Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

Summary

Nous présentons une méthode pour appliquer un champ électrique physiologique à des cellules prostatiques migratrices et immortalisées dans une chambre de galvanotaxie sur mesure. En utilisant cette méthode, nous démontrons que 2 lignées de cellules prostatiques non tumorigènes présentent différents degrés de directionnalité de migration sur le terrain.

Abstract

Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, telles que diriger la migration des cellules dans le développement embryonnaire, l'excroissance neuronale et la cicatrisation epitheliale. L'application d'un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées in vitro induit la migration des cellules directionnel, ou galvanotaxie. Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est modifiée avec sur mesure poly (chlorure de vinyle) (PVC) chambres, la surface de verre, des électrodes en platine et l'utilisation d'une platine motorisée à laquelle les cellules sont imagés. Les chambres de PVC et des électrodes de platine présentent une faible cytotoxicité et sont abordables et ré-utilisable. La surface du verre et la platine du microscope motorisée améliorer la qualité des images et permettent d'éventuelles modifications de la surface du verre et des traitements aux cellules. Nous avons filmé l'galvanotaxie de deux, les lignées cellulaires non-tumorigènes SV40 immortalisé la prostate, PRNS-1-1 et PNT2. Ces deux lignées cellulaires montrent des vitesses de migration à la fois similaires et migrent versla cathode, mais ils montrent un degré différent de directivité dans galvanotaxie. Les résultats obtenus par l'intermédiaire de ce protocole suggérer que les PRNS-1-1 et les lignées cellulaires PNT2 peuvent avoir des caractéristiques intrinsèques qui régissent leurs réponses migrateurs directionnelles.

Introduction

Les champs électriques endogènes sont détectés dans divers tissus tels que la peau, ^{1, 32, 33} et ^deux cerveau. Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, y compris diriger le développement des embryons ^{3, 4,} le guidage du prolongement de processus neuronaux ^{5, 6} et la promotion de l'épithélium et la cornée plaie fermeture ^{1, 7.} In vitro, l'application d'un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées imite le champ électrique physiologique et induit la migration cellulaire directionnelle ou galvanotaxie. Galvanotaxie a été étudié dans des fibroblastes, des kératinocytes ^{8 9} de poisson, épithélial humain et les kératinocytes de la cornée ^{10 à 12,} les lymphocytes ^{13, deux} neuroblastes et les cellules progénitrices neuronales ^14. Lorsqu'il est exposé au champ appliqué, la majorité des cellules étudiées migrer de manière directionnelle vers l'cathodique pôle (-). Cependant, plusieurs cellules cancéreuses, y compris hautement métastatiquecellules de cancer du sein humain et la lignée cellulaire de cancer de la prostate humain PC-3M, se déplacent vers le anodique pôle (+) ^{15, 16.} Plusieurs mécanismes sont proposés à médiation galvanotaxie ou pour expliquer la capacité des cellules à détecter le champ électrique, y compris l'activation récepteurs de l'EGF ^12, le canal sodique épithélial ^17, PI3K et PTEN ^18, et la libération des ions calcium ^{15, 19.} Le mécanisme ne est pas encore entièrement compris et il est possible que de multiples voies de signalisation sont impliqués dans galvanotaxie.

Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est utile pour caractériser la migration directionnelle de adhérente, cellules mobiles, que ce soit pour surveiller la migration individuelle des cellules ^{10, 12, 17} ou la migration d'une feuille de cellules confluentes ^{18, 20.} Cette technique est modifiée à partir de Peng et Jaffe ²¹ et Nishimura et al., avec ¹⁰ chambres de PVC transparent sur ​​mesure, avec coversl amovibleips permettant l'extraction de cellules facile après galvanotaxie pour analyse secondaire, telles que l'imagerie immuno-fluorescence. La surface de verre des chambres de galvanotaxie est optique compatible, ce qui permet le tournage à fort grossissement et avec des cellules marquées par fluorescence. Il permet également la conception expérimentale avec modification de la surface du verre, par exemple modifier le revêtement ou la surface des charges. Entretoise en une lamelle n ° sont utilisés dans les chambres afin de minimiser le flux de courant dans les cellules; par conséquent, le chauffage par effet Joule, qui est proportionnelle au carré du flux de courant, ne serait pas surchauffer les cellules pendant l'expérience. Les ponts de liaison de gélose empêchent le contact direct des électrodes avec les cellules et empêchent le changement de pH du milieu ou de la concentration d'ions pendant galvanotaxie.

