Article de méthode

Haut différenciation de l'efficacité de pluripotentes humaines des cellules souches à des cardiomyocytes et caractérisation par cytométrie en flux

DOI :

10.3791/52010

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23 septembre 2014

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1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'article décrit la méthodologie détaillée pour différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines dans les cardiomyocytes en modulant de manière sélective la voie Wnt, suivie d'une analyse par cytométrie en flux des marqueurs de référence pour évaluer l'homogénéité et l'identité de la population.

Résumé

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Il ya un besoin urgent de développer des approches pour réparer le cœur endommagé, la découverte de nouveaux médicaments thérapeutiques qui n'ont pas d'effets toxiques sur le cœur, et l'amélioration des stratégies de modéliser avec précision les maladies cardiaques. Le potentiel de l'exploitation induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSC) la technologie de l'humain pour générer muscle cardiaque "dans un plat" pour ces applications continue de susciter un grand enthousiasme. Au cours des dernières années, la capacité de générer efficacement des cellules cardiomyogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) s'est grandement améliorée, nous offrant de nouvelles possibilités pour modéliser un stade très précoce du développement cardiaque humaine pas accessibles autrement. Contrairement à de nombreux procédés antérieurs, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas l'agrégation cellulaire ou l'addition d'activine A ou BMP4 et génère robuste des cultures de cellules qui sont hautement positives pour la troponine I cardiaque et T (TNNI3, TNNT2), iroquois- protéine à homéodomaine de classeIRX-4 (Irx4), la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme ventriculaire / du muscle cardiaque (MLC2v) et la myosine réglementaire chaîne légère 2, isoforme auriculaire (MLC2a) par jour 10 dans l'ensemble cellule souches embryonnaires humaines (CSEh) et les lignes hiPSC testé pour jour. Les cellules peuvent être passées et entretenus pendant plus de 90 jours de culture. La stratégie est techniquement simple à mettre en oeuvre et économique. Caractérisation des cardiomyocytes dérivés de cellules pluripotentes comprennent souvent l'analyse de marqueurs de référence, à la fois au niveau de l'ARNm et des protéines. Pour l'analyse des protéines, la cytométrie de flux est un puissant outil d'analyse pour l'évaluation de la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogène. Cependant, la variation technique dans la préparation de l'échantillon peut affecter considérablement la qualité de cytométrie de flux de données. Ainsi, la standardisation des protocoles de coloration devrait faciliter les comparaisons entre les différentes stratégies de différenciation. En conséquence, optimisé protocoles de coloration pour l'analyse de Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, et TNNT2 par cytométrie de flux sont décrits.

Introduction

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La génération de cardiomyocytes de hPSCs, y compris les CSEh et hiPSC, peut fonctionner comme un modèle in vitro de processus de développement cardiaques humaines très tôt, donnant un aperçu des étapes pas autrement accessibles pour des études mécanistiques. Ce système de modèle offre des opportunités uniques pour étudier les mécanismes moléculaires qui contrôlent l'engagement de la lignée cardiaque et la spécification du destin cellulaire. Au cours des dernières années, la capacité à générer de manière efficace à partir de cellules cardiomyogéniques hPSCs a grandement amélioré 1-15. Cependant, parmi les protocoles il existe une variation de la ligne de cellule par rapport à l'efficacité dans la production de cellules et cardiomyogéniques synchronisation à laquelle les cellules expriment des marqueurs spécifiques de la chambre (par exemple, le ventricule et oreillettes). Idéalement, pour des applications futures de ce système modèle, les populations plus homogènes de cellules fonctionnellement définies sont souhaitées. Contrairement aux procédés précédents, le protocole de différenciation des cardiomyocytes décrit ici ne nécessite pas CEagrégation ll ou l'ajout d'activine A ou protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) et robuste génère cultures très positif pour TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v, et MLC2a par jour 10 cellules dans toutes les lignées de CSEh et hiPSC testés à ce jour. La stratégie est techniquement simple à mettre en œuvre, en particulier par rapport à des cultures tridimensionnelles, la culture de masse, ou des stratégies fondées corps embryoïdes 4-9, et a récemment été définie dans une étude qui décrit une petite molécule à une toxicité sélective pour hPSCs (Boheler et al. ) 65. Caractéristiques de ce protocole comprennent la différenciation des hPSCs en culture monocouche à l'aide d'une seule couche d'une matrice qualifié CSEh (Matrigel), milieux entièrement définis à l'aide de petites molécules pour moduler la signalisation Wnt (semblable, mais distinct de 1,2,7,13), et flux optimisé cytométrie méthodes de coloration pour l'évaluation de l'efficacité de la différenciation et de l'identité de la cellule. En résumé, les avantages de ce protocole par rapport aux rapports précédents comprennent son coût effectivEness, reproductibilité, et sa grande efficacité pour générer des cardiomyocytes entre plusieurs lignes HPSC, y compris les lignées de CSEh et hiPSC.

