des oeufs embryonnés, non éclos. Si l'oeuf est embryonnés, l'œuf aura une couleur blanc cassé avec des yeux qui apparaissent comme deux petits points noirs en face de l'autre sur la face dorsale. Compter le nombre de non éclos, ¹³ œufs embryonnés.
8. Déterminer l'incidence de la diapause à la formule suivante:% = pas de diapause. œufs embryonnés non éclos / (pas. oeufs éclos + pas. oeufs non éclos embryonnés) x 100 ^13.

7. Extraction de l'ARN à partir d'oeufs / larves pharate

ontenu "> NOTE: Utiliser Trizol dans une hotte à flux laminaire.

1. Brush oeufs de moustiques contenant des embryons en développement ou des larves pharate à des moments distincts de développement à partir de papiers d'œufs des broyeurs de verre à l'aide d'une brosse en poils de chameau. Broyer les œufs dans Trizol (1 ml par 50 à 100 mg de tissu) jusqu'à ce que complètement pulvérisé. Utilisez au moins 400 oeufs par bibliothèque pour obtenir l'ARN est suffisante.
   1. Alternativement, casser les oeufs de congélation dans l'azote liquide et conservés à -80 ° C dans des tubes à centrifuger jusqu'à un mois avant broyage dans Trizol.
2. Effectuer l'extraction de l'ARN dans Trizol suivie par précipitation à l'isopropanol selon les instructions du fabricant.
3. Traiter le banc avec une solution RNase de décontamination ou d'autres agents pour enlever les nucléases résiduels pour éviter la dégradation de l'ARN.
   1. Traiter l'ARN extrait à la DNase. Selon les instructions du fabricant, incuber les échantillons d'ARN avec de l'ADNase pendant 30 min à 37 ° C. Utilisez une & #181; l DNase à hauteur de 10 pg d'ARN dans une réaction de 50 ul. Augmenter la quantité de DNase se il ya plus de 10 pg d'ARN dans une réaction.
   2. Inactiver la DNase en ajoutant 5 pi DNase suspendu réactif d'inactivation. Incuber 5 min à température ambiante, le mélange trois fois au cours de la période d'incubation (de vortex douce).
   3. Centrifuger à 10 000 g pendant 1,5 min. Transférer le surnageant contenant les échantillons d'ARN traités dans des tubes frais pour les étapes ultérieures.
4. Évaluer la qualité des échantillons d'ARN totaux par fluorométrie. Envoyer les échantillons à un centre de spécialité avec un instrument approprié pour cette tâche. L'installation se produira électrophorèse sur gel sur puce pour déterminer les tailles des espèces d'ARN dans l'échantillon, visualisées par colorant fluorescent instillé dans la puce. Les résultats seront retournés comme un électrophérogramme.
   1. Déterminer l'intégrité des échantillons d'ARN totaux par la présence ou l'absence de produits de dégradation, comme en témoigne la présence of crêtes entre les ribosomiques 18S et 5S pics d'ARN sur l'électrophorégramme obtenu (figure 1b).

8. ARN Séquençage

1. Envoyer des échantillons d'ARN totaux avec une qualité suffisante (figure 1A) et la quantité (en général> 3 ug par bibliothèque) vers un centre de séquençage commercial pour la construction de bibliothèques enrichies couplé de fin d'ARNm et des séquences d'ARNm, à la suite des protocoles standard.
2. Si plus d'une voie est utilisée pour le séquençage d'une seule expérience, des bibliothèques individuelles divisé en deux voies pour le séquençage de tenir compte des variations technique entre voies au cours du séquençage.

9. lllumina Lire nettoyage

REMARQUE: La figure 2 résume la partie de bioinformatique de ce protocole. Pour une liste complète de tous les programmes et les ressources utilisées dans la section de bioinformatique de ce protocole, se reporter au tableau 1. EnDe plus, Fichier supplémentaire 1 contient des exemples de ligne de commande pour chacune des étapes de la bioinformatique protocole suivantes.