Deux lignes non-tumorigènes cellulaires prostate humaine ont été examinés pour leur réponse galvanotaxie dans cette étude. Les PRNS-1-1 ²² et ²³ sont à la fois PNT2 SV40 à immortalisation, les lignées cellulaires dépendantes de facteurs de croissance exprimant des marqueurs épithéliaux cytokératine 5, 8, 18 et 19 avec peu ou pas d'expression de l'antigène spécifique de la prostate (PSA). Les deux lignées cellulaires conservent la morphologie polygonale de cellules épithéliales normales, mais anomalie chromosomique a été observée dans le caryotype ^{22, 24.} Bien que PRN-1-1 et PNT2 part des comportements similaires dans la plupart des expériences, elles montrent des différences dans la formation de la structure et dans acineuses galvanotaxie. Sur une matrice 3-D, Matrigel, les cellules PRN-1-1 former des structures creuses avec des lumières acineuses ressemblant à la glande prostatique normale ²⁵ tissu. Cependant, les cellules forment des sphéroïdes solides PNT2 sans une lumière polarisée ou ²⁶ épithélium. Les cellules PRN-1-1 démontrent également une réponse plus élevée que la galvanotactic PNT2 dans la présente étude. La corrélation entre la formation de la structure acinaire et galvanotaxie dans PRNS-1-1 suggère que les signaux galvanotactic peuvent jouer un rôle dans l'organisation de la prles mouvements des tissus de la glande ostate en réponse à des champs électriques endogènes et fournit d'autres caractéristiques de discriminer entre ces deux lignées cellulaires.

Protocol

1. Culture de cellules de la prostate

1. Culture les PRNS-1-1 et PNT2 prostate cellules sur des boîtes de 100 mm de la culture dans un milieu RPMI 1640 complété avec 10% de FBS et antibiotiques antimycosique à 37 ° C avec 5% de CO _2. Actualiser le milieu de culture tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence pour les expériences de galvanotaxie.

2. Assemblage galvanotaxie Chambers

1. Assemblage chambres inférieures
   1. Essuyer une chambre de galvanotaxie plastique avec du 2-propanol. Appliquer le scellant de silicium de qualité marine autour des ouvertures circulaires sur la face inférieure d'une chambre avec une seringue et attacher une grande lamelle (figure 1). Utilisez le côté arrière d'un applicateur de coton pour faire baisser la lamelle et essuyez l'excès de colle avec des cotons-tiges. Les ouvertures circulaires permettent au milieu et le courant électrique à se écouler sur les cellules se trouvant entre les deux réservoirs intérieurs moyennes.
   2. Couper une petite lamelle de faire 6 mm x 25 mm entretoises avec un marqueur de pointe de diamant.
   3. Retournez la chambre. Appliquer deux bandes de colle de silicium avec une seringue et / ou une spatule en métal pour créer une surface de canal de 25 mm x 10 mm pour la fixation des cellules entre les deux ouvertures circulaires sur la vitre inférieure. Coller deux morceaux de verre entretoise entre les deux ouvertures circulaires. Utilisez le côté arrière des applicateurs de coton pour faire baisser les entretoises et essuyez l'excès de colle avec des tampons et / ou des cure-dents coton.
   4. Séchez la chambre pendant 24 heures jusqu'à ce que la colle de silicium est guéri. Faire tremper pendant une nuit dans la chambre de l'eau distillée pour éliminer le résidu de l'acide acétique à partir de la colle. Séchez la chambre pour une utilisation immédiate, ou de stocker la chambre pour une utilisation ultérieure dans un récipient propre.
      
