Essai simple pour la quantification de l'évitement social en Drosophila melanogaster

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier l’évitement des individus stressés. Ce paradigme est à la fois puissant et facile à utiliser et peut être utilisé pour évaluer l’influence des gènes et de l’environnement sur un type d’interaction sociale chez Drosophila melanogaster.

Résumé

Drosophila melanogaster est un modèle émergent pour étudier différents aspects des interactions sociales. Par exemple, les mouches évitent les zones précédemment occupées par des congénères stressés en raison d’un odorisant libéré pendant le stress connu sous le nom d’odorisant de stress de la drosophile (dSO). Grâce à l’utilisation de l’appareil T-maze, on peut quantifier l’évitement du dSO par les mouches répondeuses dans un test très abordable et robuste. Les conditions nécessaires à l’obtention d’une bonne performance sont présentées ici. Une expérience stressante est nécessaire pour que les mouches émettent du dSO, ainsi qu’un nombre suffisant de mouches émettrices pour provoquer une réponse d’évitement robuste à la présence de dSO. Le patrimoine génétique, mais pas la taille de leur groupe, a fortement modifié l’évitement du dSO par les mouches répondeuses. Les souches Canton-S et Elwood affichent une meilleure performance pour éviter le dSO que les souches Oregon et Samarcande. Ce test comportemental permettra d’identifier les mécanismes sous-jacents à ce comportement social et d’évaluer l’influence des gènes et des conditions environnementales sur l’émission et l’évitement du dSO. Un tel test peut être inclus dans des batteries de tests de diagnostic simples utilisés pour identifier les déficiences sociales des mutants ou les conditions environnementales d’intérêt.

Introduction

L'objectif de cette méthode est de quantifier facilement un nouvel aspect du comportement social simple dans Drosophila melanogaster, indépendant de la cour et de l'agression.

Les interactions sociales sont essentielles pour le bon développement et la santé des individus au sein d'une société, ainsi que la fonctionnalité d'un groupe social dans son ensemble. La grande complexité de ces interactions nécessite de grandes tailles d'échantillon et un système qui permet une simplification du comportement que les bases génétiques et neuronales du comportement social sont encore mal compris. Drosophila melanogaster est un modèle génétique puissant qui peut être utilisé pour identifier la génétique et bases neurales des interactions sociales. En effet, D. melanogaster a un répertoire de comportements sociaux complexes et des mesures directes de socialisation ont déjà été fait ^1-7. Cependant, la plupart de ces efforts ont été axés sur les comportements sociaux relativement complexes, comme agresinteractions sive ^3,6, divers aspects de la cour ^3,8-12, et comment l'expérience sociale affecte d'autres comportements tels que l'apprentissage, ou rythme circadien ^13-17. En outre, beaucoup de ces tests reposent sur l'analyse des modèles d'interaction complexes des groupes de mouches, par suivi vidéo et de logiciels pour analyser l'abondance résultant des données. Ces analyses sont inestimables, et ouvrent de nouvelles perspectives importantes telles que la dynamique des interactions mouche mouche dans les groupes ^7. Une limitation, cependant, est l'inaccessibilité de ces tests à la communauté en général, et de la connaissance limitée des mécanismes sous-jacents reconnaissance des autres. En d'autres termes, la base de l'émission d'un signal par un individu et sa reconnaissance par une autre est encore mal comprise ^18.

En revanche, vole également présenter un comportement simple, évitement social, où les individus se éloignent d'un signal émis par les mouches stressées: D. melanogaster stress odorante ou DSO ^19. Dans un dosage à haut débit, ce comportement peut être quantifiée comme l'évitement d'un signal de stress émis par d'autres mouches, ou évitement social ^19. Les mouches sont placées dans un appareil T-labyrinthe et ont le choix pour éviter un flacon contenant DSO. En utilisant ce dosage, CO ₂ se est révélée être une composante de l'ASM, et une partie du circuit neural nécessaire pour répondre à CO ₂ a été disséqué ^19.