1. Utilisation ssaha2 ²⁹ (tableau 1) afin d'identifier les matches de 95% d'identité ou plus à la base de données NCBI Univec de base (tableau 1), A. albopictus séquence d'ARN (GenBank # de L22060.1), et les adaptateurs de séquençage (exemples détaillés de ligne de commande fournis dans Fichier supplémentaire 1). Retirer paires lecture avec des allumettes en Perl ou un outil de script similaire, par exemple en adaptant le script Perl fourni (Fichier supplémentaire 2).
2. Clean restante lit avec le paquet SolexaQA ³⁰ (tableau 1; supplémentaire Fichier 1): couper régions avec un score phred équivalent de moins de 20 en utilisant les paramètres par défaut de DynamicTrim.pl.
   1. Retirer lit plus courte de 25 pb avec LengthSort.pl à la fois avant et arrière lit simultanément. Évaluer la qualité des fichiers nettoyés fastq avec FastQC (tableau 1 ) - en particulier, de vérifier que la qualité par-séquence de base et les scores de qualité par séquence ci-dessus sont 20.

10. Normalisation numérique

1. Effectuer un tour de normalisation numérique sur le lit nettoyé en utilisant l'outil khmer ³¹ (tableau 1; supplémentaire Fichier 1), spécifiquement normalize-by-median.py (en utilisant la taille k-mer 20, une couverture de coupure de 20, et x = 1E10).
2. Alternativement, si une machine à haute RAM est disponible (des centaines de Go), utiliser le script de normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinity (tableau 1).

11. De Novo Assemblée transcriptome

1. Obtenir l'accès à une grappe d'ordinateurs ou d'un ordinateur avec un maximum de 256 Gb de RAM et CPU 24, en fonction de la taille de l'ensemble.
2. Utilisez Trinity ³² (tableau 1; Fichier supplémentaire 1) pour assembler la lecture numérique normalisé mis en contigs. Pour réduireutilisation de la mémoire, utilisez --min_kmer_cov 2.

Évaluation 12. Assemblée

1. Exécutez assemblathon_stats.pl du projet Assemblathon2 ³³ sur la sortie contiguë Trinité. Ce script effectue des calculs de base utiles pour évaluer la qualité d'assemblage, comme le nombre d'échafaudages, N50, la composition de l'ensemble, et plus (tableau 1; 1 fichier supplémentaire).

13. Annotation du transcriptome assemblé

1. Effectuer Blastx (tableau 1) de l'ensemble d'un ensemble de protéines de référence; pour les moustiques, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, Aedes aegypti et sont des références appropriées. Plus précisément, formater le fichier fasta de protéine de référence pour explosion, suivie par blastx (Fichier supplémentaire 1).

14. Carte Lit à l'Assemblée Utilisation RSEM ³⁴ (tableau 1)

1. Créez un fichier 'à la transcription du gène carte », dans lequel lepremière colonne contient les ID de gènes de référence, et la deuxième colonne les ID contigs. Dans un éditeur de feuille de calcul, échanger les première et deuxième colonnes de la sortie Blastx, et écrire ces colonnes dans un fichier .txt. Utilisez le programme de LineBreak pour convertir les sauts de ligne dans le fichier .txt résultant au format Unix.
2. Créer un ensemble de données de référence à partir du fichier fasta transcriptome utilisant le script RSEM-préparer-référence, fourni dans le paquet de RSEM (Fichier supplémentaire 1).
3. Calculer les valeurs d'expression séparément pour chaque bibliothèque en utilisant la commande RSEM-calculer l'expression, fourni dans le paquet de RSEM (Fichier supplémentaire 1). Comme lit, utiliser les fichiers appariés fastq résultant de l'étape de lecture de nettoyage (étape 9.2).
   1. Si l'ARN à partir d'une répétition biologique a été divisé en deux voies pour le séquençage, inclure les deux fichiers fastq dans le calcul d'expression pour générer un fichier unique.
4. Convertir les résultats d'expression de chaque bibliothèque à une matrice facilement traitées par d'autres pPROGRAMMES utilisant le script RSEM-générer-data-matrice, fournis dans le package de RSEM (Fichier supplémentaire 1).

15. Analyse de l'expression différentielle

1. Installez R et déligneuse (tableau 1).
2. Utilisez read.delim pour charger les résultats de l'étape de RSEM 14,3 (Fichier supplémentaire 1). Si nécessaire, arrondir les chiffres à l'entier le plus proche.
   NOTE: Le guide recommande de limiter Edger l'ensemble de données à des gènes avec suffisamment forte expression pour détecter importance.
3. Pour formater les données pour déligneuse, générer un objet DGEList à partir du fichier de données chargées (Fichier supplémentaire 1). Puis, normaliser les données à l'aide TMM normalisation (Fichier supplémentaire 1). Estimer les dispersions communs et tagwise des données (fichier supplémentaire 1).
4. Identifier les gènes exprimés de manière différentielle avec un Benjamini-Hochberg corrigé valeur p <0,05 (Fichier supplémentaire 1). Tracer la distribution de fois le changement de log-contre abondance (Fichier supplémentaire 1).

