Haut différenciation de l&#39;efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

Subarna Bhattacharya; Paul W. Burridge; Erin M. Kropp; Sandra L. Chuppa; Wai-Meng Kwok; Joseph C. Wu; Kenneth R. Boheler; Rebekah L. Gundry

doi:10.3791/52010

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Article de méthode

Haut différenciation de l'efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

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DOI :

10.3791/52010

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23 septembre 2014

Subarna Bhattacharya^*¹ , Paul W. Burridge^*² , Erin M. Kropp¹ , Sandra L. Chuppa¹ , Wai-Meng Kwok³ , Joseph C. Wu² , Kenneth R. Boheler⁴^,⁵ , Rebekah L. Gundry¹^,⁶

¹Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, ²Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, ³Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, ⁴Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, ⁵Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁶Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Résumé

Il ya un besoin urgent de développer des approches pour réparer le cœur endommagé, la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques qui n'ont pas d'effets toxiques sur le cœur, et l'amélioration des stratégies de modéliser avec précision les maladies cardiaques. Le potentiel de l'exploitation induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSC) la technologie de l'humain pour générer muscle cardiaque "dans un plat" pour ces applications continue de susciter un grand enthousiasme. Au cours des dernières années, la capacité de générer efficacement des cellules cardiomyogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) s'est grandement améliorée, nous offrant de nouvelles possibilités pour modéliser un stade très précoce du développement cardiaque humaine pas accessibles autrement. Contrairement à de nombreux procédés antérieurs, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas l'agrégation cellulaire ou l'addition d'activine A ou BMP4 et génère robuste des cultures de cellules qui sont hautement positives pour la troponine I cardiaque et T (TNNI3, TNNT2), iroquois- protéine à homéodomaine de classeIRX-4 (Irx4), la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme ventriculaire / du muscle cardiaque (MLC2v) et la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme auriculaire (MLC2a) par jour 10 dans l'ensemble cellule souches embryonnaires humaines (CSEh) et les lignes hiPSC testé pour jour. Les cellules peuvent être passées et entretenus pendant plus de 90 jours de culture. La stratégie est techniquement simple à mettre en oeuvre et économique. Caractérisation des cardiomyocytes dérivés de cellules pluripotentes comprennent souvent l'analyse de marqueurs de référence, à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines. Pour l'analyse des protéines, la cytométrie de flux est un puissant outil d'analyse pour l'évaluation de la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogène. Cependant, la variation technique dans la préparation de l'échantillon peut affecter considérablement la qualité de cytométrie de flux de données. Ainsi, la standardisation des protocoles de coloration devrait faciliter les comparaisons entre les différentes stratégies de différenciation. En conséquence, optimisé protocoles de coloration pour l'analyse de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, et TNNT2 par cytométrie de flux sont décrits.

Introduction

La génération de cardiomyocytes de hPSCs, y compris les CSEh et hiPSC, peut fonctionner comme un modèle in vitro de processus de développement cardiaques humaines très tôt, donnant un aperçu des étapes pas autrement accessibles pour des études mécanistiques. Ce système de modèle offre des opportunités uniques pour étudier les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'engagement de la lignée cardiaque et la spécification du destin cellulaire. Au cours des dernières années, la capacité à générer de manière efficace à partir de cellules cardiomyogéniques hPSCs a grandement amélioré ^1-15. Cependant, parmi les protocoles il existe une variation de l....