La cytométrie en flux est un outil d'analyse puissant pour évaluer la qualité des cellules en culture et la détermination de la sous-population homogénéité, et avec un design expérimental approprié, peut fournir des mesures quantitatives. Comme pour toutes les stratégies à base d'anticorps, l'interprétation exacte des résultats expérimentaux nécessite que les éléments de la conception de l'essai, y compris la concentration d'anticorps et de la fixation des conditions de perméabilisation (lorsque ciblant des antigènes intracellulaires) sont soigneusement testés pour chaque anticorps comme des conditions sous-optimales affectent de manière significative l'efficacité de l'anticorps la liaison, et par conséquent, l'interprétation des résultats. Il est important, si la quantification est nécessaire, les anticorps monoclonaux sont indispensables, comme les anticorps polyclonaux peuvent reconnaître des epitopes multiples et sont sujettes à des variations de lot à lot. Actuellement, une variété d'anticorps (polyclonal protocoles et monoclonaux) et de coloration ont été décrits pour l'évaluation de la différenciation in vitro, ce qui rend difficile la comparaison de l'efficacité des protocoles cardiomyogenesis parmi 1,2,9,11. Pour cette raison, les anticorps monoclonaux sont utilisés lorsqu'ils sont disponibles pour toutes les analyses de cytométrie en flux. À l'avenir, il est prévu que la normalisation de ces protocoles de coloration, en particulier en ce qui concerne la quantification, devrait permettre une meilleure comparaison entre les stratégies de différenciation.

Le choix des marqueurs et leurs anticorps correspondants, utilisé pour évaluer la pureté de in vitro cardiomyogenèse varie selon les rapports. TNNT2 a été considéré comme un indicateur de cellules engagées au sort cardiomyogénique et est couramment utilisée pour évaluer l'efficacité des protocoles de différenciation cardiaques. Cependant, TNNT2 est également exprimée dans le muscle squelettique au cours de poussin et le développement du jeune rat 16,17 et il est présent dans le muscle lisse humain 18 . Ainsi, TNNT2 n'est pas nécessairement un marqueur spécifique de cardiomyogenesis humain in vitro. MLC2v et MLC2a sont couramment utilisés comme marqueurs de la ventriculaires et auriculaires sous-types, respectivement. Cependant, les défis de s'appuyer sur MLC2v et MLC2a pour déterminer le sous-type cardiomyocytes dans le contexte de la différenciation in vitro proviennent du fait que ces produits de gènes peuvent pas se limiter à une chambre spécifique au cours du développement cardiaque, du tube de cœur par adulte. Dans la boucle rongeur coeur, MLC2a ARNm est prédominante dans la / zone des voies d'entrée de l'oreillette et MLC2v ARNm est prédominante dans les régions du tractus ventriculaire / évacuation. Au coeur en boucle, la co-expression de MLC2a et MLC2v ARNm sont observés dans le tractus d'entrée, canal atrio-ventriculaire, et la voie d'éjection 19,20. En trois jours après la naissance, MLC2v ARNm est limitée au ventricule et de 10 jours après la naissance, MLC2a est limité aux oreillettes du coeur de rat nouveau-né 19. Par conséquent, l'interprétationde données concernant l'efficacité cardiomyogenèse et l'identité de sous-type ne doivent pas seulement tenir compte de la présence et la quantité de niveaux de marqueurs de référence, mais doivent tenir compte du stade de développement (s) à laquelle les points dans le temps de la différenciation qui sont analysés correspondent. Cela est particulièrement important étant donné que la phase de maturation des cellules cardiomyogéniques générées par la différenciation in vitro de hPSCs ressemble le plus à ceux du développement embryonnaire / 21-25. Ainsi, en s'appuyant sur l'expression spatiale d'un marqueur au cœur postnatale peut ne pas être approprié pour l'évaluation des cellules HPSC dérivés, au moins dans certains cas.