      Figure 1: Assemblée de la chambre du fond. A) Une grande lamelle est fixé sur le fond d'une chambre propre. B) TDeux morceaux de cales de verre sont collées entre les deux ouvertures circulaires pour créer un canal x 25 mm 10 mm pour cellules de se fixer.
2. Ensemencement de cellules sur les chambres à galvanotaxie
   1. Préparer le nombre de chambres de nécessiter galvanotaxie nécessaires pour l'expérience. Chaque ligne ou cellule de traitement nécessite une chambre de galvanotaxie unique. Essuyer les chambres de galvanotaxie avec du 2-propanol. Laver les chambres stériles avec PBS trois fois et vérifier l'écoulement de liquide entre les deux ouvertures circulaires dans les chambres.
   2. Joindre les chambres dans des boîtes de culture de cellules stériles et les laisser se équilibrer à 37 ° C pendant 15 min. Détacher les cellules de la prostate à partir de leur boîte de culture de 5 ml en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Neutraliser la trypsine-EDTA avec 5 ml de 10% de FBS dans du PBS.
   3. Transférer les cellules pour tubes de 15 ml et centrifuger les cellules pendant 5 min à 200 x g, 37 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture.
   4. Prenez 20 μl de solution de cellule de charge à une chambre de comptage et calculer le nombre de cellules. Ajuster la concentration cellulaire à 8 x 10 ⁴ cellules / ml avec du milieu de culture.
   5. Prenez les chambres de galvanotaxie de la 37 ° C incubateur. Ensemencer 350 ul de la suspension cellulaire sur chaque chambre.
   6. Incuber les cellules pendant une nuit dans les chambres dans la boîte de culture avec Kimwipe ou humide dans une chambre d'humidité à l'étuve à 37 ° C avec 5% de CO _2.

Figure 2:. Ensemencement des cellules à la chambre La chambre inférieure est séché et nettoyé cellules A) de la prostate sont trypsinisées, comptées et transférés dans la chambre et incubées pendant une nuit B) Une lamelle supérieure est fixée à étanchéité de la chambre avant le tournage...

3. Unssembling les meilleurs chambres
   1. Assemblez la chambre supérieure avant le tournage. Le microscope ne peut accueillir l'imagerie d'une chambre de galvanotaxie seul à la fois. Réchauffez-vous 10 ml de milieu de culture à 37 ° C pour chaque chambre de galvanotaxie. Transférer une chambre de galvanotaxie des incubateurs à une plaque C de réchauffement de 37 °.
   2. Rincer les cellules avec un milieu de culture pour éliminer les cellules seules. Donner 400 pi de milieu dans la chambre. Utilisez une seringue pour appliquer de la graisse à vide élevé au-dessus de deux cales de verre.
   3. Ajouter une petite lamelle pour sceller la chambre. Appuyez doucement la lamelle avec le côté arrière d'un applicateur de coton. Essuyez l'excès du milieu avec des cotons-tiges.
   4. Séchez la surface de verre et appliquer de la graisse à vide élevé pour sceller l'écart entre la lamelle et la chambre. Utiliser une spatule en métal pour répartir la graisse. Ajouter 4 ml du milieu de culture pour les réservoirs intérieurs et vérifier l'écoulement de liquide entre les réservoirs.
4. Assurez-agarponts
   1. Couper une paire de long tuyau de PVC de 2 pouces (503/16 ID x 5/16 x 1/16 OD mur), flip et les insérer dans un bécher de 100 ml.
   2. Mesurer 200 mg de Bacto-Agar et l'ajouter à un ballon de 50 ml avec 10 ml de milieu de culture pour faire gel d'agar à 2%. Micro-ondes pendant 30 secondes. Chargez le gel d'agar à la tubulure en plastique avec une pipette de transfert. Laissez les ponts de gélose à la température ambiante pendant 10 minutes pour solidifier la gélose.
   3. Ajouter 2 ml de milieu de culture dans les réservoirs extérieurs de la chambre de galvanotaxie. Insérer les ponts de gélose au milieu des réservoirs intérieur et extérieur pour conduire le courant.