L'essai d'évitement sociale présentée ici est conceptuellement similaire aux tests comportementaux simples développées dans le laboratoire de Seymour Benzer qui ont permis à des générations de chercheurs pour disséquer des comportements complexes ^20. Analyse des évitement social peut être réalisée en utilisant de manière rentable le test T-labyrinthe, permettant pour une étude plus généralisée du comportement social. Par exemple, l'utilisation de ce test nous avons récemment démontré que les risques génétiques différents pour l'autisme ont des effets contrastés b socialedosages ehavior. Mutants pour un gène candidat pour l'autisme - neurobeachin ^21,22 - les déficiences actuelles à la fois dans l'espace social (décrits ailleurs ²³⁾ et évitement social ^24. La signalisation dopaminergique anormale est également proposé de jouer un rôle dans l'étiologie de l'autisme chez les humains ^25,26. Contrairement aux résultats obtenus avec neurobeachin, nous avons trouvé que la performance d'évitement sociale était pas affectée par une augmentation ou une diminution du taux de la monoamine vésiculaire Drosophila Transporter (VMAT) dans des cellules dopaminergiques, bien que l'espace social est directement corrélée à ces niveaux de VMAT ^27. Les résultats contrastés obtenus avec neurobeachin et VMAT soulignent la possibilité d'identifier diverses formes de comportement asocial, et donc les différents circuiteries neuronaux sous-jacents moduler la réponse à d'autres.

Protocole

1. Matériel et réactifs créés interne (Voir liste des matières pour les autres)

1. Préparer un Drosophila appareils d'anesthésie froid pour effectuer des travaux à la mouche.
   1. Coupez une feuille de polyéthylène poreux pour couvrir une petite boîte en plastique (12,7 cm de long, 10,2 cm de large), typiquement le couvercle supérieur de la boîte de pointes de pipette (12,7 cm de long, 10,2 cm de large, 3,8 cm de profondeur).
   2. Remplissez la boîte avec de la glace pilée, couvrir avec la feuille de polyéthylène poreux.
2. Préparer un appareil T-labyrinthe; adapter l'appareil décrit précédemment en détail ^28-31.
3. Préparer un aspirateur à la mouche comme décrit ^32.
4. Préparer un appareil de réponse d'phototaxie vol pour déplacer dans et hors des flacons d'essai sans contrainte:
   1. Utilisation d'un appareil à contre-courant, comme décrit par ^29,33.

NOTE: Le labyrinthe en T peut également être utilisé à d'autres fins, tel que décrit par ^28.

5. Assurer homconditions d'éclairage ogeneous: effectuer l'expérience sur un banc recouvert d'une couverture de banc blanc, et en face d'un tableau blanc.
   NOTE: Pour ces expériences, les souches de mouches Drosophila melanogaster utilisés étaient les types sauvages: Canton-S, l'Oregon et Samarkand vole de nos stocks de laboratoire ^34; Elwood mouches ont été recueillies à l'automne 2011 dans le quartier Elwood de Huntington, à Long Island, New York, USA.

2. Préparer les mouches avant l'expérience

1-2 jours avant d'effectuer l'expérience:

1. Maintenir les mouches sur le milieu de semoule de maïs-agar-mélasse-levure norme à 25 ° C sur un cycle de 12 heures de lumière / obscurité.
2. Recueillir les répondeurs mouches sous anesthésie froides 1-2 jours avant d'effectuer l'expérience
   1. Transférer les mouches des bouteilles dans lesquelles ils ont été soulevés dans 50 ml tubes Falcon en utilisant un entonnoir.
   2. Placez le tube Falcon avec les mouches sous le niveau de la glace, dans unisolé seau à glace.
   3. Placez l'appareil d'anesthésie froid avec de la glace pilée à -4 ° C pour se détendre.
   4. Attendez 5 min pour les mouches d'entrer dans le coma de refroidissement.
   5. Transférer les mouches sur la feuille de polyethylene poreux de l'appareil d'anesthésie froid.
   6. Recueillir les répondeurs mouches sur l'appareil d'anesthésie froid. A RT, sous un stéréomicroscope, séparer vieille 3-7 jours mâle de mouches femelles et maintenir ces mouches dans des groupes de 40.
3. Recueillir vol d'émetteur 1-2 jours avant d'effectuer l'expérience.
   1. Recueillir doucement Canton-S mixité vole de leurs bouteilles, en utilisant un aspirateur à bouche, le contrôle de leur nombre.
   2. Maintenir ces mouches dans le groupe de 60 à 100, car ils seront les émetteurs.
   3. Préparer autant d'échantillons d'émetteurs comme points de données nécessaires.
4. Prévoyez au moins une nuit de récupération après la collecte des intervenants et des émetteurs, afin de minimiser tout effet de confusion de l'anesthésie froideet la collecte bouche d'aspiration sur le comportement.
5. Ouvrez le sac de flacons d'essai, pour permettre l'air en plastique odeur fade dans le sac pour être remplacé par de l'air frais, au moins un jour avant l'expérience.