Dans un effort pour faciliter l'élaboration de critères plus spécifiques pour définir l'identité des cardiomyocytes in vitro, TNNI3 est considérée comme un marqueur utile pour évaluer cardiomyogenèse in vitro comme il est limité au muscle cardiaque tout au long de l'embryogenèse chez les poussins et le poisson zèbre 15,20et est absent dans le muscle squelettique foetal humain 26. Alors que TNNI1 est présent dans le cœur du fœtus humain, TNNI3 est la seule isoforme TNNI présente dans le cœur adulte normal 27,28. En ce qui concerne l'identité du sous-type cardiomyocytes, Irx4 29-31 est un marqueur informatif des cellules avec un sort ventriculaire. Au niveau de la protéine, Irx4 a récemment été montré être limitée au ventricule du tube cardiaque linéaire à travers les étapes néonatale chez la souris 32. En conséquence, les protocoles de coloration optimisés pour l'analyse de TNNI3 Irx4 et par cytométrie de flux sont décrits. À notre connaissance, ceci est la première description d'une méthode efficace pour la coloration et l'analyse des niveaux de Irx4 dans les cardiomyocytes humains à base d'anticorps par cytométrie de flux.

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Protocole

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1 Solution et préparation des médias

  1. CSEh Matrice qualifié revêtement Stock Solution
    1. Lentement dégeler CSEh matrice qualifié (5 ml) sur la glace à 4 ° C pendant la nuit. Distribuer aliquotes dans des tubes à centrifuger pré-réfrigérés, 1,5 ml stérile et stocker immédiatement à -20 ° C.
      REMARQUE: Le volume de l'aliquote varie en fonction de beaucoup et se situe typiquement 270-350 pi. Le fabricant fournit des détails concernant le volume de la portion aliquote nécessaire pour obtenir une concentration de 1 x lors de la dilution dans 25 ml de la manière décrite dans l'étape 2.1.
  2. HPSC médias Solutions mères
    1. Utiliser de l'eau ultra-pure en tant que diluant, sauf indication contraire. Stériliser tous les composants à l'aide d'un filtre de 0,22 um. Rangez la suite que des solutions en vrac à 4 ° C: bicarbonate de sodium (75 mg / ml); de l'acide citrique (10 mM, pH = 3).
    2. Stériliser tous les composants à l'aide de filtre de seringue de 0,2 um et stocker chaque forme d'aliquotes à -20 ° C: Rho kinase (ROCK) inhibiteur Y-27632 (10mM dans du DPBS, 100 ul aliquote); L'acide L-ascorbique-2-phosphate (64 mg / ml, 500 ul aliquote); sélénite de sodium (70 pg / ml, 100 ul aliquote); la transferrine (50 mg / ml, 107 ul aliquote); le facteur de croissance fibroblastique 2 (FGF2, 200 ng / ul dans du DPBS, 250 ul aliquote); facteur de croissance transformant bêta 1 (TGFβ1, 100 ng / pl dans 10 mM froid acide citrique, 10 ul aliquote).
  3. Composition HPSC Media Solution E8
    1. Préparer médias utilisant des aliquotes préparé à l'étape 1.2: DMEM / F12 (avec de la L-glutamine et HEPES, 500 ml), du bicarbonate de sodium (3,62 ml; finale: 543 ug / ml), de l'acide L-ascorbique-2-phosphate (500 pi; finaux : 64 pg / ml), du sélénite de sodium (100 ul; finale: 140 ng / ml), transferrine (107 ul; final: 10,7 pg / ml), de l'insuline (1 ml; finale: 20 pg / ml), le FGF2 (250 ul; finale: 100 ng / ml), TGFβ1 (10 pi; finale: 2 ng / ml).
    2. Combinez tous les composants, stériliser de filtre et conserver à 4 ° C pendant 2 semaines.
  4. HPSC médias E8 avec inhibiteur de ROCK
    1. Ajouter inhibiteur de ROCK de 15 pi à 12 ml de E8 milieux préparés comme ci-dessus et bien mélanger. Assurez-vous que la concentration finale est de 10 uM après addition de cellules / médias à l'étape 3.7.
  5. Solutions mères de Wnt modulateurs
    1. Conserver les aliquotes suivantes à -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM dans le DMSO, 15 ul aliquotes). IWR 1-(4-(1,3,3a, 4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-méthano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinoléinyle-benzamide; 10 mM dans le DMSO, 6 pi aliquotes).
  6. Différenciation des médias
    1. Préparez le support de différenciation # 1 avec RPMI 1640 (avec L-glutamine) avec 2% de supplément d'insuline B27 moins.
    2. Préparez le support de différenciation # 2 avec RPMI 1640 (avec L-glutamine) avec 2% de B27 plus un supplément d'insuline et 2% de FBS.
  7. Solution de lavage cellule fou culture cellulaire
    1. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), sans calcium ou magnésium.
  8. Cellule de solution de lavage pour la cytométrie en flux
    1. Utiliser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS sans calcium ni magnésium) avec 1% de FBS. Stocker à 4 ° C.
  9. Solution cellule de maintenance pour cytométrie en flux
    1. Utiliser une solution saline équilibrée de Hank (HBSS; sans calcium ou magnésium) avec 5% de FBS. Stocker à 4 ° C.
  10. Solutions de fixation pour cytométrie en flux
    1. Utilisez tampon Cytofix comme solution de fixation pour les anticorps TNNI3 et Irx4.
    2. Utilisez paraformaldéhyde 4% dans du PBS 1X (faire frais) comme solution de fixation pour les anticorps TNNT2 et MLC2a.
    3. Utilisez 70% de méthanol / acétone à 30% comme solution de fixation pour l'anticorps MLC2v.
    4. Conservez toutes les solutions à 4 ° C.
  11. Solutions de perméabilisation pour cytométrie en flux
    1. Utilisez Phosflow Perm tampon III comme perméabilisation solution fou d'anticorps et TNNI3 Irx4. Conserver à température ambiante (25 ° C).
    2. Utilisation de 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1x comme solution de perméabilisation des anticorps TNNT2, MLC2v, et MLC2a. Stocker à 4 ° C.
  12. La solution de blocage
    1. Utilisation du sérum de chèvre à 10% dans du PBS 1x. Assurez frais et stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.