Figure 3:. Lieux les cellules de la chambre de mettre en évidence un schéma de l'assemblage final de la chambre de galvanotaxie. La chambre est complètement scellé avec de la graisse à vide élevé. Medium est t ajoutéo remplir les réservoirs, et deux ponts d'agar sont insérés dans la chambre. Ensuite, la chambre de galvanotaxie est transféré vers la platine du microscope et les électrodes sont fixées à appliquer le champ électrique. Vue latérale de la chambre de galvanotaxie assemblé est illustré pour démontrer que le courant électrique circule dans les cellules à travers les ponts de gélose et l'espace entre le verre de protection.

3. imagerie time-lapse

1. Mettre en marche l'enceinte climatique à 37 ° C avec 5% de CO ₂ dans l'air circulant deux heures avant l'imagerie.
2. Allumez le microscope et lancer le logiciel d'image-acquisition. Calibrer la platine du microscope et sélectionnez l'objectif 10X.
3. Transférez les chambres de galvanotaxie à la platine du microscope, sécuriser la chambre avec du ruban adhésif et de se concentrer sur les cellules. Insérer les électrodes du galvanotaxie aux réservoirs extérieurs à cathode sur le côté droit. Fixez le fil et les électrodes avec du ruban adhésif.
4. Allumez le bo de puissancex pour appliquer un champ électrique dans la chambre. Mesurer la tension de sortie avec le voltmètre à travers la chambre pour atteindre 2,5 volt pour la longue chambre 25 mm (100 mV / mm). Maintenir l'intensité du champ au cours de l'expérience en ajustant le courant de sortie.
5. Sélectionnez 10 points à travers la chambre de filmer dans le logiciel pour générer des dix films time-lapse. Mettre en place les conditions d'acquisition à intervalles de 10 min pendant 2 heures.
6. Commencer à filmer et ajuster le courant de sortie en fonction des besoins.
7. A la fin de l'expérience, retirer la chambre de la scène et fixer les cellules avec 95% d'alcool. Casser la chambre avec une lame de rasoir pour nettoyer et re-utiliser.

4. Quantification des galvanotaxie

1. Faites tourner les films de time-lapse et réorienter la cathode vers le haut des images. Exporter les films sur le logiciel de suivi de la cellule.
2. Suivre manuellement le (x, y) de 10 à 20 cellules à chaque point de temps de chaque film (Figure 4 A, B).Les distances de migration et les angles par rapport à la direction nord-sud, la même orientation du champ électrique, seront calculées dans le logiciel de suivi de la cellule (figure 4C).
   NOTE: La vitesse moyenne de migration est converti de la distance de migration totale et le temps de tournage totale. La directivité est converti à partir des angles par rapport à la valeur du cosinus. Si les cellules migrent avec directivité aléatoire, la moyenne des cosinus net sera proche de zéro. Si les cellules migrent directement vers la cathode, la valeur de cosinus sera une. Si les cellules migrer directement vers l'anode, la valeur de cosinus sera -1.

Figure 4: Suivi de la cellule à mesurer directivité A) Superposition des lignes de repérage des images de cellules.. Les positions (x, y) des cellules sont manually suivis dans les films time-lapse. . Si les cellules migrent de façon aléatoire, le cosinus moyen est proche de zéro B) Cependant, si les cellules migrent vers la cathode ou l'anode, la valeur du cosinus est proche de la moyenne + (cathode) ou -. (Anode) 1,0 C ) La directivité est présenté par la valeur du cosinus, qui est converti à partir des angles de migration (θ). Le cosinus (θ) est égal au rapport de la distance a (la distance de migration) à distance b (la distance projetée à la direction du champ électrique).

3. Sauvegardez les mesures. Importez les données à une application de base de données pour calculer les résultats combinés.
4. Exporter les données combinées de vitesse de migration moyen et la valeur moyenne du cosinus à une feuille de calcul pour tracer les graphiques à barres (figure 5).