2 h avant d'effectuer l'expérience:

6. Se assurer que la température dans la salle où l'expérience est réalisée est de l'ordre de 23 à 25 ° C, même avec la lumière et de l'humidité supérieure à 30%.
7. Transférez les intervenants et les mouches émetteurs de fruits dans des flacons de produits alimentaires frais pour se assurer que ces mouches ne sont pas affamés.
8. Laissez les mouches des fruits se adapter à l'environnement pendant 2 heures, sur le banc sur lequel l'expérience sera effectuée.

3. Effectuer l'expérience évitement social

1. Effectuez chaque expérience au même moment de la journée, dans une gamme de 3-4 heures dans l'après-midi entre le temps Zeitgeber ZT5 et ZT9.
2. Placez le labyrinthe en T sur le pavé de martèlement, et serrer la pince à vis de sorte til est ascenseur stable.
3. Transfert vol d'intervenants dans un flacon de test frais. Aligner cette fiole contenant vol d'intervenants sur la partie supérieure de la T-labyrinthe.
4. Inclinez l'appareil T-labyrinthe et appuyez sur le tapis battait si les mouches des fruits tombent dans l'ascenseur.
5. Déplacez la partie supérieure de l'ascenseur pour descendre de sorte que les mouches sont entre la partie supérieure et inférieure de la T-labyrinthe, mais attention à garder l'ascenseur au-dessus du point de choix - pour empêcher les mouches de se échapper.
6. Obtenir flacons avec DSO (voir la section 5 pour générer DSO sans flacons qui étaient auparavant occupés par les mouches).
   1. Alors que les vol d'intervenants se adaptent à ce nouvel environnement, placer vol d'émetteur dans un flacon de test.
   2. Placez un morceau de coton pour fermer le flacon de sorte que les mouches des fruits ne échappent pas.
   3. Mécaniquement agiter cette fiole sur un mini-tourbillon comme suit: vortex pendant 15 secondes, retirer la cuvette du vortex pendant 5 sec. Répétez trois fois pour un total de 55 sec.
   4. Remove vol d'émetteur du flacon frais - en transférant dans un flacon alimentaire - et rapidement placer cette fiole remplie DSO dans l'une des deux côtés de l'appareil T-labyrinthe.
   5. Alternez le côté de placement pour le flacon DSO pourvoir dans chaque nouvelle course.
7. Placer un flacon d'essai frais de l'autre côté du labyrinthe en T.
8. Apportez l'ascenseur complètement en bas, de sorte que les mouches des fruits peuvent choisir entre le flacon de test fraîche et le flacon de test avec DSO, et démarrer la minuterie.
9. Laissez les mouches choisir entre le flacon et le flacon frais DSO, pendant 1 min, à moins d'indication contraire.
10. Après 1 min, déplacer l'ascenseur jusqu'à séparer les mouches dans le flacon frais, DSO flacon, et ceux qui sont coincés dans l'ascenseur.
11. Comptez le nombre de mouches dans chaque flacon, et dans l'ascenseur.
12. Répétez cette opération pour chaque génotype / état.

4. Analyser les données évitement social

1. Comptez le nombre de mouches des fruits dans chaque flacon pour chaque genotype, et transférer les données vers un tableur.
2. L'utilisation d'un tableur, calculer l'indice de performance (PI) pour chaque génotype en soustrayant le nombre de mouches dans le flacon DSO à partir du nombre de mouches dans le flacon DSO-libre, puis en divisant par le nombre total de mouches.
3. Comparez les moyens de le PiS l'aide du logiciel d'analyse statistique pour l'analyse des résultats.
   1. Idéalement, préparer 2-3 répétitions internes pour chaque expérience, et trois répétitions indépendantes, effectuées à des jours différents, avec différents bouteilles ou traverse ^30.
   2. Utilisez la distribution des tests statistiques gaussiennes, que les données suivent une distribution normale.
   3. Lorsque l'essai d'un effet (ce est à dire, la densité - Figure 2), utiliser un ANOVA à une voie, avec post-test de comparaison multiple (colonne par colonne), ou un t-test simple de comparer chaque résultat à un contrôle.
   4. Lorsque expériences de groupe sont effectuées, tester les deux conditions et les sexes (les flacons vides, a souligné und mouches hors contrainte; et l'effet de genre - Figure 1), en utilisant une ANOVA à deux voies.