Plaque de revêtement 2

  1. Décongeler lentement 1 aliquote de matrice qualifié CSEh à 4 ° C pendant 30 min, ajouter 25 ml de frais DMEM / F12 et bien mélanger dans stérilisé culture tissulaire capot immédiatement avant le revêtement de plaques de 6 puits.
  2. Ajouter 1 ml par puits d'une plaque à 6 puits stérilisé sous hotte de culture de tissu (une partie aliquote de la matrice qualifiée hESC est suffisante pour revêtir de quatre plaques à 6 puits).
  3. Laisser matrice qualifié CSEh pour régler pendant 30 min à température ambiante sous le capot. Aspirer la matrice qualifié excès CSEh et ajouter 2 ml de E8 médias avec un inhibiteur de ROCK à chaque puits. Utilisez plaques immédiatement, ou si desired, magasin à 4 ° C immédiatement après l'étalement jusqu'à 1 semaine et équilibrer à température ambiante pendant 30 minutes avant de l'utiliser.

3. repiquage et l'entretien des indifférenciées hPSCs en monocouche Culture

  1. Maintenir hPSCs en culture monocouche dans des plaques 6 puits et effectuer toutes les étapes sous une hotte de culture de tissu stérile.
  2. Utilisez les lignes HPSC qui sont bien établies (> p20) et présentent une morphologie homogène sans la présence de cellules avec un neurale, la morphologie epithelial- ou fibroblaste. Assurez cellules prolifèrent robuste, et en moyenne, passage tous les trois jours à 75% de confluence quand ensemencées à 0,75 x 10 6 par puits.
  3. hPSCs Passage avec dissociation au niveau d'une seule cellule au moins 5 fois avant le début de la différenciation pour assurer l'efficacité de la différenciation maximale. Pour hPSCs de passage, les médias aspirer E8 et laver les cellules deux fois avec 4 ml de 1x DPBS (préchauffé à la température ambiante). Ajouter 1 ml de la détacher de la cellulement solution (pré-chauffée à la température ambiante) à chaque puits et laisser le puits au repos pendant 3-7 min, jusqu'à ce que les limites des cellules commencent à rafle.
  4. Utiliser une pipette en verre bouché avec du coton ampoule pour déloger les cellules et les transférer dans un tube conique de 15 ml contenant 1 ml de milieu DMEM / F12 (pour inactiver la solution de détachement cellulaire).
  5. Retirer 10 aliquote ul de solution de cellules et mélanger avec 10 pi de bleu trypan dans un tube à centrifuger. Compter les cellules (par exemple automatisé ou manuel) hémocytomètre en reste des cellules sont collectées par centrifugation à 130 g pendant 5 min à température ambiante. En utilisant ce protocole, attendre 70-80% de viabilité en utilisant un hématimètre automatisé et aller de l'avant, la base tous les numéros de cellulaires sur le nombre total de cellules.
  6. Aspirer le milieu et remettre en suspension le culot cellulaire dans du DMEM / F12 à une concentration finale de 0,75 x 10 6 cellules par 500 pi.
  7. Ajouter 500 ul de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 6 puits où chaque puits contains 2 ml médias E8 avec un inhibiteur de ROCK, préparé à l'étape 2.3. Laissant plaque sur le plan de travail, déplacez doucement dans des cellules d'avant en arrière et mouvement d'un côté à l'autre de se disperser uniformément dans le puits. Retour cellules dans l'incubateur à 5% de CO 2, 37 ° C.
  8. A partir de 24 heures après repiquage, remplacer le support quotidien à l'aide de 2 ml / puits E8 sans inhibiteur de ROCK. Optimiser la densité de semis atteindre 100% de confluence avant le début de la différenciation. Graine 0,75 x 10 6 cellules / puits quatre jours avant le début de la différenciation, mais optimiser pour chaque lignée cellulaire en tant que de besoin.