Results

Fluorimétrie de deux échantillons représentatifs d'ARN a montré deux bandes à environ 2000 nt (figure 1A, B). Le 28S de l'ARN ribosomique insectes est composé de deux chaînes polynucléotidiques maintenues ensemble par des liaisons hydrogène, qui sont facilement perturbés par un bref chauffage ou des agents qui perturbent les liaisons hydrogène ^35. Les deux composantes obtenues sont approximativement de la même taille que l'ARN ribosomal 18S. Le second échantillon d'ARN a montré des niveaux él...

Discussion

Ce protocole présente des méthodes pour découvrir des gènes exprimés de manière différentielle en raison de photopériodiquement diapause induite dans A. albopictus. Le protocole est importante en ce qu'elle combine de façon unique moustiques élevage et des techniques bioinformatiques pour faire tous les aspects expérimentaux d'un programme de physiologie moléculaire accessible aux utilisateurs novices - en particulier pour ceux qui se concentrent sur la réponse de diapause photopériodique. Les méthodes ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubateur - Modèle 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Salle à environnement contrôlé	Thermax Scientific	N/A	Chambre à environnement contrôlé construite selon les spécifications personnalisées par Produits Thermax Scientific. Une alternative plus grande à un incubateur.
Ampoule fluorescente http://thermmax.com/ Cool	Philips	392183	4 W
Boîte de Pétri 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Papier filtre 20,5 cm	Fisher	09-803-6J
Seau de 9,5 L	Plastican	Bway Produits	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utilitaire Tissu-Moustiquaire Blanc	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Bas orthopédiques	Albahealth	23650-040	réf. 081420
Raisins secs biologiques	Newman’s Own	UPC : 884284040255
Gobelets de ponte (marron)	Fisher Scientific	03-007-52	Le produit est en fait une bouteille ambrée de 125 ml dont nous avons vu le remplissage.
Essuie-tout en papier recyclé	Septième génération	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Moulin à verre	Corning Incorporated	7727-2	Ces broyeurs de tissus Tenbroeck cassent les œufs et libèrent de l’ARN dans le réactif TRI.
Réactif TRI	Sigma Aldrich	T9424	Appliquer 1 ml de réactif TRI pour 50 à 100 mg de tissu. Mise en garde — ; Ce réactif est toxique.
TURBO sans ADN	Ambion/Life Technologies	AM1907	Ce kit génère un rendement supérieur à celui du traitement traditionnel à la DNase suivi d’un nettoyage au phénol/chloroforme, et il est plus simple à utiliser.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Appliquer généreusement sur les surfaces de la paillasse et tout équipement susceptible d’être en contact avec les échantillons d’ARN. La solution est légèrement alcaline/corrosive, peut provoquer une irritation et est nocive en cas d’ingestion.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Placez jusqu’à 12 échantillons d’ARN sur une seule puce.
Hemotek Alimentateur à Membrane	Hemotek  ;	5W1	Ce système fournit 5 stations d’alimentation qui peuvent être utilisées simultanément. Comprend une unité d’alimentation PS5 et un cordon d’alimentation ; 5 doseurs FUI + réservoirs de farine et joints toriques ; Bouchons en plastique, membrane d’alimentation en collagène Hemotek ; Outil de réglage de la température ; et outil d’extraction de bouchons. L’adresse postale de l’entreprise est la suivante : Hemotek Ltd ; Unité 5 Tribunal de l’Union ; Alan Ramsbottom Way ; Grand Harwood ; Lancashire, Royaume-Uni ; BB6 7FD ; Tél. : +44 1254 889 307.
Thermomètre numérique et sonde	Hemotek  ;	Thermomètre MT3KFU	MicroT3 et sonde KFU. Ceci est utilisé pour régler la température de chaque unité d’alimentation FUI.
Sang total de poulet, non stérile avec du citrate de sodium	Pel-Freez Biologicals	33130-1	Les 500 ml de sang ont été congelés et stockés dans des aliquotes de 20 ml à -80 ° ; C jusqu’à 1 an. Décongeler le sang à température ambiante pendant au moins 1 heure avant de l’utiliser.