Results

Deux lignes de cellules de la prostate (PRN-1-1 et PNT2) ont été étudiés avec cette méthode. Les cellules dans les deux lignes migrent à des vitesses similaires de 1,0 +/- 0,3 microns / min au cours de 2 heures (figure 5A). Cependant, la directivité du champ électrique est de 0,7 +/- 0,3-PRN pour la ligne 1-1, et 0,2 +/- 0,8 pour la ligne de PNT2 (figure 5B). Les résultats montrent une différence significative dans la galvanotaxie de ces deux lignées cellulaires (p <0,01, les cellule...

Discussion

L'analyse de la réponse d'une cellule de galvanotaxie a été un indicateur fonctionnel important pour un grand nombre de migration cellulaire ou la croissance des processus ^{27, 28.} Ici, nous utilisons une chambre sur mesure avec la surface de verre à film à deux lignées de cellules de la prostate. Ces lignées cellulaires ont démontré des degrés différents de galvanotaxie, et nous avons spéculé que la localisation intracellulaire ou l'activation des protéines de galvanotaxie-médiation pourraient int...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee, et al. (1994)
PNT2	prostate cells Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium  ;	Invitrogen	11875-093	préchauffage jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation
Sérum fœtal bovin - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10 % en PBS, chauffer jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation
Antibiotique-Antimycosique (100x)	Life Technologies	15240	ajouter 5 ml à 500 ml
2-propanol	moyen VWR	BDH1133-5GL
PBS-		-	137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO<>4 et 1,5 mM KH2PO4 dans 1 000 ml de H2 O, pH à 7,4 et autoclave, réchauffement à 37 ° ; C avant utilisation
0,25 % Trypsine-EDTA  ;	Invitrogen	25200-056	préchauffage jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation, traiter les cellules pendant 3 à 5 min à 37 ° ; C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		Chambres en PVC transparent et non toxiques (1/4 » x 2 ») conçues sur mesure. Veuillez contacter les auteurs pour les spécifications techniques.
Électrodes Galvanotaxis	UCD electric shop		Électrodes spiralées en platine avec cordons flexibles
Boîtier d’alimentation Galvanotaxis	Substrate Engineering, CA		Sortie d’alimentation DC conçue sur mesure avec voltmètre
Verre de protection de microscope, grand, 45 x 50 mm, n° 1.5	Fisher	12-544-F
Verre de protection de microscope, petit, 25 x 25 mm, n° 1	ThermoScientific	3307
Marqueur à pointe de diamant	ThermoScientific	750
Scelleuse silicone de qualité marine, transparent	3M	051135-08019
Graisse sous vide poussé	Dow Corning	2021846-0807
Seringue de 6 ml	Fisher Scientific	05-561-64
Seringue Nichiryo, 1,5 ml	Applicateurs en coton Nichiryo	SG-M
	Produits Médicaux Purtian	806-WC
Qtips	Johnson & Tube en PVC Johnson	729389
Nalgene 180	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2 % agar
solution Razor Blade	Personna	74-0001
Equipements et logiciels
Centrifugeuse de paillasse	Eppendorf	5810R	fonctionnant avec un rotor A-4-62
Cellomètre Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellomètre chambres de comptage	Nexcelom	CHT4-SD100-002	charge 20 μ ; l solutions cellulaires pour compter
la plaque de réchauffement de la température de culture	Bel-Art Scienceware	370150000	pour maintenir les chambres de galvanatoxie à 37 ° ; C  ;
Microscope Eclipse TE-2000 avec platine motorisée et chambre environnementale	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objectif len	Caméra
Retiga EX  ;	Qimaging		Caméra CCD refroidie, monocolore, 12 bits
Air comprimé avec 5 % de CO2	Airgas		commande spéciale
Volocity 6.3	PerkinElmer		Logiciel d’acquisition d’images
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Logiciel de suivi des cellules et personnalisé pour mesurer les angles de migration
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 pour Mac	Microsoft