4. cardiomyocytes induction de hPSCs par modulation sélective de la voie Wnt Pathway

  1. Actualiser les médias (2 ml / puits) tous les jours pendant 0-7 jours, et tous les autres, jour après jour 8.
  2. Au jour 0, entamer le processus de différenciation en remplaçant E8 médias avec les médias de différenciation # 1. Ajouter 1,2 pi CHIR (6 pM finale) dans chaque puits. Répétez le jour 1.
  3. Les jours 2-3, remplacer par différen fraismédias négocia- ° 1.
  4. Au jour 4, remplacer par la différenciation frais le support n ° 1. Ajouter 1 pi IWR 1-(5 pM final) à chaque puits. Répétez le jour 5.
  5. Les jours 6-7, remplacer par la différenciation frais le support n ° 1.
  6. Au jour 8, remplacer par la différenciation frais le support n ° 2.
  7. Continuer à remplacer par les médias de différenciation # 2 tous les jours pendant le temps désiré de la culture.
  8. Si vous le souhaitez, les cardiomyocytes de passage à l'aide de la solution de détachement cellulaire suivant les étapes décrites dans 3,3-3,6, mais en remplaçant les médias avec les médias de différenciation # 2. Au cours des passages, dissocier les cardiomyocytes en petits groupes de cellules ~ 3-10. Semer à ~ 6 x 10 5 cellules par puits à l'aide de CSEh matrice qualifié puits revêtus et la différenciation des médias n ° 2.

5 Collection de cellules pour la cytométrie en flux

  1. Effectuer tous les autres aspects des étapes 5-9 sur le banc de laboratoire (c.-à-pas stérile).
  2. médias et de croissance Aspirer Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X.Ajouter 1 ml de la solution de détachement cellulaire (préchauffée à la température ambiante) à chaque puits et laisser reposer pendant 3-7 min, jusqu'à ce que les limites des cellules commencent à rafle. Utilisez un coton-branché verre borosilicate jetable 9 "pipette avec ampoule à déloger les cellules et transférer dans un tube de 15 ml conique sur la glace.
  3. Tout au long de reste de protocole, maintenir les cellules sur la glace et effectuer centrifugations à 200 g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Resuspendre les cellules dans 10 ml de solution de lavage de la cellule en utilisant une pipette sérologique de 10 ml avec trituration, afin de vérifier amas de cellules sont dispersées dans des cellules individuelles. Compter les cellules à l'étape 3.5 en tant que tout reste des cellules sont collectées par centrifugation.
  5. Resuspendre les cellules dans la solution de lavage des cellules en prenant soin de se désagrègent complètement culot cellulaire et une aliquote x 10 6 cellules par tube à fond rond. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration.

6 Fixation etPerméabilisation des cellules pour l'antigène intracellulaire coloration

  1. Ajouter la solution de fixation de 100 ul de culot cellulaire. Ajouter la solution goutte à goutte avec vortex douce et continue, puis mis sur la glace pendant 15 min.
  2. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration.
  3. Ajouter la solution de perméabilisation de 100 ul de culot cellulaire. Ajouter la solution goutte à goutte avec vortex douce et continue ensuite mis sur la glace pendant 30 min. Utilisation fixation et perméabilisation conditions décrites pour chaque anticorps dans le tableau 1.
  4. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Répétez l'opération pour un total de deux lavages après perméabilisation.
Anticorps primaire (Clone) Immunogène / épitope reconnu Contrôle Istotype Montant de l'anticorps primaire par 1 x 10 6 cellules dans 100 ul Fixation Solution Solution de perméabilisation Anticorps secondaire Montant de l'anticorps secondaire / 1 x 10 6 cellules dans 100 ul
Pour des mesures positives pour cent La quantification de l'antigène
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (humaine) Mouse IgG2b 1,0 pg 3,0 pg BD Cytofix BD Phosflow perm III De chèvre anti-souris IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Sur toute la longueur de la troponine humaine native de la protéine purifiée T. Mouse IgG1 1,0 pg 2,0 pg 4% de PFA1% dans du PBS 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1% IgG1 chèvre anti-souris - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG IgG2a de souris 2,0 pg 3,0 pg 70% de méthanol / acétone 30% 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1% Chèvre anti-IgG2a de souris - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) longueur protéine recombinante humaine de MYL7 humaine produite dans E. coli Mouse IgG1 0,5 pg 3,0 pg 4% de PFA à 1% dans du PBS 0,2% de Triton X-100 dans du PBS 1% IgG1 chèvre anti-souris - Alexa 488 600 ng
Irx4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG de lapin 0,5 pg 0,5 pg BD Cytofix BD Phosflow perm III Chèvre anti-rabbit IgG-PE 600 ng