5. Générer flacons précédemment occupé par mouches atones - Effectuer Au lieu de 03.05 à 03.06

1. Utilisez phototaxie pour préparer flacons occupés par des mouches qui ne ont pas été sollicitées, comme témoin.
2. Transférez les mouches dans un flacon de test, et enclenchez dans l'appareil à contre-courant, avec des flacons frais vides dans la position opposée.
3. Poser l'appareil horizontalement avec le flacon distale directement en face d'une lumière blanche froide fluorescente 15 W, et couvrir d'un drap noir.
4. Laissez les mouches se déplacent doucement dans le flacon frais. Cela peut prendre plusieurs minutes. Une fois que la plupart des mouches marchent vers la lumière dans le flacon distale, démarrer le minuteur pendant 1 min.
5. Retirez délicatement le tissu noir, changer l'emplacement de la lumière, de récupérer avec le drap noir, et permettent vol de quitter le flacon de test.
6. A cette époque, initiate l'expérience de choix comme dans 3.2 à 3.5. Passer 3.6 et 3.7.
7. Déplacer le curseur de l'appareil, afin de séparer les mouches qui a quitté le flacon de test à partir de l'autre côté.
8. Utilisez le flacon de test libéré dans le labyrinthe en T tout de suite pour l'expérimentation des choix, comme dans 3.7.

Résultats

Le test d'évitement social est un test robuste quantifier la capacité de Drosophila melanogaster de reconnaître un signal de stress (DSO) émis par d'autres mouches, et d'évaluer ainsi un aspect des interactions sociales. Le test est effectué en utilisant un appareil couramment utilisé dans divers essais de comportement connus comme un labyrinthe en T, qui présentent les mouches avec un choix entre deux options différentes - gauche ou à droite ^19,28-31. Dans ce cas, l'efficacité avec laquelle les mouc...

Discussion

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour le test d'évitement social. Canton-S sera seulement d'éviter un flacon dans lequel vole ont déjà été sollicitées mécaniquement, et que le sexe et le nombre d'intervenants ne affecte pas que la performance d'évitement social. Cependant, fond génétique des intervenants a une influence majeure.

Voici plusieurs étapes critiques pour réaliser cette expérience avec succès: 1) transférer toujours les mouches 2 h avant l'expérience...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope stéréo à zoom  ;	Nikon·s ;   ;	SMZ-645	N’importe quel autre oscilloscope standard pour la manipulation des mouches fonctionnerait
Petits pinceaux  ;			pour repousser les mouches
Polyéthylène poreux, 12 » x 12 » Feuille	Flystuff - Genesee	46-100	http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 Feuille de plastique poreuse pour la boîte d’anesthésie froide
Mini-Alarm Minuterie/Chronomètre
Stylos
Ruban
Mini vortex	Fisher	14-955-151  ;	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail Pour l’agitation mécanique des mouches - n’importe quel vortex fonctionnerait.
Corning Life Sciences DL No. :352017, tube à essai Falcon ; à fond rond ; jetable ; sans fermeture, 14 ml ; 17 x 100 mm	Fisher	14-959-8   ;	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 Ceux-ci s’enclenchent en place dans le labyrinthe en T fabriqué en interne et l’appareil à contre-courant (voir texte)
des boules			de coton pour fermer les flacons après l’expérience.
Planche à trois volets et couverture			pour fournir un fond blanc et une lumière homogène.
			de banc blanc
Pad			n’importe quel tapis de souris fonctionne.
grand tissu			pour couvrir l’appareil à contre-courant en réponse à la phototaxie.
lumière blanche froide  ;	Home Depot	1000516563	http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 toute lumière linéaire similaire avec une ampoule fluorescente blanc froid à 13-15 W fonctionnerait