Un protocole expérimental et de la bioinformatique pour les analyses d'ARN-Seq de la photopériode diapause dans le Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Résumé

Les analyses

RNA-Seq deviennent de plus en plus importantes pour identifier les fondements moléculaires des traits adaptatifs dans les organismes non modèles. Ici, un protocole permettant d’identifier les gènes exprimés de manière différentielle entre les moustiques Aedes albopictus diapause et non diapause est décrit, de l’élevage des moustiques au séquençage de l’ARN et aux analyses bioinformatiques des données RNA-Seq.

Résumé

La diapause photopériodique est une adaptation importante qui permet aux individus d’échapper à des environnements saisonniers difficiles via une série de changements physiologiques, notamment l’arrêt du développement et la réduction du métabolisme. Le profilage global de l’expression génique via RNA-Seq peut fournir des informations importantes sur les mécanismes transcriptionnels de la diapause photopériodique. Le moustique tigre asiatique, Aedes albopictus, est un organisme exceptionnel pour l’étude des bases transcriptionnelles de la diapause en raison de sa facilité d’élevage, de sa diapause facilement induite et des ressources génomiques disponibles. Ce manuscrit présente un flux de travail expérimental général pour identifier les différences transcriptionnelles induites par la diapause chez A. albopictus. Les techniques d’élevage, les conditions nécessaires pour induire le développement de la diapause et de la non-diapause, les méthodes d’estimation du pourcentage de diapause dans une population, ainsi que l’extraction de l’ARN et l’évaluation de l’intégrité des moustiques sont documentées. Un flux de travail pour traiter les données de séquençage de l’ARN des séquenceurs Illumina aboutit à une liste de gènes exprimés de manière différentielle. Les résultats représentatifs démontrent que ce protocole peut être utilisé pour identifier efficacement les gènes régulés différentiellement au niveau transcriptionnel chez A. albopictus en raison de différences photopériodiques. Avec des ajustements modestes, ce flux de travail peut être facilement adapté pour étudier les bases transcriptionnelles de la diapause ou d’autres traits importants de l’histoire de la vie chez d’autres moustiques.

Introduction

Les progrès rapides des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) offrent des opportunités passionnantes pour sonder les fondements moléculaires d’un large éventail d’adaptations écologiques génétiquement complexes dans une grande diversité d’organismes non modèles^{1 à 3}. Cette approche est extrêmement puissante car elle établit une base pour les études de génomique des populations et fonctionnelles d’organismes ayant une écologie ou une histoire évolutive particulièrement intéressante et/ou bien décrite, ainsi que d’organismes préoccupants dans la pratique, tels que les ravageurs agricoles et les vecteurs de maladies. Ain....

Protocole

1. élevage de larves de deux A. Groupes albopictus vers l'âge adulte

1. Placer les deux armoires de photopériode avec éclairage programmable à 21 ° C pour l'expression de la diapause optimale ¹⁶ et environ 80% d'humidité relative.
   1. Programme une armoire pour un 16L: la lumière 8D: cycle d'obscurité (un non-diapause induire LD photopériode). Réglez le second cabinet pour un 8L: 16D lumière: cycle d'obscurité (diapause induire) ^13.
   2. «Lumières» du programme en même temps dans les deux armoires pour synchroniser l'heure circadien entre photopériodes.
2. Calculer la q....

Résultats

Fluorimétrie de deux échantillons représentatifs d'ARN a montré deux bandes à environ 2000 nt (figure 1A, B). Le 28S de l'ARN ribosomique insectes est composé de deux chaînes polynucléotidiques maintenues ensemble par des liaisons hydrogène, qui sont facilement perturbés par un bref chauffage ou des agents qui perturbent les liaisons hydrogène ^35. Les deux composantes obtenues sont approximativement de la même taille que l'ARN ribosomal 18S. Le second échantillon d'ARN a montré des niveaux él.......

Discussion

Ce protocole présente des méthodes pour découvrir des gènes exprimés de manière différentielle en raison de photopériodiquement diapause induite dans A. albopictus. Le protocole est importante en ce qu'elle combine de façon unique moustiques élevage et des techniques bioinformatiques pour faire tous les aspects expérimentaux d'un programme de physiologie moléculaire accessible aux utilisateurs novices - en particulier pour ceux qui se concentrent sur la réponse de diapause photopériodique. Les méthodes .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Incubateur - Modèle 818	Thermo-Scientific	3751	120 V
Salle à environnement contrôlé	Thermax Scientific	N/A	Chambre à environnement contrôlé construite selon les spécifications personnalisées par Produits Thermax Scientific. Une alternative plus grande à un incubateur.
Ampoule fluorescente http://thermmax.com/ Cool	Philips	392183	4 W
Boîte de Pétri 100 mm x 20 mm	Fisher	08-772-E
Papier filtre 20,5 cm	Fisher	09-803-6J
Seau de 9,5 L	Plastican	Bway Produits	http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Utilitaire Tissu-Moustiquaire Blanc	Joann	10173292	http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html
Bas orthopédiques	Albahealth	23650-040	réf. 081420
Raisins secs biologiques	Newman’s Own	UPC : 884284040255
Gobelets de ponte (marron)	Fisher Scientific	03-007-52	Le produit est en fait une bouteille ambrée de 125 ml dont nous avons vu le remplissage.
Essuie-tout en papier recyclé	Septième génération	30BPT120
Modular Mates Square Tupperware Set	Tupperware		http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Moulin à verre	Corning Incorporated	7727-2	Ces broyeurs de tissus Tenbroeck cassent les œufs et libèrent de l’ARN dans le réactif TRI.
Réactif TRI	Sigma Aldrich	T9424	Appliquer 1 ml de réactif TRI pour 50 à 100 mg de tissu. Mise en garde — ; Ce réactif est toxique.
TURBO sans ADN	Ambion/Life Technologies	AM1907	Ce kit génère un rendement supérieur à celui du traitement traditionnel à la DNase suivi d’un nettoyage au phénol/chloroforme, et il est plus simple à utiliser.
RNaseZap	Ambion/Life Technologies	AM9782	Appliquer généreusement sur les surfaces de la paillasse et tout équipement susceptible d’être en contact avec les échantillons d’ARN. La solution est légèrement alcaline/corrosive, peut provoquer une irritation et est nocive en cas d’ingestion.
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA	Placez jusqu’à 12 échantillons d’ARN sur une seule puce.
Hemotek Alimentateur à Membrane	Hemotek  ;	5W1	Ce système fournit 5 stations d’alimentation qui peuvent être utilisées simultanément. Comprend une unité d’alimentation PS5 et un cordon d’alimentation ; 5 doseurs FUI + réservoirs de farine et joints toriques ; Bouchons en plastique, membrane d’alimentation en collagène Hemotek ; Outil de réglage de la température ; et outil d’extraction de bouchons. L’adresse postale de l’entreprise est la suivante : Hemotek Ltd ; Unité 5 Tribunal de l’Union ; Alan Ramsbottom Way ; Grand Harwood ; Lancashire, Royaume-Uni ; BB6 7FD ; Tél. : +44 1254 889 307.
Thermomètre numérique et sonde	Hemotek  ;	Thermomètre MT3KFU	MicroT3 et sonde KFU. Ceci est utilisé pour régler la température de chaque unité d’alimentation FUI.
Sang total de poulet, non stérile avec du citrate de sodium	Pel-Freez Biologicals	33130-1	Les 500 ml de sang ont été congelés et stockés dans des aliquotes de 20 ml à -80 ° ; C jusqu’à 1 an. Décongeler le sang à température ambiante pendant au moins 1 heure avant de l’utiliser.