Tableau 1 Anticorps concentrations. Vente sont l'anticorps primaire, clone (si monoclonaux), les concentrations optimisées et fixation et perméabilisation des conditions pour chaque anticorps primaire et secondaire utilisés pour l'écoulement des analyses de cytométrie. Comme les concentrations d'anticorps d'achat d'actions peuvent varier selon les fournisseurs du même clone, des concentrations finales de chaque anticorps par 1 x 10 6 cellules dans un volume d'essai fixe, plutôt que de dilutions, sont fournis. L'immunogène utilisé pour générer l'anticorps, ou épitope reconnu par l'anticorps, comme prévu par le fabricant, est répertorié mais n'a pas été vérifiée expérimentalement ici.

7. coloration des anticorps

  1. Pour chaque expérience, inclure un témoin non coloré par fixation / état de perméabilisation et le contrôle isotypique approprié pour chaque anticorps primaire utilisé. Inclure les types de cellules non-cardiomyocytes que les contrôles négatifs (par exemple, des cellules souches pluripotentes ou des fibroblastes). Utilisez les contrôles isotypiques à la même concentration que l'anticorps primaire correspondant (voir tableau 1).
  2. Resuspendre les cellules dans 100 pl de solution de blocage à l'aide d'une pipette P200 pour désagréger les cellules. Set échantillons sur la glace pendant 25 minutes sous agitation légère.
  3. Sans enlever la solution de blocage, ajouter anticorps primaire ou isotype contrôle conformément aux lignes directrices figurant dans le tableau 1. Incuber 45 min sur la glace avec doux balancement.
  4. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Répéter pour un total de deux lavages après le marquage de l'anticorps primaire.
  5. Si un anticorps primaire conjugué à un fluorophore est utilisé, passez à 8.1. Quand un anticorps primaire non conjugué est utilisé (comme pour tous les marqueurs décrits ici), effectuer le marquage avec l'anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore comme suit.
  6. Resuspendre les cellules dans 100 pi de solution de blocage à l'aide d'une pipette P200 à Disacellules ggregate.
  7. Ajouter anticorps secondaire conformément aux lignes directrices figurant dans le tableau 1. Incuber 30 min sur la glace avec doux balancement.
  8. Ajouter 3 ml de solution de lavage de la cellule. Recueillir les cellules par centrifugation et la solution d'aspiration. Répéter pour un total de deux lavages après marquage de l'anticorps secondaire.

8 Préparation des cellules pour la cytométrie de flux

  1. Resuspendre les cellules dans 400 ul solution de maintenance de la cellule à l'aide d'une pipette P1000 de désagréger les cellules.
  2. Préparer un capuchon de filtre de la cellule sur un tube à fond rond de pré-mouillage avec une solution d'entretien de la cellule de 50 pi. Réglez le tube sur la glace. Utilisez le bouchon du filtre cellulaire pour éviter des agrégats de cellules de boucher le cytomètre en flux.
  3. Transfert de solution de cellule à cellule de bouchon et permettre la suspension de cellules de s'écouler par gravité. Appuyez sur le bas du tube doucement sur paillasse que nécessaire afin que les cellules sont collectées dans le tube et en retrait sur la glace le plus rapidement possible. Crépine Rincer à l'entretien des cellules de 250 pi silution pour assurer la reprise maximale des cellules.
  4. Maintenir les cellules sur de la glace et de protéger de la lumière jusqu'à l'analyse par cytométrie en flux.

9 cytométrie en flux

Les paramètres détaillés d'acquisition varient entre instruments. Paramètres fondamentaux à prendre en compte pour la collecte optimale des données sont décrites ci-dessous.

  1. Pour la stabilité du flux optimal, assurez-vous que la taille de la buse dépasse 5-6x le diamètre de la cellule en cours d'analyse.
    NOTE: Cela peut varier entre les instruments, mais est un facteur important à la fois pour les analyseurs et sélection de la taille de la buse appropriée pour le tri cellulaire. Le diamètre moyen de 10 jours est de 11 cardiomyocytes um (de 8 à 14 um); Ainsi, un tube d'injection d'échantillon de 150 um standard sur un analyseur fonctionne bien.
  2. Immédiatement avant l'analyse des données, chaque tube vortex brièvement pour disperser les agrégats cellulaires.
  3. Optimiser l'avant et les réglages de tension de la dispersion latérale pour chaque type de cellule basés surtémoin non coloré pour chaque condition de fixation / perméabilisation utilisé dans l'expérience de telle sorte que les populations d'intérêt sont à l'échelle et centrées (figure 2A).
    1. Maintenir ces paramètres tout au long d'une seule expérience et être cohérent d'une expérience à sur le même instrument, comme des changements importants peuvent indiquer des problèmes potentiels avec le cytomètre de flux ou de la préparation de l'échantillon.
  4. Pour chaque fluorophore, analyser le contrôle isotypique et ajuster la tension de laser appropriée pour déterminer l'intensité minimale nécessaire à l'obtention d'un histogramme de fluorescence qui présente des bords gauche et droit de la pointe. Maintenir les réglages du laser pour chaque isotype contrôle lors de l'acquisition de données sur des échantillons d'anticorps teinté correspondant.
    REMARQUE: Signal dérive se produit souvent au fil du temps sur le même instrument. Il est essentiel d'ajuster les paramètres du laser au début de chaque essai sur la base du contrôle d'isotype approprié.
  5. Recueillir un minimum de10 000 événements. 50 000 événements sont préférés.
  6. Pour les analyses statistiques, la porte de la population de cellules vivantes d'exclure les débris (figure 2A). Déterminer pourcentage de cellules positives au sein de la population fermée basé sur le placement de marqueur qui permet ≤2% contribution de contrôle isotypique, comme le montre la figure 2B, C.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au jour 0, les cellules sont confluentes à 100% avec la morphologie compacte et les débris de cellules minimal. Le jour 2.1, il est courant d'observer la mort cellulaire significative (40-50%), mais les cellules attachées conservera morphologie compacte (figure 1A). Pendant ce temps, les médias est orange et trouble. Médias rose indique la mort cellulaire excessive, et dans ce cas, confirmer au bleu trypan et cesser si la mort de la cellule dépasse 70%. Les cellules seront guéris pendant les jours 3-4 e...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Critique pour la réussite du protocole de différenciation est l'utilisation de cultures de haute qualité de hPSCs qui ont été soumises à un passage à niveau de la cellule unique pendant au moins cinq passages avant le début de la différenciation. Différenciation efficacités similaires sont fréquemment observés chez les diverses lignes HPSC si elles sont confluentes à 100% au début de la différenciation indépendante de la lignée cellulaire. Efficacité sous-optimale est observée si la confluence des cellules au début ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par le NIH 4R00HL094708-03, MCW Affaires de recherche Nouveau Comité Faculty Award, et la fondation Kern (fonds de démarrage) au Medical College of Wisconsin (RLG); Conseil des subventions de recherche de base-Thème Hong Kong programme de recherche et T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, et AHA Créé bourse de chercheur (JCW); AHA postdoctorale 12POST12050254 (PTB). Nous remercions l'espoir Campbell à la cytométrie en flux de base de l'Institut de recherche de sang de Wisconsin pour l'aide à la collecte de données et un examen attentif du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cell Culture
BD Matrigel, matrice qualifiée hESCd’accutaseBD Biosciences
StemCell Technologies7920
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), sans calcium, sans magnésiumLife Technologies14190-136
Diméthyl sulfoxyde (DMSO, Hybri-Max, stérile-filtré)Sigma AldrichD2650
Bicarbonate de sodiumSigma Aldrich53817
Acide citriqueSigma AldrichC2404-100G
Y-27632 dichlorhydrate sélectif p160ROCK inhibiteurR& D Systems1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnésium sel hydrateSigma AldrichA8960-5G
Sélénite de sodiumSigma AldrichS5261-10G
Transferrine (Optiferrin &ndash ; Défini, sans animaux, recombinant humain)Invitria777TRF029
Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2)R& D Systems4144-TC-01M
Facteur de croissance transformant bêta 1 (TGF&beta ; 1)Peprotech100-21
DMEM/F12 avec L-Glutamine et 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
InsulineSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640 avec L-GlutamineLife Technologies11875-093
Supplément de B-27 moins d’insulineLife TechnologiesA1895601
Supplément de B-27 (avec insuline)Life Technologies17504-044
Sérum fœtal bovinLife Technologies10437
fort
de solution saline tamponnée au phosphate (10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Solution saline équilibrée de Hank sans Ca2+ et Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Phosflow tampon permanent IIIBD Biosciences558050
16 % ParaformaldéhydeThermo Scientific28906
MéthanolSigma Aldrich179957-4L
AcétoneMallenckrodt Chemicals  ;2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Sérum de chèvreLife Technologies16210-064
Solution de bleu de trypan, 0,4 %Life Technologies15250-061
Materials
5 ml Tube en polystyrène à fond rond (sans bouchon)Corning352008Pour la préparation de cellules pour cytométrie en flux
5 ml Tube en polystyrène à fond rond (avec 35 & micro ; Corning352235Pour la préparation des cellules pour la cytométrie en flux
2 ml Ampoules en caoutchoucFischer Scientific03-448-24
9" borosilicate verre débranché Pasteur pipettesBioExpressP-2904-2
0,65 ml Tubes à microcentrifuger, gradués, vertsGeneMateC-3259-G
1,5 ml Tubes à microcentrifuger, gradués, rougeGeneMateC-3260-R
TC20 compteur de cellules automatiséBioRad145-0102
Lames de comptage pour TC20BioRad145-0011
6 puits Plaque à fond plat traitée pour culture tissulaireCorning353046
20 ml SeringuesBD Plastipak300613Pour la stérilisation par filtre des aliquotes
Filtres stériles pour seringues, 0,2 & micro ; m polyéthersulfoneVWR28145-501Pour la stérilisation par filtre des aliquotes
250 ml Système de filtration, 0,22 & micro ; m polyéthersulfone, stérilisant, à faible liaisonCorning431096Pour la stérilisation par filtre de médias en vrac  ;
Système de filtration de 500 ml, 0,22 & micro ; m polyéthersulfone, stérilisant, à faible liaisonCorning431097Pour la stérilisation par filtre des médias
Anticorps et contrôles d’isotypes
Anti-TNNI3 (clone : 284 (19C7))Abcamab19615Anticorps primaire
Anti-TNNT2 (clone : 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Anticorps primaire
Anti-MYL2 (MLC2v, clone : 330G5)Systèmes synaptiques310111Anticorps primaire
anti-MYL7 (MLC2a, clone : 4E7)AbcamAB131661Anticorps primaire
anti-IRX4  ;   ;BiossBS-9464RAnticorps primaire
Alexa Fluor 488 Chèvre anti-souris IgG1  ;Life TechnologiesA21121Anticorps secondaire
Alexa Fluor 647 IgG2a anti-souris pour chèvreA21241Anticorps secondaire
Alexa Fluor 488 IgG2b pour chèvre LifeTechnologiesA21141Anticorps secondaire
Phycoérythrine(PE) IgG pour lapin R& D SystemsF0110Anticorps secondaire
Souris IgG1BD Biosciences557273Contrôle des isotypes
Souris IgG2aeBiosciences16-4724-81Contrôle des isotypes
Lapin IgG-PER& D SystemsIC105PIsotype Control
TaqMan Sondes pour qRT-PCR
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Life TechnologiesHs00158126
MESP1Life TechnologiesHs01001283
MYH11 (SMMHC)Life TechnologiesHs00224610
MYH6Life TechnologiesHs01101425
MYL2 (MLC2v)Life TechnologiesHs00166405
MYL7 (MLC2a)Life TechnologiesHs01085598
MYOGLife TechnologiesHs01072232
NKX2.5Life TechnologiesHs00231763
NPPALife TechnologiesHs01081097
POU5F1Life TechnologiesHs04260367
SOX17Life TechnologiesHS00751752
TNNI1Life TechnologiesHs00913333
TNNI2Life TechnologiesHs00268536
TNNI3Life TechnologiesHS00165957
TNNT2Life TechnologiesHs00165960
Solution de détachement de cellules 354277 en vrac

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293(2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657(2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979(2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784(2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474(2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037(2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

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Diff renciation des cardiomyocytesTroponine I cardiaqueMarqueur IRX4Marqueur MLC2vMarqueur MLC2aMarqueur TNNT2Culture de cellules souchesMarquage par anticorps

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